Nghiên cứu thành phần hóa học lá đu đủ rừng ( trevesia palmata (roxb lindl) vis)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Cấu trúc 11 khung cấu trúc chính triterpenoid và một số dẫn chất của chúng 12 Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng 20 Bảng 3.2 Kết

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

**********

NGUYỄN TIẾN TIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA

HỌC LÁ ĐU ĐỦ RỪNG

(Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2014

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

**********

NGUYỄN TIẾN TIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA

HỌC LÁ ĐU ĐỦ RỪNG

(Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis.)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

TS Đỗ Quyên

Nơi thực hiện:

Trường Đại học Dược Hà Nội

HÀ NỘI – 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp, tôi đã nhận được nhiều sự hướng dẫn và giúp đỡ của thầy cô, gia đình và bạn bè

Để hoàn thành khóa luận này, trước hết tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng

biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Quyên, người thầy giàu lòng đam mê, đã luôn tận tình

hướng dẫn, động viên, truyền đạt cho tôi rất nhiều kiến thức và niềm đam mê trong công việc

Tôi xin bày tỏ sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Tuấn

Anh, người thầy đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt cho tôi những kiến thức cũng

như những kinh nghiệm nghiên cứu khoa học quý báu Thầy là tấm gương sáng trong nghiên cứu Phong cách làm việc của thầy đã tạo cho tôi niềm đam mê lớn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Quỳnh Chi và Th.S

Lê Thanh Bình – hai cô giáo luôn nhiệt tình và tận tâm với nghiên cứu Những hỗ

trợ quý báu của hai cô giúp tôi hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên đang công tác tại bộ môn Dược Liệu – Trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi

để tôi hoàn thành khóa luận

Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn tất cả các thầy cô giáo trường Đại học Dược

Hà Nội đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức cho tôi trong những năm học vừa qua

Cuối cùng, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn vô hạn tới gia đình, bạn bè những người đã luôn quan tâm, động viên và là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tôi hoàn thành tốt khóa luận này

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2014 Sinh viên

Nguyễn Tiến Tiệp

MỤC LỤC

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 CHI Trevesia Vis VÀ LOÀI Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis 2

1.1.1 Đặc điểm thực vật 2

1.1.2 Thành phần hóa học của chi Trevesia Vis và cây Đu đủ rừng 7

1.1.3 Tác dụng và công dụng của cây Đu đủ rừng 8

1.2 TRITERPENOID 9

1.2.1 Sơ lược về cơ chế hình thành các triterpenoid 9

1.2.2 Phân loại triterpenoid 12

1.2.3 Đặc điểm của phần đường trong triterpenoid 14

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 16

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Máy móc và thiết bị nghiên cứu 17

2.2.2 Hóa chất, dung môi 17

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.4.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ 17

2.4.2 Chiết xuất phân đoạn các nhóm chất 18

2.4.3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất 18

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 19

3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 19

3.1.1 Định tính các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng 19

3.1.2 Quy trình chiết xuất lá Đu đủ rừng 20

3.1.3 Định tính cắn phân đoạn n-hexan/ethylacetat và ethylacetat 23

3.1.4 Phân tích chất từ cắn phân đoạn n-hexan/ethyl acetat bằng GC-MS

26

3.1.5 Phân lập và nhận dạng chất từ cắn phân đoạn ethylacetat 27

3.2 BÀN LUẬN 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 37

1 KẾT LUẬN 37

2 ĐỀ XUẤT 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Cấu trúc 11 khung cấu trúc chính triterpenoid và một số dẫn

chất của chúng

12

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng 20

Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm chất chính trong lá Đu đủ rừng khi

chiết xuất bằng các dung môi khác nhau

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc aglycon của các saponin phân lập từ hai loài

Trevesia palmata (Roxb & Lindl) Vis và Trevesia sundaica

Miq

7

Hình 1.2 Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen loại

monocylic, bicyclic và tricyclic [26]

10

Hình 1.3 Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen tetracylic 11

Hình 1.4. Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen pentacylic 11

Hình 2.1 Cây Đu đủ rừng trên thực địa và cụm hoa 16

Hình 3.1 Tóm tắt quy trình chiết xuất các nhóm chất trong lá Đu đủ

rừng

23

Hình 3.2 Sắc kí đồ cắn phân đoạn n-Hexan/Ethyl acetat khi triển khai

với hệ dung môi Toluen/ethyl acetat/acid formic [3 : 1 : 0,1]

25

Hình 3.3 Sắc kí đồ cắn phân đoạn ethyl acetat khi triển khai với hệ

dung môi Toluen/ethyl acetat/methanol/acid formic [8 : 6 : 0,3 : 0,7]

26

Hình 3.4 Sắc kí đồ của TP-ET-02 khai triển với các hệ dung môi I, II,

29

Hình 3.5 Phổ khối MS-ESI positive của chất TP-ET-02 30

Hình 3.6 Cấu trúc của stigmasterol và sitosterol 31

Hình 3.7 Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của chất TP-ET-02

Hình 3.9 Phổ 13C-NMR và DEPT của chất TP-ET-02 34

Hình 3.10 Công thức cấu tạo của β-stigmasterol-3-O-β-Dglucopyranosit 34

Hình 3.11 Công thức cấu tạo của β-sitosterol-3-O-β-D-glucopyranosit 35

ĐẶT VẤN ĐỀ

Họ Nhân sâm (Araliaceae) trong hệ thực vật Việt Nam khá phong phú và đa dạng về đặc điểm hình thái cũng như thành phần hóa học [7] Hầu như tất cả các loài trong họ Nhân sâm đều được sử dụng làm thuốc trong Y học cổ truyền ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là ở các nước Đông Bắc Á

Trevesia Vis là một chi thuộc họ Nhân sâm, gồm khoảng hơn 10 loài, là

những cây thuốc quý, có giá trị, hiện đã và đang được sử dụng khá rộng rãi trong Y học dân tộc Việt Nam, Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ và nhiều nước

khác Các nhà khoa học đã xác định ở Việt Nam chi Trevesia Vis gồm có 6 loài

phân bố rộng rãi khắp cả nước, cây thường mọc ở vùng rừng đệm, rừng xanh hay dọc bờ sông suối [4]

Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis , tên thường gọi là Đu đủ rừng, Thông

thảo gai…là một loài thuộc chi Trevesia Vis., mọc ở trên các sườn núi có độ cao

600 – 2000 m [11], hoặc dọc theo các sông, suối, ở thung lũng các rừng phục hồi [2] Đu đủ rừng đã được sử dụng từ lâu theo kinh nghiệm dân gian và Y học cổ truyền Theo Đông Y, lõi thân có tác dụng lợi tiểu, lợi phù, lợi sữa, dùng để chữa phù thũng, đái dắt, tê thấp, làm thuốc hạ nhiệt, và cũng được xem như một vị thuốc bổ; lá chữa gãy xương [2] Tuy nhiên ở Việt Nam, loài cây này chưa được nghiên cứu Trên thế giới cho đến nay mới chỉ có một nghiên cứu về thành phần hóa học

Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học lá Đu đủ

rừng (Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis.)” Để thực hiện được đề tài này, nội

dung nghiên cứu bao gồm:

- Định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá Đu đủ rừng;

- Chiết xuất và chiết phân đoạn dịch chiết lá Đu đủ rừng;

- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của chất phân lập được từ lá Đu đủ

rừng

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 CHI Trevesia Vis VÀ LOÀI Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis

1.1.1 Đặc điểm thực vật

1.1.1.1 Vị trí phân loại chi Trevesia Vis

Theo hệ thống phân loại của Takhtajan được ghi trong cuốn Flowering plants

[22], cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis.) thuộc chi Trevesia Vis., một chi nằm trong họ Nhân sâm (Araliaceae).Vị trí phân loại của chi Trevesia

Vis trong hệ thống phân loại thực vật chính thức có thể được tóm tắt như sau:

Ngành Ngọc lan Magnoliophyta

Lớp Ngọc lan Magnoliopsida Phân lớp Sổ Dilleniidae Liên bộ Cornanae

Bộ Nhân sâm (Hoa tán) Apiales

Họ Nhân sâm (Ngũ gia bì) Araliaceae

Chi Trevesia Vis

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái và phân bố của chi Trevesia Vis

Họ Nhân sâm khá đa dạng về đặc điểm hình thái Ở Việt Nam hiện nay ghi

nhận được 18 chi thuộc họ này, trong đó có chi Trevesia Vis [7]

Chi Trevesia Vis là những cây bụi hay cây gỗ nhỏ thường xanh, hiếm khi

phân nhánh; thân có gai (ở cây già, những gai này bị tiêu biến) Lá lớn, mọc so le,

có thùy chân vịt hay kép chân vịt, có cuống, mép lá khía răng cưa; số thùy 5 – 13

Lá kèm dính với gốc cuống lá thành bẹ chìa có 2 thùy Cụm hoa tán nhiều hoa, hợp lại thành chùy hoặc chùm; tổng số tán 1 – 25, mỗi tán mang 9 – 65 hoa Lá bắc bền hoặc rụng sớm Hoa lưỡng tính Đài có mép dạng sóng hay có răng nhỏ Cánh hoa 6 – 16, xếp van, thường thì hợp thành thể dạng mũ rụng sớm Nhị bằng số cánh hoa Bầu dưới, 6 – 16 ô, vòi nhụy hợp thành cột ngắn, mỗi ô có 1 noãn treo Quả hạch hình cầu – trứng; hạt 1 [2], [11], [16]

Trên thế giới, chi Trevesia Vis có khoảng hơn 10 loài phân bố ở vùng Đông

Nam Á, Ấn Độ, Nepal, Bu-tan, Băng La Đét và Tây Nam Trung Quốc [11], [16]

Dưới đây là khóa định loại của chi Trevesia Vis trong họ Araliaceae:

1A Tiền khai hoa xếp van

2B Bầu ít hơn 20 lá noãn

3B Lá đơn, xẻ thuỳ chân vịt hoặc xẻ chân vịt

5B Lá không có đốm tuyến

6A Bầu có 5-16 lá noãn 7B Cây bụi hoặc gỗ nhỏ, không có rễ khí sinh

8A Cây có gai Trevesia Vis [7]

1.1.1.3 Hình thái và phân bố của chi Trevesia Vis ở Việt Nam

Chi Trevesia Vis ở nước ta có 6 loài, trong đó 5 loài đã được ghi trong các sách thực vật Việt nam, đó là: Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis., Trevesia

sphaerocarpa Grushv et Skvorts., Trevesia longipedicellata Grushv et Skvorts., Trevesia cavaleriei (Lév) Grushv & Skvorts., Trevesia burckii Boerl [1], [3] Năm

2007, Phan Kế Lộc và cộng sự đã phát hiện thêm một loài mới thuộc chi Trevesia Vis ở Việt Nam, đặt tên là Trevesia vietnamensis J Wen & P.K Lôc [25]

Có thể phân biệt một số loài thuộc chi Trevesia Vis dựa trên khóa phân loại

sau:

1A Lá kép giả chẻ ngón, phần gốc phiến lá hình mạng

2A Tràng cánh phân, nhưng dính nhau một phần tạo cặp đôi hoặc cặp ba cánh

hoa……… T palmata 2B Tràng hoa hợp, thể dạng mũ, có thể rụng hoàn toàn ……….T burckii

1B Lá chia thùy hình ngón, viền thùy không tiếp xúc với gân chính của thùy

3A Hoa và quả trưởng thành có cuống ngắn hoặc không có cuống T beccarii

3B Hoa và quả trưởng thành có cuống dài (>1cm)

4A Thân cây, cuống lá và cụm hoa phủ lông cứng dày đặc, dài 1 – 2 cm……

……… ……….… T lateospina

4B Thân cây, cuống lá và cụm hoa phủ lớp lông ngắn hoặc một vài lông cứng

5A Thùy lá có tỷ lệ dài/rộng >3, dạng mác; bầu 7 – 8 ô………… T valida

5B Thùy lá có tỷ lệ dài/rộng < 2,5, xẻ thùy lông chim nông; bầu 8 – 16 ô

6A Cuống lá nhẵn; mỗi tán có ít hơn 15 hoa, bầu có 13 – 16 ô T arborea

6B Cuống lá có vài đến nhiều gai; mỗi tán có hơn 20 hoa; bầu có 8 – 12 ô 7A Lá có 5 – 9 thùy; tràng cánh phân, nhưng dính với nhau một phần…

……… T palmata

7B Lá có 9 – 11 thùy; cánh hoa hợp thể dạng mũ, có thể rụng hoàn toàn

……… … T sundaica [16]

Tuy nhiên hiện nay chưa có một khóa phân loại nào dùng để phân biệt các loài

trong cùng chi Trevesia Vis ở Việt Nam

1.1.1.4 Hình thái và phân bố một số loài thuộc chi Trevesia Vis ở Việt Nam 1.1.1.4.1 Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis

Ở Việt Nam gọi là Đu đủ rừng, Nhật phiến, Thôi hoang, Thông thảo gai, Thầu dầu núi [1]

Là cây nhỡ cao 7 – 8 m hoặc hơn, thân ít phân nhánh, cành có gai, ruột xốp

Lá đơn, phiến lá phân thuỳ chân vịt, xẻ sâu như lá thầu dầu, có 5-9 thuỳ nhọn có răng, gân nổi ở hai mặt, mép lá có răng cưa thô; cuống lá dài và có gai Lá non phủ lông mềm, màu nâu nhạt, lá già nhẵn Hoa mọc thành tán, tụ thành chuỳ ở nách Hoa to khoảng 1cm, màu trắng Quả dài 13-18mm, có khía; hạt dẹt

Hoa tháng 5 – 6 Quả tháng 7 – 9 [2]

Phân bố: Đu đủ rừng mọc ở những chỗ ẩm dọc theo các sông, suối, ở thung

lũng các rừng phục hồi [2] Ở nước ta, loài này phân bố ở các tỉnh Cao Bằng, Lạng Sơn, Ba Vì, Quảng Trị [3], Sơn La, Lào Cai, Tuyên Quang, Hà Tây, Kon Tum, Gia Lai, Đắc Lắc, Lâm Đồng [1] Trên thế giới, chúng có ở Trung Quốc, Băng La Đét, Nepal, Ấn Độ, Thái Lan, Lào, Cam Pu Chia [11], [16]

1.1.1.4.2 Trevesia sphaerocarpa Grushv et Skvorts

Ở Việt Nam gọi là Đu đủ rừng quả tròn [2], Nhật phiến quả tròn [1]

Là cây nhỡ cao 7 m, thân to 8 cm, không nhánh hay ít nhánh, không gai Lá non có lông sét, có 5 – 7 thùy sâu; các thùy này lại chia thùy nhọn, mép có răng; cuống lá dài đến 50 cm, lá kèm 2 cm Cụm hoa ở nách lá, dạng chùm mang tán trên trục dài 15 cm; mỗi tán có 20 – 30 hoa, cuống hoa có lông sét, dài 3 – 4 cm Hoa có

11 cánh hoa, 11 – 12 nhị; bầu (8-) 10 (-11) ô Quả to 2 cm, cuống quả dài 3 – 4 cm; hạt to 9 – 12 mm [2], [3]

Loài này mọc hoang trong rừng, thường ở núi đá vôi độ cao 500 – 1200 m, ở các tỉnh Quảng Ninh, Ninh Bình, Quảng Trị, Lâm Đồng, Sơn La [1], [2] Có hoa tháng 5, có quả tháng 10 [2]

1.1.1.4.3 Trevesia longipedicellata Grushv & Skvorts

Ở nước ta gọi là cây Nhật phiến cuống dài [1]

Là cây nhỡ cao 6 m; thân to 10 cm, không nhánh, có gai Lá non có lông sét; phiến dài đến 45 cm; gồm 5 – 7 thùy, có thùy sâu và có răng nhọn; cuống lá dài đến

65 cm; lá kèm 2 cm Chùm mang tán hay tán cô độc; trục hoa 25 cm; tán to 15 cm, cuống hoa dài 5 – 7 cm; hoa 7 – 9 cánh hoa; 7 – 9 nhị, bầu có 7 – 9 ô Quả to 2 cm, màu đen; hạt dài 7 mm [3]

Cây mọc rải rác trong rừng, ở độ cao 500 m, có ở Lai Châu, Sơn La, Cao Bằng, Lạng Sơn, Vĩnh Phúc, Đắc Lắc, Lâm Đồng [1]

1.1.1.4.4 Trevesia cavaleriei (Lév) Grushv & Skvorts

Ở nước ta gọi là cây Thù dù [1]

Là cây nhỡ hoặc gỗ nhỏ, không gai Lá xẻ chân vịt, chia 5 – 9 thùy; thùy có răng, lúc non có lông, rồi không lông Cụm hoa là chùm mang tán; bầu 8 – 12 ô Quả dài 15 – 18 mm [3]

Loài này mọc ở Ba Vì, Nghệ Tĩnh [3], Lào Cai, Hà Giang, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Hòa Bình, Hà Tây, Hà Nội, Nghệ An, Lâm Đồng [1] Trên thế giới, cây còn thấy mọc ở Trung Quốc [1]

1.1.1.4.5 Trevesia burckii Boerl

Ở nước ta gọi là cây Đu đủ rừng burck, Thầu dầu núi burck [1]

Cuốn “Cây cỏ Việt Nam”, quyển 2 của Phạm Hoàng Hộ mô tả rất sơ lược về

loài này Là cây bụi nhỏ Lá chân vịt, có 7 thùy; thùy có cuống; cánh và đáy nhập vào một phiến chân vịt, không lông, mép có răng thưa [3]

Tài liệu tổng quan chi Trevesia (họ Araliaceae) [16] mô tả rất chi tiết loài này

như sau: Cây bụi cao tới 5 m; ít phân nhánh; thân cây có gai mọc rải rác, dài 0,2 –

0,7 cm; ở phần thân non phủ lông tơ màu đỏ nâu Cây con có lá đơn, hình tam giác – trứng, cây già có lá chân vịt, giống như hình các ngón tay trên một bàn tay Phiến thùy ép sát gân giữa của từng thùy và tách biệt với phần gốc lá hình tim; có 7 – 9 thùy hình mác hay trứng ngược, kích thước 15 x 36 cm, đỉnh nhọn, mép khía răng cưa Cuống lá dài 20 – 50 cm, trơn nhẵn hoặc có gai thẳng mọc rải rác Bẹ lá 2 cm;

lá kèm 1 – 2,5 cm; phủ lông màu nâu đỏ Cụm hoa ở ngọn thân hoặc giữa các vòng lá; mọc thành chùm; trục chính dài tới 60 cm, phát sinh 6 – 12 trục thứ cấp dài 23 cm; trên đó có mang các tán đơn Lá bắc hình tam giác, nhẵn hoặc có gai mọc rải rác Mỗi tán rộng 3 – 8 cm, mang 30 – 50 hoa đơn; cuống hoa dài 10 – 35 mm Tràng có 7 – 10 cánh hoa, hợp thành thể dạng mũ Bộ nhị có 7 – 10 nhị; bao phấn hình elip, kích thước 2 x 3 mm; chỉ nhị dài 2,5 mm Hạt phấn kích thước 30 -35 µm Bầu có 7 – 10 ô Quả hình cầu, đường kính 2 cm [16]

Cây mọc rải rác trong rừng thưa, độ cao dưới 300 m, ở một số tỉnh thành nước

ta như Yên Bái, Hòa Bình, Nghệ An, Đắc Lắc, Lâm Đồng Trên thế giới, loài này còn có ở Thái Lan, Malaysia, Indonesia (Sumatra, Borneo) [1]

1.1.1.4.6 Trevesia vietnamensis J.Wen & P.K Lôc

Cây cao 3 – 5 m Thân có gai hình nón; thân non phủ lông cứng dài, dày đặc

Lá kép chân vịt, gồm 4 – 5 lá chét; lá kèm dính với gốc cuống lá; cuống 20 – 40 cm, phủ lông cứng rải rác Lá chét kiểu lông chim, viền ngoài hình trứng, kích thước 30 – 70 x 20 – 60 cm, mặt trên lá nhẵn hoặc có lông cứng, mặt dưới lá có lông tơ hình sao rải rác; cuống lá chét dài 1 – 4 cm, đỉnh lá nhọn; gân lá nỗi rõ ở cả 2 mặt lá; mép khía răng cưa Cụm hoa ở phía ngọn, gồm 3 – 5 tán trên một trục chính dài 20 – 35 cm, phủ lông cứng dài 28 mm, dày đặc Mỗi tán mang 50 – 110 hoa Lá bắc hình mác Cuống hoa, chồi hoa và hoa non phủ lông tơ dày đặc Hoa màu trắng hoặc trắng hơi xanh Đài hoa hình tam giác, dài 0,9 – 1,1 mm, rộng 0,6 – 0,7 mm Tràng 4 – 5 cánh, kích thước 5,0 – 5,5 x 2,5 – 2,8 mm Bộ nhị 4 – 5, bao phấn thuôn dài 2,0 – 2, 2 mm Bầu có 4 – 5 ô Quả hình cầu – trứng ngược, dài 8 – 9 mm, rộng

7 – 8 mm

Có hoa cuối tháng 9 Quả tháng 3

Loài này ưa những nơi mát mẻ, ẩm ướt, nhiều mùn, trong các thung lũng và núi đá vôi có độ cao 500 – 850 m Hiện thấy mọc ở tỉnh Thanh Hóa, Cúc Phương

(Ninh Bình), Mộc Châu (Sơn La) [25]

1.1.2 Thành phần hóa học của chi Trevesia Vis và cây Đu đủ rừng

Cho đến nay những nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi

Trevesia Vis., kể cả trong nước và nước ngoài vẫn còn rất hạn chế

Chúng tôi mới chỉ tìm được hai nghiên cứu nước ngoài về thành phần saponin

của hai loài thuộc chi Trevesia Vis., đó là loài T palmata (Roxb & Lindl.) Vis và loài T sundaica Miq

Năm 1997, từ phân đoạn n- BuOH của dịch chiết MeOH từ hoa và lá loài T

sundaica Miq (thu hái ở Italia), Nunziatina De Tommasi và cộng sự (Italia) đã phân

lập được 10 saponin triterpenoid [13] Năm 1999, cũng từ phân đoạn n- BuOH của

dịch chiết EtOH từ lá loài T palmata (Roxb & Lindl.) Vis (thu hái ở Italia), nhóm

nghiên cứu này đã phân lập được 8 saponin triterpenoid [12] Phần lớn các saponin này là các bisdesmosid, chỉ có 3 saponin monodesmosid, nhưng tất cả đều có phần aglycon là acid oleanolic hoặc dẫn chất của acid này

Hình 1.1 Cấu trúc aglycon của các saponin phân lập từ hai loài

Trevesia palmata (Roxb & Lindl) Vis và Trevesia sundaica Miq

(–H) hoặc nhóm thế hydroxy (–OH)

Trong loài T palmata (Roxb & Lindl.) Vis., mạch đường của các saponin

gồm 2 – 3 đơn vị monosaccarid liên kết với C3 (liên kết glycosid) và đối với các bisdesmosid, có 3 – 4 đơn vị monosaccarid liên kết với C28 (liên kết ester) của phần

genin Trong khi đó ở loài T sundaica Miq., mạch đường liên kết với C3 và C28

lần lượt là 4 – 5 và 1 – 2 đơn vị monosaccarid Các đơn vị đường thuộc loại pyranose: β-D-glucose và α-L-rhamnose ở cả 2 loài; β-D-galactose và β-D- xylose ở

loài T sundaica Miq.; α-L-arabinose và β-D-quinovose ở loài T palmata (Roxb &

Lindl.) Vis

Tuy nhiên một nghiên cứu khác ở Thái Lan sử dụng các phản ứng định tính

các nhóm chất hóa học đặc trưng, đã cho thấy trong cây Trevesia palmata (Roxb &

Lindl.) Vis (thu hái ở Thái Lan) có triterpen tự do, lacton glycosid; không có saponin, flavonoid, tanin, alcaloid [17]

1.1.3 Tác dụng và công dụng của cây Đu đủ rừng

Hiện nay trên thế giới có rất ít nghiên cứu về tác dụng dược lý của Đu đủ rừng

(Trevesia palmata (Roxb & Lindl.) Vis.)

Năm 1999, Nunziatina De Tommasi và cộng sự (Ý) đã chứng minh dịch chiết saponin thô từ lá Đu đủ rừng và một số saponin phân lập được đều thể hiện tác dụng

Một nghiên cứu ở Thái Lan đã cho thấy dịch chiết ethanol phần trên mặt đất

cây Đu đủ rừng có tác dụng chống oxy hóa rất yếu trên in vitro [17]

Ở nước ta, Đu đủ rừng đã được sử dụng từ lâu theo kinh nghiệm dân gian và Y học cổ truyền Theo Đông Y, lõi thân có tác dụng lợi tiểu, lợi phù, lợi sữa, dùng để chữa phù thũng, đái dắt, tê thấp, làm thuốc hạ nhiệt, và cũng được xem như một vị thuốc bổ (20 – 30 g lõi thân sắc riêng hoặc phối hợp với cây Mua đỏ); lá được dùng nấu nước xông chưa tê liệt bại người và giã đắp chữa gãy xương (ở Trung Quốc người ta dùng lá chữa ngã tổn thương hay dao chém thương tích) [2]

1.2 TRITERPENOID

1.2.1 Sơ lược về cơ chế hình thành các triterpenoid

Triterpenoid là một nhóm hợp chất tự nhiên rộng lớn, được phân loại thành hơn 100 khung cấu trúc khác nhau Sự khác nhau về cấu trúc bắt nguồn từ con đường sinh tổng hợp với sự tham gia của hệ thống enzym chung được đặt tên là

“terpenoid synthase” (chủ yếu là enzym oxidosqualen cyclases – OSC) Các enzym

này giúp cho sự hình thành các carbocation từ các tiền chất mạch hở, bằng cách cộng thêm tác nhân ái điện tử vào nối đôi hoặc vòng epoxy (oxiran), từ đó tạo thành các vòng hay dẫn tới sự sắp xếp lại bộ khung cấu trúc Cuối cùng các cation trung gian được trung hòa điện tích bằng cách loại proton hoặc phản ứng với nước để hình thành sản phẩm Hai tiền chất phổ biến nhất cho quá trình tổng hợp triterpen là squalen và oxidosqualen [15]

Các triterpen tạo thành có mối quan hệ mật thiết với nhau Ngoài được tổng hợp trực tiếp từ các tiền chất, chúng còn là các chất trung gian chuyển hóa của nhau Chẳng hạn các triterpen pentacyclic (5 vòng) có thể bị thoái vòng dưới tác dụng của enzym OSC để hình thành các triterpen tetracyclic (4 vòng); sau đó triterpen tetracyclic có thể bị thoái vòng để hình thành các triterpen tricyclic (3 vòng), sản phẩm sau khi thoái vòng gọi là các seco- [15]

Sự đa dạng về cấu trúc còn được thể hiện ở chỗ các triterpen có thể bị thoái phân một vài nhóm methyl để hình thành các phân tử có số khối nhỏ hơn Chẳng hạn triterpen nhóm oleanan (30C) bị khử một nhóm methyl ở vị trí C30 hình thành triterpen – noroleanan có 29 nguyên tử carbon

Hình 1.2, 1.3 và 1.4 trình bày quá trình hình thành một số khung cấu trúc triterpen loại monocylic, bicyclic, tricyclic, tetracyclic và pentacyclic

Hình 1.2 Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen loại monocylic,

bicyclic và tricyclic [26]

Hình 1.3 Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen tetracylic [26]

Hình 1.4 Cơ chế hình thành một số khung cấu trúc triterpen pentacylic [26]

1.2.2 Phân loại triterpenoid

Phân loại triterpenoid chủ yếu dựa vào phần aglycon

Hầu hết các triterpen trong tự nhiên có cấu trúc 5 vòng (pentacyclic) hoặc 4 vòng (tetracyclic) [26] Hai loại cấu trúc này được xếp vào nhóm chất saponin nhờ tính chất tạo bọt Theo cách phân loại mới nhất hiện nay (2010) [14], triterpenoid được chia thành 11 nhóm chính là oleanan, ursan, hopan, lupan, taraxastan, dammaran, lanostan, tirucallan, cucurbitan, cycloartan và holostan Trong đó nhóm oleanan là nhóm lớn nhất

Thực tế các triterpen mạch hở, 1 vòng, 2 vòng, 3 vòng và 6 vòng cũng đã được phân lập từ thực vật [26] Ví dụ gần đây các nhà khoa học đã phân lập được các triterpenoid có cấu trúc 3 vòng (tricyclic) như các chất kadcotriones A – C có trong

thân loài Kadsura coccinea (Lem.) A C Smith [19] và chất schiglautone A trong thân loài Schisandra glaucescens Diels., họ Ngũ vị tử (Schisandraceae) [21]; phân

myrrhanol A có cấu trúc 2 vòng từ loài Balsamodendron mukul [20]; 6 triterpenoid

có cấu trúc 6 vòng (hexacyclic) từ loài Euscaphis japonica [10]

Bảng 1.1 trình bày cấu trúc 11 khung cấu trúc chính của nhóm triterpenoid và một số dẫn chất của chúng

Bảng 1.1 Cấu trúc 11 khung cấu trúc chính triterpenoid và một số dẫn

chất của chúng [24]

Olean 17, 22-seco olean

Olean biến đổi 30-nor olean

Ursan 18, 19-seco ursan

Hopan Bis-nor hopan

Lupan 3,4-seco lupan

Dammaran 15,16-seco dammaran

Taraxastan Cycloartan

Tirucallan Cucurbitan

1.2.3 Đặc điểm của phần đường trong triterpenoid

Cấu trúc phần đường điển hình của các triterpenoid pentacyclic và tetracyclic

là các chuỗi đường oligo 2 – 5 đơn vị monosaccarid, thường liên kết với phần genin

ở vị trí C3 theo liên kết glycosid hoặc/và C28 theo liên kết ester Mạch đường liên kết với phần genin ở vị trí C6, C7, C20, C21, C22, C24 hoặc C26 theo liên kết

Các kết quả nghiên cứu đã có cho thấy các cấu trúc triterpenoid tricyclic, bicyclic, monocyclic đều không gắn thêm các mạch đường

Các monosaccarid phổ biến nhất, hay gặp trong triterpenoid là các đường thông thường như glucose, acid glucoronid, rhamnose, xylose, arabinose, galactose Hiếm gặp hơn là các đường quinovose, fucose, arabifuranose, ribose, apiose

Hầu hết các triterpenoid là những monodesmosidic (có 1 mạch đường) hoặc bidesmosidic (có 2 mạch đường) Ngoại lệ ở một số loài thực vật có triterpenoid

tridesmosidic (có 3 mạch đường), chẳng hạn như loài Chenopodium quinoa Willd., loài Astragalus armatus

CHƯƠNG 2 NGUYÊN LIỆU, PHƯƠNG TIỆN, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU

Mẫu nghiên cứu là lá cây Đu đủ rừng thu hái ở huyện Vị Xuyên, tỉnh Hà Giang vào tháng 1 năm 2014 Dược liệu sau khi thu hái đem rửa sạch, cắt nhỏ phơi

sấy khô, dược liệu được nghiền thành bột thô và bảo quản trong túi nilon kín, để nơi thoáng mát, khô ráo

Mẫu nghiên cứu có hoa được làm tiêu bản, lưu tại Phòng tiêu bản Bộ môn Thực vật, trường Đại học Dược Hà Nội, MSTB: HNIP/18064/14 TS Nguyễn Quốc Huy - bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, giám định tên khoa học

mẫu nghiên cứu là Trevesia palmata (Roxb & Lindl) Vis., thuộc họ Nhân sâm

(Araliaceae)

Hình 2.1 Cây Đu đủ rừng trên thực địa và cụm hoa

2.2 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU

2.2.1 Máy móc và thiết bị nghiên cứu

 Sấy dược liệu bằng tủ sấy SHELLAB

 Máy chiết siêu âm Extractor - Sony SM30 CEP, tần số 60 MHz

 Máy cất quay Buchi ROTAVAPOR R – 200

 Cân kĩ thuật Sartorius

 Máy xác định độ ẩm SARTORIUS

 Bản mỏng tráng sẵn silica gel GF254 của hãng MERCK (Đức)

 Các dụng cụ thí nghiệm thông thường (bình gạn, cốc có mỏ, pipet, ống đong…)

 Máy đo khối phổ LC/MS/MS – Xevo TQMS tại Viện hóa học

AVANCE AM500 FT-NMR tại Viện hóa học

2.2.2 Hóa chất, dung môi

Các hóa chất do phòng Giáo tài Đại học Dược Hà Nội cung cấp

Các dung môi đạt chuẩn phân tích, thí nghiệm

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Định tính các nhóm hợp chất hữu cơ trong lá Đu đủ rừng

- Chiết xuất và chiết phân đoạn dịch chiết lá Đu đủ rừng

- Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ dịch

chiết lá Đu đủ rừng

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Định tính các nhóm chất hữu cơ

Chiết xuất và định tính các nhóm chất hữu cơ trong lá Đu đủ rừng bằng các

phản ứng hóa học đặc trưng theo các tài liệu Phương pháp nghiên cứu hóa học cây

thuốc [6] và Dược liệu học tập 1 [5]

Định tính các phân đoạn bằng sắc kí lớp mỏng sử dụng bản mỏng tráng sẵn

2.4.2 Chiết xuất phân đoạn các nhóm chất

- Chiết xuất các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng bằng dung môi ethanol 70%, sau đó cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm

- Chiết phân đoạn: dịch chiết toàn phần lần lượt được chiết với các hệ dung môi hữu cơ có độ phân cực tăng dần: n-hexan (H), n-hexan/ethylacetat [5:1] (HE)

và ethylacetat (E)

2.4.3 Phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các chất

- Phân tích phân đoạn HE bằng phương pháp GC-MS

- Phân lập các hợp chất trong phân đoạn E bằng sắc kí cột với chất hấp phụ là silicagel, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm

- Theo dõi các phân đoạn chạy cột bằng sắc kí lớp mỏng

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

3.1.1 Định tính các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng

Tiến hành định tính xác định các nhóm chất hữu cơ có mặt trong lá Đu đủ rừng dựa vào các hiện tượng vật lý và các phản ứng hóa học đặc trưng sau:

 Định tính saponin: quan sát hiện tượng tạo bọt và phân biệt 2 loại saponin

dựa trên tính chất tạo bọt trong môi trường acid và kiềm

với dung dịch kiềm loãng NaOH 10% và hơi amoniac

 Định tính alcaloid: sử dụng các thuốc thử Mayer, Bouchardat và

Dragendorff

 Định tính anthranoid dạng tự do và dạng toàn phần: sử dụng phản ứng

với dung dịch kiềm loãng (phản ứng Borntraeger)

 Định tính coumarin: sử dụng phản ứng mở - đóng vòng lacton; phản ứng

với thuốc thử diazo; quan sát hiện tượng huỳnh quang và vi thăng hoa

 Định tính glycosid tim: sử dụng phản ứng Liebermann (khung steroid);

phản ứng Legal (vòng lacton) và phản ứng Keller – Kiliani (đường 2,6 - desoxy)

chì acetat 10% và với dung dịch gelatin 1%

 Định tính polysaccarid: sử dụng phản ứng với TT Lugol

 Định tính đường khử: sử dụng phản ứng với TT Fehling A + Fehling B

 Định tính chất béo: bằng cách quan sát hiện tượng vết mờ trên giấy lọc khi

nhỏ dịch chiết lên miếng giấy lọc

 Định tính sterol: sử dụng phản ứng Liebermann- Burchard

Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng thu hái ở Hà Giang được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quả định tính các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng

TT Nhóm chất Kết quả định tính Kết luận

Nhận xét: Trong lá cây Đu đủ rừng (Trevesia palmata Roxb ex Lind Vis) có các

nhóm chất: saponin triterpenoid, acid hữu cơ, đường khử, sterol, polysaccarid và

chất béo Trong đó saponin triterpenoid là nhóm chất chính

3.1.2 Quy trình chiết xuất lá Đu đủ rừng

3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết xuất

Dựa trên kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ chính, chúng tôi nhận thấy lá cây Đu đủ rừng có 3 nhóm chất có tính tan khác nhau, đó là nhóm saponin triterpenoid (+ sterol); nhóm thứ hai là đường khử + polysaccarid + acid hữu cơ; nhóm thứ ba là chất béo Trong 3 nhóm này, hai nhóm đầu tan tốt trong dung môi nước và cồn nước, nhóm thứ 3 tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực Do vậy, chúng tôi khảo sát chiết bằng 4 hệ dung môi sau: nước; EtOH 30%, 70%, và 96%

Quy trình chiết xuất với mỗi hệ dung môi được thực hiện như sau: Cân chính xác khoảng 30 g bột lá Đu đủ rừng (độ ẩm 9,41%), thấm ẩm dược liệu bằng dung môi chiết Sau đó cho nguyên liệu chiết vào bình cầu, sinh hàn và thêm dung môi chiết ngập dược liệu khoảng 1,5 thể tích (khoảng 200 mL), chiết hồi lưu trong 5 h Rút dịch chiết, lọc Dịch chiết thu được tiến hành định tính các nhóm chất chính: triterpenoid (hiện tượng tạo bọt), đường khử, polysaccarid, acid hữu cơ, chất béo và chlorophyll Vì nguyên liệu nghiên cứu là lá nên chlorophyll chiếm lượng lớn và ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chiết xuất và phân lập

Kết quả định tính các nhóm chất chính của 4 dịch chiết nước, EtOH 30%, EtOH 70% và EtOH 96% được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.2 Kết quả định tính các nhóm chất chính trong lá Đu đủ rừng

khi chiết xuất bằng các dung môi khác nhau

TT Nhóm chất Dung môi chiết xuất

Nước EtOH 30% EtOH 70% EtOH 96%

Nhận xét: Khi chiết xuất bằng dung môi EtOH 96% thì lượng chất chính thu

được ít và lẫn nhiều tạp tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực là chlorophyll và chất béo Khi chiết bằng dung môi nước và cồn 30% thì thu được lượng chất chính lớn nhưng dịch chiết lẫn nhiều tạp tan tốt trong nước như đường khử và acid hữu

cơ Hơn nữa, dịch chiết thu được khó cất thu hồi dung môi Sử dụng dung môi EtOH 70% có nhiều ưu điểm là ít tạp hơn, thu được nhóm chất chính và dịch chiết

dễ cất thu hồi dung môi

3.1.2.2 Chiết xuất và chiết phân đoạn

Dựa vào kết quả khảo sát dung môi chiết xuất trên, chúng tôi lựa chọn EtOH 70% để chiết xuất dịch chiết toàn phần

Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau: Cân 1,0 kg bột lá (độ ẩm 9,41%) cho vào bình chiết siêu âm 10 L, thêm 1,5 L ethanol 70% để thấm ẩm dược liệu, trộn đều Sau đó thêm 4 L dung môi để dung môi chiết ngập hoàn toàn nguyên liệu (khoảng 1,3 lần thể tích dược liệu) Tiến hành chiết siêu âm với thời gian chiết mỗi

tiếp tục cho thêm dung môi để chiết lần 2 và lần 3 với điều kiện chiết như lần thứ nhất Gộp dịch chiết, lọc thu được 11 L dịch chiết cồn (ký hiệu: DC1) Cất thu hồi dung môi dịch chiết DC1 dưới áp suất giảm đến khi còn 3 L thu được dịch chiết 2 (ký hiệu: DC2) Tiến hành chiết kiệt DC2 lần lượt với các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, n-hexan/ethyl acetat [5:1] và ethyl acetat (mỗi dung môi tiến hành chiết 3 lần) thu được 3 phân đoạn dịch chiết Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn phân đoạn n-hexan (ký hiệu H; 1,1 g), cắn phân đoạn n-hexan/ethylacetat [5:1] (ký hiệu HE; 2,5 g), cắn phân đoạn ethylacetat (ký hiệu E; 6,1 g) Quy trình chiết xuất và chiết phân đoạn lá Đu đủ rừng được trình bày ở hình 3.1

Hình 3.1 Tóm tắt quy trình chiết xuất các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng Nhận xét: cắn phân đoạn dịch chiết n-hexan thu được có khối lượng ít nhất, thể

chất dính, màu xanh đen Khi thử định tính phân đoạn này bằng sắc ký lớp mỏng, trên sắc ký đồ chỉ có vết màu xanh và đỏ (UV 366 nm) Do vậy có thể sơ bộ kết luận phân đoạn này chủ yếu là chlorophyll, chất béo nên trong khóa luận này chúng tôi không tiến hành nghiên cứu tiếp Cắn phân đoạn n-hexan/ethylacetat và ethylacetat có khối lượng là 2,5 g và 6,1 g tương ứng được sử dụng để nghiên cứu sâu hơn

3.1.3 Định tính cắn phân đoạn n-hexan/ethylacetat và ethylacetat

3.1.3.1 Định tính bằng phản ứng hóa học

Kết quả định tính phân đoạn n-hexan/ethylacetat và ethylacetat bằng phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 3.3

Bảng 3.3 Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học của 2 phân đoạn HE và E

Nhận xét: Bằng phản ứng hóa học đặc trưng, chúng tôi nhận thấy các nhóm chất

tan tốt trong nước như đường khử, acid hữu cơ và polysaccarid đều không có mặt ở

2 phân đoạn n-hexan/ethyl acetat và ethyl acetat Cả 2 phân đoạn dịch chiết đều không có hiện tượng tạo bọt Chỉ có nhóm sterol có mặt ở cả 2 phân đoạn, trong đó phân đoạn ethyl acetat cho phản ứng dương tính rõ nhất

3.1.3.2 Định tính bằng sắc kí lớp mỏng

Định tính cắn phân đoạn n-hexan/ethyl acetat

Dịch chấm sắc kí: Hòa tan cắn HE trong MeOH làm dịch chấm sắc kí

Các hệ dung môi khai triển:

Hiện màu: quan sát dưới ánh sáng UV 254 và 366 nm; sau đó phun TT

Kết quả cho thấy hệ dung môi IV cho sắc ký đồ có các vết tách rõ ràng và nhiều vết nhất Hình 3.2 trình bày sắc ký đồ của cắn phân đoạn HE khi triển khai

với hệ dung môi IV và quan sát ở các điều kiện khác nhau (ánh sáng thường, UV

AS thường UV254 UV365 TT Vanilin/H2SO4

Hình 3.2 Sắc kí đồ cắn phân đoạn n-Hexan/Ethylacetat khi triển khai với

hệ dung môi Toluen/ethyl acetat/acid formic [3 : 1 : 0,1]

Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat

Tương tự như trên, dịch chiết cắn phân đoạn ethylacetat được định tính bằng SKLM với các hệ dung môi khai triển khác nhau như sau:

Hiện màu: quan sát dưới ánh sáng UV 254 và 366 nm; sau đó phun TT

Kết quả cho thấy hệ dung môi V cho sắc ký đồ có các vết tách rõ ràng và nhiều vết nhất Hình 3.3 trình bày sắc ký đồ của cắn phân đoạn E khi triển khai với

hệ dung môi V và quan sát ở các điều kiện khác nhau

AS thường UV254 UV365 TT vanilin/H2SO4

Hình 3.3 Sắc kí đồ cắn phân đoạn ethyl acetat khi triển khai với hệ dung môi

Toluen/ethyl acetat/methanol/acid formic [8 : 6 : 0,3 : 0,7]

3.1.4 Phân tích chất từ cắn phân đoạn n-hexan/ethyl acetat bằng GC-MS

Theo một số nghiên cứu nước ngoài, có thể phân tích thành phần sterol trong các phân đoạn dịch chiết kém phân cực bằng phương pháp sắc ký khí (GC) hoặc sắc

ký khí kết hợp khối phổ (GC – MS) [8] [23] Do vậy, chúng tôi thử phân tích phân đoạn có độ phân cực thấp là n-hexan/ethyl acetat [5:1] bằng phương pháp GC - MS

Để tránh làm tắc cột sắc ký khí, chúng tôi tiến hành tinh chế cắn phân đoạn

HE qua sắc ký cột mở với chất nhồi cột là silicagel, dùng dung môi n-hexan (PA) để rửa giải Sau đó dịch rửa giải thu được, được cất thu hồi dung môi tới cắn khô rồi hòa tan vào dung môi n-hexan để phân tích