NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Đánh giá ảnh hưởng của loại enzyme đến hiệu suất trích ly, hàm lượng hoạt chất sinh học, khả năng chống oxy hóa của các loài rong biển. - Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ và thời gian sử dụng enzyme hỗ trợ trích ly đến hiệu suất trích ly, hàm lượng hoạt chất sinh học, khả năng chống oxy hóa của các loài rong biển. - Đánh giá khả năng ức chế enzyme a-glucosidase trong chiết xuất từ một số loài rong biển phổ biến tại Việt Nam.
2 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA LÊ NGUYỄN THANH NGÂN ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA VÀ ỨC CHẾ ENZYME A-GLUCOSIDASE TRONG DỊCH CHIẾT BẰNG ENZYME TỪ MỘT SỐ LOÀI TẢO NỘI ĐỊA Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ TP HỒ CHÍ MINH, tháng năm 2019 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Bách khoa, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Cán hướng dẫn khoa học: TS Đặng Quốc Tuấn (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Cán chấm nhận xét : (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị chữ ký) Luận văn thạc sĩ bảo vệ Trường Đại học Bách Khoa, Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh ngày tháng năm 2019 Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: (Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ) Xác nhận Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau luận văn sửa chữa (nếu có) CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ Họ tên học viên: Lê Nguyễn Thanh Ngân MSHV: 1570257 Ngày tháng năm sinh: 15/10/1989 Nơi sinh: Ninh Thuận Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 60420201 I TÊN ĐỀ TÀI: Đánh giá khả chống oxy hóa ức chế enzyme a- glucosidase dịch chiết enzyme từ số loài tảo nội địa NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG: - Đánh giá ảnh hưởng loại enzyme đến hiệu suất trích ly, hàm lượng hoạt chất sinh học, khả chống oxy hóa lồi rong biển - Đánh giá ảnh hưởng nồng độ thời gian sử dụng enzyme hỗ trợ trích ly đến hiệu suất trích ly, hàm lượng hoạt chất sinh học, khả chống oxy hóa lồi rong biển - Đánh giá khả ức chế enzyme a-glucosidase chiết xuất từ số loài rong biển phổ biến Việt Nam II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: HI NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: IV HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐẶNG QUỐC TUẤN Tp Hồ Chi Minh, ngày thảng năm 2019 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO TS Đặng Quốc Tuấn PGS TS Lê Thị Thủy Tiên TRƯỞNG KHOA LỜI CẢM ƠN Chân thành cảm ơn PGS TS Lê Thị Thủy Tiên - Chủ nhiệm môn Công nghệ Sinh học, PGS TS Nguyễn Thúy Hương Thầy Cô giảng viên môn Công nghệ Sinh học, Khoa Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách khoa - ĐHQG TP.HCM thời gian qua truyền đạt cho em kiến thức bổ ích Chân thành cảm ơn TS Đặng Quốc Tuấn hướng dẫn em trình thực đề tài tốt nghiệp Cảm trường ơn Ban tạo giám điều đốckiện Trung vềtâm thời Quan gian trắc chovà tơi tài hồn ngun thành mơi văn thạc sĩ TĨM TẮT Rong biển nguồn nguyên liệu có nhiều hợp chất sinh học Mục tiêu đề tài xây dựng phương pháp trích ly vật liệu rong biển có hỗ trợ enzyme, nhằm thu nhận sản phẩm có hoạt tính chống oxy hóa cao hoạt tính ức chế enzyme aglucosidase Có lồi rong biển phổ biến Việt Nam rong nho, rong sụn (K alvarezii) rong mơ (Sargassum sp.) khảo sát trích ly nước nóng hỗ trợ enzyme thủy phân Bốn loại enzyme hỗ trợ ly trích bao gồm loại carbohydrase (Termamyl, Viscozyme L) loại protease (Flavourzyme, Alcalase) Kết cho thấy rong nho (C lentillife ra) cho hiệu suất trích ly cao với hỗ trợ Alcalase (59,93%), Viscozyme L phù hợp với rong sụn (K alvarezii) cho hiệu suất trích ly cao (39,83%), rong mơ (Sargassum sp.) cho hiệu suất trích ly cao với hỗ trợ Alcalase (27.31%) Tất mẫu dịch chiết enzyme tăng hiệu suất trích ly khác biệt so với điều kiện trích ly khơng có enzyme Sản phẩm chiết xuất từ rong mơ (Sargassum sp.) với Viscozyme có hàm lượng polyphenol tổng khả chống oxy hóa cao (tương ứng 12,48 mgGAE/g rong biển khô 52,07% khả khử gốc tự DPPH); rong nho (C lentillifera) với Alcalase (3,37 mgGAE/g rong biển khô, 31,70% khả khử gốc tự DPPH) rong sụn (K alvarezii) với Flavourzyme (0,98 mgGAE/g rong biển khô, 25,53% khả khử gốc tự DPPH) Cuối cùng, enzyme lựa chọn phù hợp cho trích ly rong mơ, nho rong rong sụn Viscozyme L, Alcalase Flavourzyme Các điều kiện trích ly phù hợp nồng độ enzyme thời gian trích ly chọn Trên rong mơ Sargassum sp (7% Viscozyme, 2411) cho chất chiết xuất có khả ức chế aglucosidase IC50 = 0,10 mg/ml); rong nho c lentillifera (7% Alcalase, 24h) cho khả ức chế a- glucosidase IC50 = 9,00 mg/ml rong sụn K alvarezii (7% Flavourzyme, 1211) cho khả ức chế a- glucosidase IC50 = 10,48 mg/ml ABSTRACT Seaweeds are an excellent source of bioactive compounds to various industrial fields The objective of this study was to determine the method of enzyme-assisted extraction on seaweed material for obtain the extract containning high antioxidant and aglucosidase inhibitory activities There are three common seaweed species in Vietnam: Caulerpa lentillifera, K alvarezii and Sargassum sp was extracted by hot water and by enzyme-assistant method Four type of enzymes, consist of two types of carbohydrase (Termamyl, Viscozyme L) and two types of protease (Flavourzyme, Alcalase) were used for seaweed extraction The results reported that c lentillifera had the highest extraction yield for Alcalase (59,93%), K alvarezii recorded the highest extraction yield for for Viscozyme L (39,83%) and Alcalase for Sargassum sp (27.31%) All samples extracted by different enzyme expressed a significant increase in the extraction yield compared to the enzyme-free extraction conditions Product extracted from Sargassum sp for Viscozyme had the highest polyphenol content and antioxidant activity (12,48 mgGAE/g dried seaweed and 52,07% DPPH radical scavenging activity); Caulerpa lentillifera for Alcalase (3,37 mgGAE/g dried seaweed, 31,70% DPPH radical scavenging activity) and Kappaphycus alvarezii for Flavourzyme (0,98 mgGAE/g dried seaweed, 25,53% DPPH radical scavenging activity) Finally, the suitable enzymes for Sargassum sp., Caulerpa lentillifer a and Kappaphycus alvarezil extract were Viscozyme L, Alcalase and Flavourzyme, respectively Appropriate extraction conditions such as enzyme concentration and extraction time were selected Sargassum sp (7% Viscozyme, 24h) expressed aglucosidase inhibitor activity at IC50 = 0,10 mg/ml while Caulerpa lentillifera Alcalase, 2411) at IC50 = 9,00 mg/ml and Kappaphycus alvarezii Flavourzyme, 1211) at IC50 = 10,48 mg/ml Key words: Seaweeds, enzyme-assisted extraction, Sargassum sp., Caulerpa lentillifera, Kappaphycus alvarezii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi thực hướng dẫn khoa học TS Đặng Quốc Tuấn Các số liệu, bảng biểu, hình ảnh kết nghiên cứu nhóm thực đề tài Tác giả V MỤC LỤC 1.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme thời gian trích ly đến hiệu suất, hàm lượng DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT DNA Deoxyribonucleic acid GAE TCA Gallic acid equivalent Trichloroacetic acid TPC Polyphenol tong DPPH 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl ROS Reactive Oxygen Species RNS Reactive Nitrogen Species P-NP-G p-nitrophenyl-a-Dglucopyr anosid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 4.1 Ảnh hưởng loại enzyme hỗ trợ trích ly đến hiệu suất thu dịch chiết (%) .38 Bảng 4.2 Hàm lượng pholyphenol tổng (mg GAE/g nguyên liệu khô) từ dịch chiết thu nhận qua q trình trích ly sử dụng enzyme hỗ trợ khác 39 cáo giúp cải thiện suất trích ly rong biển kết nghiên cứu chứng thực điều Với đại diện khảo sát nghiên cứu hiệu suất trích ly tìm thấy cao rong lục (rong nho) rong đỏ (rong sụn) cuối rong nâu (rong mơ) có hiệu suất trích ly 59,93%; 39,83% 27,31% Điều tìm thấy tương đồng với nghiên cứu Rodrigues cộng năm 2015, khảo sát hiệu suất trích ly đại diện loại rong lục, rong đỏ rong nâu thu thập Vịnh Buarcos, Bồ Đào Nha Bảng 4.1 Ảnh hưởng loại enzyme hỗ trợ trích ly đến hiệu suất thu dịch chiết (%) Nước Alcalase Flavourzyme Viscozyme L Termamyl Rong mơ 18,47+ 0,21a 27,31 ±0,67d 24,92 +0,39c 25,22+ 0,41c 21,52 ±0,52b Rong nho 42,48+ l,22a 59,93 + l,04d 47,74±l,35b 58,64 + l,06cd 55,99+ l,06c Rong sụn 26,15+ 0,58a 31,90+0,91b 31,90+1,13 b 39,83+ 0,39d 35,82+0,73c * Dữ lỉệu bảng biêu thị băng giá trị trung bình ba lân lặp thí nghiệm ± độ lệch chuẩn (mean ± SD, n=3).Chữ bảng hàng khác có ỷ nghĩa thống kêp < 0,05 (one way anova) Rong nho cho hiệu suất trích ly cao với hỗ trợ trích ly chế phẩm enzyme Alcalase (59,93%) Viscozyme L (58,64%), dịch chiết trích ly với chế phẩm enzyme Termamyl (55,99%) Flavourzyme (47,74% ) Dịch chiết nước nóng cho hiệu suất thấp nhất, đạt hiệu suất 42,48% Chế phẩm enzyme Viscozyme L cho hiệu suất trích ly cao rong sụn với 39,83%, Termamyl đứng thứ hai (35,82%) Mẩu dịch chiết với chế phẩm enzyme Alcalase Flavourzyme cho hiệu suất trích ly thấp khơng có khác biệt đáng kể (32,49 - 32,98%, p > 0.05) Như vậy, thấy nhóm enzyme protease khơng cho hiệu suất trích ly cao nhóm carbohydrase hỗ trợ trích ly đối tượng rong Nước nóng cho hiệu suất trích ly thấp (26,15%) Rong mơ cho hiệu suất trích ly cao với hỗ trợ chế phẩm enzyme Alcalase (27.31%), trích ly với nước đạt hiệu suất thấp (18.47%) Các chế phẩm enzyme khác thể hiệu trích ly khác nhau, cụ thể: Viscozyme L Flavourzyme cho hiệu suất trích ly cao thứ hai với 24,92 -25,22% (p>0.05), Termamyl với 21.52+0.58% 4.1.2 Kết ảnh hưởng loại enzyme hỗ trợ trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng (TPC) dịch chiết thu nhận Ket nghiên cứu ảnh hưởng loại enzyme hỗ trợ trích ly đến hàm lượng polyphenol tổng thể Bảng 4.2 Kết đánh giá hàm lượng TPC đại diện rong biển cho thấy, TPC cao rong mơ (thuộc rong nâu) 7,90 - 12,48 mg GAE/g nguyên liệu khô; rong nho (thuộc rong lục) với 1,13 - 3,37 mg GAE/g nguyên liệu khô cuối rong sụn (thuộc rong đỏ) đạt 0,66 - 0,98 mg GAE/g nguyên liệu khô Kết gần với kết nghiên cứu đuợc công bố Chew cộng sụ năm 2008, tìm thấy hàm luợng TPC rong sụn 1,15 mg GAE/g nguyên liệu khô Trong Ganesan (2008) Sullivan (2011) báo cáo hàm luợng TPC rong sụn cao hơn, với 1,5 mg GAE/g nguyên liệu khô Hàm luợng TPC rong mơ nghiên cứu cao rong mơ (6,1-10 mg GAE/g nguyên liệu khô) đuợc công bố Sanchez-Camargo (2015) Hàm luợng TPC rong nho cao so với nghiên cứu Nguyen cộng sụ (2011) Nghiên cứu họ báo cáo hàm luợng TPC 1,30 mg GAE/g rong khô sấy nhiệt 2,04 mg GAE/g rong khơ sấy lạnh trích ly bang ethanol rong nho nuôi Đài Loan Theo nhà nghiên cứu, hàm luợng hoạt chất sinh học thay đổi đáng kể tùy thuộc vào sụ đa dạng rong biển Ngoài phuơng pháp trích ly hỗ trợ enzyme đuợc nhiều nhà nghiên cứu chứng minh giúp tăng hiệu trích ly TPC rong biển so với phuơng pháp trích ly cổ điển Bảng 4.2 Hàm lượng pholyphenol tổng (mg GAE/g nguyên liệu khô) từ dịch chiết thu nhận từ q trình trích ly sử dụng enzyme hỗ trợ khác Nước Alcalase Flavourzyme Viscozyme L Termamyl Rong mo' 7,90±0,17a 11,72 ±0,27c 9,49±0,10b 12,48 + 0,28d 9,23±0,19b Rong nho 1,13 ±0,0a 3,37 ± 0,05d 3,03 +0,1 lbc 3,18±0,03c 2,89 + 0,04b Rong sụn 0,79 ± 0,01b 0,81 ±0,01b 0,98 ±0,03d 0,89 + 0,03c 0,66 + 0,01a * Dữ liệu bảng biểu thị giả trị trung bình ba lần lặp thí nghiêm + độ lệch chuan (mean ± SD, n=3) Chữ bảng hàng khác có ỷ nghĩa thống kêp < 0,05 (one way anova) Kết TPC dịch chiết rong mơ cao với chế phẩm enzyme Viscozyme L (12,48 mg GAE/g nguyên liệu khô), với Alcalase (11,72 mg GAE/g nguyên liệu khô), TPC thấp tuơng đồng tìm dịch chiết với Flavourzyme Termamyl (9,49 9,23 mg GAE/g nguyên liệu khô; p>0.05) Rong sụn cho kết TPC dịch chiết cao với chế phẩm enzyme Flavourzyme (0,98 mg GAE/g nguyên liệu khô), Viscozyme L (0,89 mg GAE/g nguyên liệu khô); nước chế phẩm enzyme Alcalase cho hiệu trích ly TPC không khác biệt (0,79 0,81 mg GAE/g nguyên liệu khô; p>0.05) Đáng ý, chế phẩm enzyme Termamyl cho hiệu suất trích ly cao nước kết hàm lượng TPC lại thấp (0,66 mg GAE/g ngun liệu khơ) trích ly với nước Đối với rong nho chế phẩm enzyme Alcalase lại cho hàm lượng TPC dịch trích ly cao (3,37 mg GAE/g nguyên liệu khô) so với loại enzyme khác khảo sát, hàm lượng TPC dịch chiết trích ly với chế phẩm enzyme Viscozyme, Flavourzyme Termamyl 3,18; 3,03; 2,89 mg GAE/g ngun liệu khơ Mẩu dịch chiết trích ly nước nóng cho hàm lượng TPC thấp (1,13 mg GAE/g nguyên liệu khô) 4.3.3 Kết ảnh hưởng loại enzyme hỗ trợ trích ỉy đến hoạt lực chống oxy hóa dịch chiết thu nhận Sử dụng phương pháp thử nghiệm chất chống oxy hóa thơng qua khả khử gốc tự DPPH Khả chống oxy hóa dịch chiết lớn % DPPH lại thấp ECso giá trị nồng độ dịch chiết rong biển mà % DPPH lại % khả chống oxy đạt cân 50% Giá trị ECso thấp khả chống oxy hóa dịch chiết cao Kết thử nghiệm dịch chiết rong biển cho thấy giá trị ECso không xác định cho dịch chiết rong biển khoảng nồng độ < mg/ml, riêng dịch chiết rong mơ với chế phẩm enzyme Viscozyme L cho giá trị chống oxy hóa đủ mạnh để quét 50% gốc DPPH khoảng nồng độ khảo sát Do đó, hiệu hỗ trợ trích ly enzyme thí nghiệm so sánh dựa kết khả chống oxy hóa dịch chiết rong biển mức nồng độ mg/ml Khả chống oxy hóa loại dịch chiết rong biển thấp nhiều so với đối chứng có khả chống oxy hóa cao LAscorbic acid Cùng với việc riêng dịch chiết rong mơ đủ mạnh để quét 50% gốc DPPH cho thấy khả chống oxy hóa mạnh mẽ rong mơ so với rong nho rong sụn (Hình 4.1) Kết tuơng đồng với nhiều nghiên cứu truớc (Rodrigues, 2015; Cox, 2012) đánh giá khả chống oxy hóa rong nâu, thuờng cao so với rong đỏ rong lục Khả chống oxy hóa Nồng độ mẫu (mg/ml) 0.5 Bl I »3 «4 Kết khả chống oxy hóa dịch chiết (%) tính dựa mối quan hệ với % DPPH lại: Khả chống oxy hóa dịch chiết (%) = 100% - %DPPH lại Hình 4.1 Ảnh hưởng loại enzyme đến khả chống oxy hóa dịch chiết rong biển Các loại enzyme khác cho thấy hiệu tác động khác đến khả chống oxy hóa dịch chiết đối tuợng rong biển (Hình 4.1), cụ thể: Trong lồi rong khảo sát, rong mơ với sụ hỗ trợ chế phẩm enzyme Viscozyme L cho thấy khả chống oxy hóa cao (trên 50%) từ xác định giá trị EC50 = 4,58 ± 0,20 mg/ml Tất mẫu dịch chiết rong nho rong sụn cho kết khả chống oxy hóa nhỏ 50%, cụ thể rong nho cho khả chống oxy hóa cao với hỗ trợ chế phẩm enzyme Alcalase 31,70% rong sụn 25,53% với hỗ trợ chế phẩm enzyme Flavourzyme Do khác phương pháp trích ly, phương pháp đơn vị đo lường khả chống oxy hóa thông qua khả khử gốc tự DPPH sử dụng nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa rong biển báo cáo tài liệu nên khó để so sánh trực tiếp kết nghiên cứu hoạt động quét gốc chiết xuất rong biển với nghiên cứu khác Tuy nhiên, so sánh kết với nghiên cứu O’Sullivan (2011) sử dụng phương pháp đo khả chống oxy hóa thơng qua khả khử gốc tự DPPH nghiên cứu cho kết cao Theo nghiên cứu O’Sullivan, hoạt động khử gốc tự DPPH quan sát thấy chiết xuất rong biển nồng độ mg/ml giá trị IC50 không xác định cho tất chiết xuất rong biển khơng có đủ mạnh để quét 50% gốc DPPH Trong loài rong nâu nghiên cứu O’Sullivan, có loài rong quan sát thấy khả khử DPPH nồng độ 5mg/ml (F vesỉculosus 31,2% Á nodosum 25,6%) Theo nhiều nghiên cứu, hàm lượng polyphenol tổng đóng góp đáng kể vào khả chống oxy hóa Các nghiên cứu Lu F00 (2000), Siriwardhana cộng (2003) báo cáo mối tương quan cao khả khử gốc tự DPPH hàm lượng polyphenol tổng dịch chiết xuất Trong nghiên cứu này, mối quan hệ thể cao, nhiên tất mẫu dịch chiết Một số dịch chiết cho hàm lượng TPC cao khả chống oxy hóa thấp ngược lại, cụ thể như: Trên đối tượng rong mơ dịch chiết với chế phẩm enzyme Flavourzyme Alcalase cho giá trị TPC (11,72 9,49 mg GAE/g nguyên liệu khô) cao với Termamyl (9,23 mg GAE/g nguyên liệu khô) khả chống oxy hóa lại thấp Dịch chiết rong sụn với chế phẩm enzyme Temamyl cho giá trị TPC thấp nước cho khả chống oxy hóa tương đồng Dựa vào kết hàm mục tiêu thống kê Bảng 4.1, Bảng 4.2 Hình 4.1 với mục tiêu thu dịch trích ly có hoạt tính sinh học khả chống oxy hóa cao loại enzyme thích hợp lựa chọn tương ứng cho loại rong biển sau: - Rong mơ với hỗ trợ chế phẩm enzyme Viscozyme L (cho hàm lượng TPC khả chống oxy hóa cao nhất, hiệu suất trích ly cao thứ 2) - Rong nho với hỗ trợ chế phẩm enzyme Alcalase (cho hàm lượng TPC khả chống oxy hóa hiệu suất trích ly cao nhất) - Rong sụn với hỗ trợ chế phẩm enzyme Flavourzyme (cho hàm lượng TPC khả chống oxy hóa cao nhất, hiệu suất trích ly cao thứ 3) Kết chọn lọc loại enzyme hỗ trợ trích ly cho thấy nhóm enzyme protease cho hiệu trích ly TPC hoạt lực chống oxy hóa cao rong đỏ rong lục nhóm carbohydrase cho hiệu hoạt tính sinh học cao rong nâu 4.2 Ảnh hưởng nồng độ enzyme thời gian trích ly đến hiệu suất, hàm lượng polyphenol tổng khả nâng chống oxy hóa dịch chiết rong biển Sau lựa chọn loại enzyme phù hợp, nồng độ enzyme hỗ trợ thời gian trích ly hai số thông số quan họng ảnh hưởng lớn đến q trình trích ly chất có hoạt tính sinh học Việc tăng, giảm nồng độ enzyme thời gian trích ly (thời gian ủ với enzyme) ảnh hưởng đến đến q trình trích ly chất có hoạt tính sinh học việc tăng nồng độ enzyme liệu giúp rút ngắn thời gian thủy phân enzyme chất 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ enzyme thời gian trích ly đến hiệu suất trích ty dịch chiết Kết Bảng 4.3 thể suất trích ly theo thay đổi nồng độ enzyme thời gian trích ly Bảng 4.3 Ảnh hưởng nồng độ thời gian sử dụng enzyme đến hiệu suất trích ly dịch chiết Thời gian 12h 24h Nồng độ enzyme 3% 5% 7% 3% 5% 7% 16,95+0,32“ 19,13±0,12b 21,24+0,21 22,68+0,3 ld 25,22+0,41 27,01±0,32f ® ® Rong nho 48,59+1,33“ 56,ll±l,78b 59,88+1,37 50,43+1,28“ 59,93+1,04 63,62±0,87d ® ® Rong sụn 36,42+0,36“ 38,75±0,45b 41,07+0,51 37,31+0,27“ 39,69±0,72b 41,47+0,61 ® ® * Chữ bảng hàng khác có ỷ nghĩa thông kê p