CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3 TH Ử NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG CÁC DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ NGƯỜI
Tại khoa Dược lý- Sinh hóa (Viện dược liệu), 5 chất do chúng tôi tổng hợp đã được thử hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư người theo phương pháp sử dụng thuốc nhuộm MTT Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Exell [32]. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5.
Cách tiến hành:
- Nuôi cấy tế bào: Các dòng tế bào được lưu giữ trong nitơ lỏng, đánh thức và duy trì trong môi trường DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) có bổ sung huyết thanh bê tươi 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/L và streptomycin 50 mg/L). Tế bào được nuôi cấy cho phát triển tới mức khoảng 70%, thay môi trường sạch, tế bào này được dùng làm thí nghiệm.
- Mẫu thí nghiệm: Hòa mẫu thí nghiệm vào dung dịch DMSO 100% sao cho nồng độ gốc của các mẫu là 2 mg/ml. Tiếp theo pha thuốc nghiên cứu thành thang nồng độ gồm 5 nồng độ 100, 50, 25, 12.5, và 6.25 μg/ml. Nồng độ của thuốc thử được dùng theo tiêu chuẩn sàng lọc thuốc chống ung thư có nguồn gốc dược liệu của tác giả Teicher 1997 [10]. Ellepticine được sử dụng làm chứng dương, với nồng độ thử lần lượt là 50; 25; 12,5; 5,25; và 3,125 μM. Dung dịch DMSO 0,1% được sử dụng làm chứng âm.
- Quy trình nuôi cấy:
1. Cho khoảng 2X104tế bào/ml môi trường nuôi cấy (đối với các dòng tế bào MCF-7, Hep-G2, A549) và 4X104 tế bào/ml môi trường nuôi cấy (đối với dòng tế bào HTC116). Để 2 giếng trống làm chứng trắng (blank control).
2. Các tế bào được nuôi trong môi trường ở 37oC và 5% CO2 cho phép tế bào gắn vào đáy mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Giữ tế bào trong 24 giờ để tế bào ổn định.
3. Sau 24 giờ nuôi cấy, thêm 20 μl thuốc thử và thuốc chuẩn ở các nồng độ khác nhau vào mỗi giếng. Mỗi nồng độ được lặp lại ở 2 giếng. Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy để thuốc được tan hoàn toàn trong môi trường.
4. Ủ đĩa nuôi cấy từ 48 giờ (37oC, 5% CO2)cho phép thuốc phát huy tác dụng. Quan sát tế bào hàng ngày bằng kính hiển vi.
5. Chuẩn bị dung dịch MTT nồng độ 5mg/ml.
6. Thêm 20 μl dung dịch MTT vào mỗi giếng của đĩa nuôi cấy. Lắc nhẹ cho MTT khuếch tán đều trong môi trường nuôi cấy.
7. Ủ 37oC trong 3 giờ để MTT được chuyển hóa.
8. Loại bỏ môi trường trong các giếng của đĩa nuôi cấy.
9. Hoàn trả formazan (sản phẩm chuyển hóa MTT) bằng 100 μl DMSO. Lắc kỹ để formazan có thể tan hoàn toàn.
10. Đọc mật độ quang ở bước sóng 540 nm. Mật độ quang sẽ phản ánh số lượng tế bào sống sót.
- % tế bào sống sau khi đã xử lý thuốc so với chứng trắng được tính theo công thức như sau:
% tế bào sống = [OD540 của tế bào được xử lý] / [OD540 của tế bào không được xử lý thuốc] x 100%.
- Cách tính giá trị IC50: Giá trị IC50 được tính bằng phân tích hồi quy không tuyến tính của đường cong đáp ứng liều tương ứng, sử dụng phần mềm Exell.
Tế bào: gồm 4 dòng tế bào:
- Dòng tế bào MCF-7 (tế bào ung thư vú).
- Dòng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thư gan).
- Dòng tế bào A549 (tế bào cung thư phổi).
- Dòng tế bào HTC116 (tế bào ung thư đại tràng).
Hóa chất:
- MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide) của hãng in vitrogen.
- Adriamycin của hãng Sigma.
- DMSO của hãng sigma.
- Và các hóa chất khác.
Máy móc thiết bị: máy đọc ELISA của hãng Thermo Labsystems, kính hiển vi soi ngược, và các máy móc khác.
Chất chuẩn dương tính: Adriamycin được sử dụng làm chứng dương.
Bảng 3.1: Kết quả tổng hợp các chất
STT
Kí hiệu chất
M (đ.v.C)
Thời gian phản ứng
(giờ)
Dung môi kết tinh lại
Thực nghiệm Nhiệt độ nóng
chảy (0C) Hiệu suất (%) [M-H]-
1 I 309, 28 6 EtOH:DMF (5:1) 288-289 54,88% 308,0
2 II 343,72 6 EtOH:DMF (5:1) 271-272 59.45% 342
3 III 354,27 6 EtOH:DMF (5:1) 264-265 56,82% 353
4 IV 354,27 6 EtOH:DMF (5:1) 245-246 74,81% 353
5 V 327,27 6 EtOH:DMF (5:1) 262-263 56,50% 326
6 B 221,17 4 EtOH:DMF (5:1) 249-2520C 67,88%
Bảng 3.2 Kết quả phổ IR của các chất đã tổng hợp được
STT Ký hiệu chất
IR (KBr, υcm-1)
υ NH υCHarom υC2=O υC4=O υNO2 υCaryl-X
1 I 3221 2929-2856 1752 1715 1523-1339
2 II 3238 2919-2850 1758 1723 1524-1338 1093(X-Cl))
3 III 3445 3195-3122 1773 1734 1516-1342
4 IV 3195 3087 1769 1725 1528-1345
5 V 3227 3099 1764 1726 1537-1345 1237(X-F)
6 B 3244 3116-3086 1787 1740 1525-1347
Bảng 3.3 Số liệu phổ 1H – NMR của các chất tổng hợp được Công thức cấu tạo chung:
O2N N
NH O
O
21 3 4
5 1"
2"
3"
4"
5" 6"
(B) :
O2N N
NH O
O
2 1
3 4
5
R
1'
2' 3'
4' 6' 5' 1"
2"
3"
4"
5" 6"
(I-V)
STT Kí hiệu chất 1H-NMR (DMSO-d6, δppm)
1 B 8,518(s;1H;N1-H); 8,320(d;2H;H3”,5”,J=9); 7,724(d;2H;H2”,6”,J=9); 4,104(s;2H;H5)
2 I 11,227(s;1H;N1-H); 8,391(d;2H;H3”,5”, J=9,5); 7,830(d;2H;H2”,6”, J=9,5); 7,719(d;2H;H2’,6’, J=7,5);
7,451(t;2H;H3’,5’,J=7.5); 7,383(t;1H;H4’,J=7,5); 6,695(s;1H;CH)
3 II 11,278(s;1H;N1-H); 8,368(d;2H;H3”,5”,J=9); 7,812(d;2H;H2”,6”,J=9); 7,715(d;2H;H2’,6’,J=8,5);
7,487(d;2H;H3’,5’,J=8,5); 6,683(s;1H;CH)
4 III 11,538(s;1H;N1-H); 8,393(d;2H;H3”,5”,J=7,5); 8,240(d;2H;H3’,5’,J=9); 7,929(d;2H;H2’,6’,J=9);
7,835(d;2H;H2”,6”,J=7); 6,774(s;1H;CH)
5 IV 11,530(s;1H;N1-H); 8,471(s;1H;H2’); 8,403(d;2H;H3”,5”,J=9,5); 8,178(d,1H,H4’,J=8);
8,090(d,1H,H6’,J=8); 7,824(d,2H,H2’,6’,J=9,5); 7,709(t,1H,H5’,J=8), 6,836(s;1H;CH) 6 V 811,245(s;1H;N1-H); 8,379(d;2H;H3”,5”,J=9); 7,833(d;2H;H2”,6”,J=9); 7,773(t;2H;H2’,6’,J=5,5);
7,274(t;2H;H3’,5’,J=9); 6,712(CH)
Bảng 3.4 Số liệu phổ 13C – NMR của các chất tổng hợp được Công thức cấu tạo chung
O2N N
NH O
O
21 3 4
5 1"
2"
3"
4"
5" 6"
(B) :
O2N N
NH O
O
2 1
3 4
5
R
1'
2' 3'
4' 6' 5' 1"
2"
3"
4"
5" 6"
(I-V)
STT Kí hiệu chất
13C-NMR (DMSO-d6, δppm)
1 B 170,705(C-4); 155,573(C-2); 145,716(C-4”); 138,171(C-1”); 126,594(C-2”;6”);124,016(C-3”;5”); 46,053(C5) 2 I 162,78(C-4); 153,317(C-2); 146,009(C-4”); 137,712(C-1”); 132,655(C-1’); 129,622( C-2”,6”); 128,867(C-
3’,4’,5’); 126,947(C-2”,6”); 126,023( C-5); 124,128(C-3”,5”);110,684(CH)
3 II 162,658(C-4); 153,285(C-2); 146,033(C-4”); 137,624(C-1”); 133,321(C-1’); 131,602(C-4’); 131,242 ( C-2’,6’);
128,803(C-3’,5’); 126,896(C-2”,6”); 126,524( C-5); 124,110(C-3”,5”);109,218(CH)
4 III 162,555(C-4); 153,450(C-2); 146,528(C-4’); 146,139(C-4”); 139,589 (C-1’); 137,465(C-1”);130,379( C-2’,6’);
129,010 ( C-5); 126,954(C-2”,6”); 124,165(C-3”,5”); 123,799(C-3’,5’); 107,423 (CH)
5 IV 162,532(C-4); 153,495(C-2); 148,225(C-3); 146,084(C-4”); 137,553(C-1”); 135,407( C-6’); 134,535(C-1’);
130,200(C-5’); 128,389(C-5); 126,974(C-2”,6”); 124,168(C-3”,5”); 123,887(C-2’); 122,962(C-4’) 6 V 162,748(C-4); 161,103(C-4’); 153,340(C-2); 146,015(C-4”); 137,685(C-1”); 131.921(C-2’); 131,854(C-6’);
129,268(C-1’); 126,939(C-2”,6”); 125,809(C-5); 124,135(C-3”,5”);115,968(C-3’); 115,797(C-5’); 109,620(CH)
STT Ký hiệu mẫu
Dòng tế bào % sống sót
Kết luận
A549 MCF-7 Hep-G2 HTC116
1 DMSO 100 100 100 100
2 Adriamycin 29,2 16,8 26,9 17,5 Dương tính
3 I 74,9 108,7 70,8 56,3 Âm tính
4 II 85,0 116,7 80,3 51,4 Âm tính
5 III 87,6 178,5 87,7 52,0 Âm tính
6 IV 87,9 158,4 79,9 46,3 Dương tính trên 1 dòng HTC116
7 V 68,3 270,3 67,3 44,3 Dương tính trên 1 dòng HTC116
8 B 79,8 81,4 82,2 52,5 Âm tính