3.1.2.1. Khảo sát dung môi chiết xuất
Dựa trên kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ chính, chúng tôi nhận thấy lá cây Đu đủ rừng có 3 nhóm chất có tính tan khác nhau, đó là nhóm saponin triterpenoid (+ sterol); nhóm thứ hai là đường khử + polysaccarid + acid hữu cơ; nhóm thứ ba là chất béo. Trong 3 nhóm này, hai nhóm đầu tan tốt trong dung môi nước và cồn nước, nhóm thứ 3 tan trong dung môi hữu cơ ít phân cực. Do vậy, chúng tôi khảo sát chiết bằng 4 hệ dung môi sau: nước; EtOH 30%, 70%, và 96%.
Quy trình chiết xuất với mỗi hệ dung môi được thực hiện như sau: Cân chính xác khoảng 30 g bột lá Đu đủ rừng (độ ẩm 9,41%), thấm ẩm dược liệu bằng dung môi chiết. Sau đó cho nguyên liệu chiết vào bình cầu, sinh hàn và thêm dung môi chiết ngập dược liệu khoảng 1,5 thể tích (khoảng 200 mL), chiết hồi lưu trong 5 h. Rút dịch chiết, lọc. Dịch chiết thu được tiến hành định tính các nhóm chất chính: triterpenoid (hiện tượng tạo bọt), đường khử, polysaccarid, acid hữu cơ, chất béo và chlorophyll. Vì nguyên liệu nghiên cứu là lá nên chlorophyll chiếm lượng lớn và ảnh hưởng rất nhiều đến quá trình chiết xuất và phân lập.
Kết quả định tính các nhóm chất chính của 4 dịch chiết nước, EtOH 30%, EtOH 70% và EtOH 96% được trình bày ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả định tính các nhóm chất chính trong lá Đu đủ rừng khi chiết xuất bằng các dung môi khác nhau.
TT Nhóm chất Dung môi chiết xuất
Nước EtOH 30% EtOH 70% EtOH 96%
1. Triterpenoid +++ +++ +++ +
2. Đường khử +++ +++ + +
3. Polysaccarid ++ ++ + -
4. Acid hữu cơ ++ ++ + +
5. Chất béo + + + ++
6. Chlorophyll + + ++ +++
Nhận xét: Khi chiết xuất bằng dung môi EtOH 96% thì lượng chất chính thu được ít và lẫn nhiều tạp tan trong dung môi hữu cơ kém phân cực là chlorophyll và chất béo. Khi chiết bằng dung môi nước và cồn 30% thì thu được lượng chất chính lớn nhưng dịch chiết lẫn nhiều tạp tan tốt trong nước như đường khử và acid hữu cơ. Hơn nữa, dịch chiết thu được khó cất thu hồi dung môi. Sử dụng dung môi EtOH 70% có nhiều ưu điểm là ít tạp hơn, thu được nhóm chất chính và dịch chiết dễ cất thu hồi dung môi.
3.1.2.2. Chiết xuất và chiết phân đoạn
Dựa vào kết quả khảo sát dung môi chiết xuất trên, chúng tôi lựa chọn EtOH 70% để chiết xuất dịch chiết toàn phần.
Quy trình chiết xuất được thực hiện như sau: Cân 1,0 kg bột lá (độ ẩm 9,41%) cho vào bình chiết siêu âm 10 L, thêm 1,5 L ethanol 70% để thấm ẩm dược liệu, trộn đều. Sau đó thêm 4 L dung môi để dung môi chiết ngập hoàn toàn nguyên liệu (khoảng 1,3 lần thể tích dược liệu). Tiến hành chiết siêu âm với thời gian chiết mỗi
lần là 90 phút, nhiệt độ 60oC, tần số siêu âm 60 MHz. Rút dịch chiết lần thứ nhất,
tiếp tục cho thêm dung môi để chiết lần 2 và lần 3 với điều kiện chiết như lần thứ nhất. Gộp dịch chiết, lọc thu được 11 L dịch chiết cồn (ký hiệu: DC1). Cất thu hồi dung môi dịch chiết DC1 dưới áp suất giảm đến khi còn 3 L thu được dịch chiết 2 (ký hiệu: DC2). Tiến hành chiết kiệt DC2 lần lượt với các hệ dung môi có độ phân cực tăng dần: n-hexan, n-hexan/ethyl acetat [5:1] và ethyl acetat (mỗi dung môi tiến hành chiết 3 lần) thu được 3 phân đoạn dịch chiết. Các phân đoạn dịch chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn phân đoạn n-hexan (ký hiệu H; 1,1 g), cắn phân đoạn n-hexan/ethylacetat [5:1] (ký hiệu HE; 2,5 g), cắn phân đoạn ethylacetat (ký hiệu E; 6,1 g). Quy trình chiết xuất và chiết phân đoạn lá Đu đủ rừng được trình bày ở hình 3.1.
Hình 3.1. Tóm tắt quy trình chiết xuất các nhóm chất trong lá Đu đủ rừng Nhận xét: cắn phân đoạn dịch chiết n-hexan thu được có khối lượng ít nhất, thể chất dính, màu xanh đen. Khi thử định tính phân đoạn này bằng sắc ký lớp mỏng, trên sắc ký đồ chỉ có vết màu xanh và đỏ (UV 366 nm). Do vậy có thể sơ bộ kết luận phân đoạn này chủ yếu là chlorophyll, chất béo nên trong khóa luận này chúng tôi không tiến hành nghiên cứu tiếp. Cắn phân đoạn n-hexan/ethylacetat và ethylacetat có khối lượng là 2,5 g và 6,1 g tương ứng được sử dụng để nghiên cứu sâu hơn.
3.1.3. Định tính cắn phân đoạn n-hexan/ethylacetat và ethylacetat
3.1.3.1. Định tính bằng phản ứng hóa học
Kết quả định tính phân đoạn n-hexan/ethylacetat và ethylacetat bằng phản ứng hóa học được trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học của 2 phân đoạn HE và E
STT Nhóm chất Phản ứng định tính
Phân đoạn HE E
1 Saponin triterpenoid Hiện tượng tạo bọt - -
2 Sterol Liebermann + +++
3 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc ++ ±
4 Đường khử TT Fehling A+B - -
5 Acid hữu cơ Na2CO3 - -
6 Polysaccarid TT Lugol - -
Nhận xét: Bằng phản ứng hóa học đặc trưng, chúng tôi nhận thấy các nhóm chất tan tốt trong nước như đường khử, acid hữu cơ và polysaccarid đều không có mặt ở 2 phân đoạn n-hexan/ethyl acetat và ethyl acetat. Cả 2 phân đoạn dịch chiết đều không có hiện tượng tạo bọt. Chỉ có nhóm sterol có mặt ở cả 2 phân đoạn, trong đó phân đoạn ethyl acetat cho phản ứng dương tính rõ nhất.
3.1.3.2. Định tính bằng sắc kí lớp mỏng
Định tính cắn phân đoạn n-hexan/ethyl acetat
Dịch chấm sắc kí: Hòa tan cắn HE trong MeOH làm dịch chấm sắc kí.
Chất hấp phụ: bản mỏng silicagel GF254 (Merck) tráng sẵn đã hoạt hóa ở
110oC trong 1 giờ.
Các hệ dung môi khai triển:
Hệ I: n-hexan/ethyl acetat [5 : 1]
Hệ II: n-hexan/ethyl acetat [1 : 1]
Hệ III: Toluen/ethyl acetat/acid formic [5 : 1 : 0,1]
Hệ IV: Toluen/ethyl acetat/acid formic [3 : 1 : 0,1]
Hiện màu: quan sát dưới ánh sáng UV 254 và 366 nm; sau đó phun TT
vanillin/H2SO4 rồi sấy ở 110oC trong 10 phút.
Kết quả cho thấy hệ dung môi IV cho sắc ký đồ có các vết tách rõ ràng và nhiều vết nhất. Hình 3.2 trình bày sắc ký đồ của cắn phân đoạn HE khi triển khai
với hệ dung môi IV và quan sát ở các điều kiện khác nhau (ánh sáng thường, UV
254, 365 nm và TT vanillin/ H2SO4).
AS thường UV254 UV365 TT Vanilin/H2SO4
Hình 3.2. Sắc kí đồ cắn phân đoạn n-Hexan/Ethylacetat khi triển khai với hệ dung môi Toluen/ethyl acetat/acid formic [3 : 1 : 0,1]
Định tính cắn phân đoạn ethyl acetat
Tương tự như trên, dịch chiết cắn phân đoạn ethylacetat được định tính bằng SKLM với các hệ dung môi khai triển khác nhau như sau:
Hệ I: Diclomethan/ethyl acetat [1 : 4]
Hệ II: Cloroform/ethyl acetat/acid formic [8 : 1 : 0,5]
Hệ III: Cloroform/methanol [9 : 1]
Hệ IV: Ethyl acetat/methanol/acid formic [10 : 0,2 : 0,1]
Hệ V: Toluen/ethyl acetat/methanol/acid formic [8 : 6 : 0,3 : 0,7]
Hiện màu: quan sát dưới ánh sáng UV 254 và 366 nm; sau đó phun TT
Kết quả cho thấy hệ dung môi V cho sắc ký đồ có các vết tách rõ ràng và nhiều vết nhất. Hình 3.3 trình bày sắc ký đồ của cắn phân đoạn E khi triển khai với hệ dung môi V và quan sát ở các điều kiện khác nhau.
AS thường UV254 UV365 TT vanilin/H2SO4
Hình 3.3. Sắc kí đồ cắn phân đoạn ethyl acetat khi triển khai với hệ dung môi Toluen/ethyl acetat/methanol/acid formic [8 : 6 : 0,3 : 0,7]
3.1.4. Phân tích chất từ cắn phân đoạn n-hexan/ethyl acetat bằng GC-MS
Theo một số nghiên cứu nước ngoài, có thể phân tích thành phần sterol trong các phân đoạn dịch chiết kém phân cực bằng phương pháp sắc ký khí (GC) hoặc sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC – MS) [8] [23]. Do vậy, chúng tôi thử phân tích phân đoạn có độ phân cực thấp là n-hexan/ethyl acetat [5:1] bằng phương pháp GC - MS.
Để tránh làm tắc cột sắc ký khí, chúng tôi tiến hành tinh chế cắn phân đoạn HE qua sắc ký cột mở với chất nhồi cột là silicagel, dùng dung môi n-hexan (PA) để rửa giải. Sau đó dịch rửa giải thu được, được cất thu hồi dung môi tới cắn khô rồi hòa tan vào dung môi n-hexan để phân tích.
Điều kiện phân tích:
- Hệ thống GC: Agilent Technologies 7890A
- Hệ thống MS: Agilent Technologies 5975C
- Cột sắc ký: HP-5MS. Chiều dài cột: 30 m, đường kính cột: 0,25 mm
Chương trình khai triển:
- Mẫu phân tích: TPHE
- Tiêm mẫu tự động
- Thể tích tiêm mẫu: 1 microlit, không chia dòng
- Sử dụng khí mang Heli, tốc độ khí mang: 1 ml/phút
- Chương trình nhiệt độ:
Thời gian (phút) Nhiệt độ (oC)
Cột
0-1 50
1-41 50-250
41-61 250
Nhiệt độ hóa hơi 290
- Detector: MS
Phổ khối được so sánh với các thư viện Wiley, Flavor và Nist để phân tích kết quả. Kết quả cho thấy có 62 phối tử được phát hiện trong mẫu phân tích. Trong đó đa số là các dẫn chất alkan như octan, cyclohexan, dodecan, nonan, octadecan, hexadecane, eicosan…
3.1.5. Phân lập và nhận dạng chất từ cắn phân đoạn ethyl acetat 3.1.5.1. Phân lập
Chuẩn bị mẫu: Sử dụng cắn phân đoạn ethylacetat để tiến hành phân lập các chất. Cắn E được hòa tan trong một lượng tối thiểu ethyl acetat rồi trộn với một ít silicagel, sau đó cất thu hồi dung môi ở áp suất giảm, thu được một hỗn hợp bột khô, tơi, trơn chảy tốt, màu vàng xanh.
Chuẩn bị cột: Cột thủy tinh có khóa và nắp đậy kín, đường kính 4cm, chiều dài 60cm. Rửa sạch cột, sấy khô.
Chất nhồi cột: Lấy khoảng 60g silicagel kích thước 0,04 – 0,063 mm dùng cho
sắc kí cột. Hoạt hóa ở 110oC trong 1 giờ, sau đó để nguội trong bình hút ẩm.
Nhồi cột bằng phương pháp nhồi hạt ướt: Dùng dung môi n-hexan tạo hỗn dịch đồng nhất với chất hấp phụ silicagel. Nạp vào cột. Dùng khí nén để lớp silicagel được nén chặt và ổn định.
Nạp mẫu khô: Đưa từ từ bột mẫu đã chuẩn bị lên cột. Sau đó tiến hành rửa giải cột với hệ dung môi n-hexan/ethyl acetat gradient nồng độ, tỷ lệ từ [5 : 1], [3 : 1], [1 : 1], cuối cùng là [1 : 4].
Dung dịch rửa giải được hứng từng 20 mL vào ống nghiệm và kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng. Các ống nghiệm có sắc kí đồ tương tự được gộp chung thành một phân đoạn. Kết quả thu được 3 phân đoạn đáng chú ý, ký hiệu là E1, E2 và E3.
Phân đoạn E1 từ ống số 22 tới ống số 31, thấy xuất hiện tinh thể hình lưỡi liềm. Đem lọc, rửa, thu tinh thể không màu, kí hiệu TP-E1-1. Chất này ít tan trong ethyl acetat, tan được trong methanol.
Phân đoạn E2 từ ống số 94 tới ống 97, thấy có tủa trắng. Đem lọc và rửa tủa nhiều lần bằng n-hexan thu được bột vô định hình màu trắng, kí hiệu TP-E2-1.
Phân đoạn E3 từ ống số 247 tới ống số 292, kiểm tra bằng sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi khai triển ethyl acetat/methanol/acid formic [10:0,2:0,1], phát hiện
bằng TT vanillin/H2SO4 thấy xuất hiện 2 vết màu tím, trong đó có 1 vết đậm và 1
vết nhạt hơn. Cất thu hồi dung môi còn khoảng 5 mL, để kết tinh lạnh qua đêm, thu được chất vô định hình màu trắng. Lọc và rửa nhiều lần với dung môi n-hexan/ethyl acetat [1 : 1] lạnh, thu được bột vô định hình màu trắng, kí hiệu TP-ET-02.
Do lượng chất TP-E1-0 và TP-E2-1 ít và thời gian chưa cho phép nên trong nghiên cứu này chúng tôi không xử lý tiếp các chất này. Chất rắn TP-ET-02 được kiểm tra độ tinh khiết và đo phổ để xác định cấu trúc.
3.1.5.2. Kiểm tra độ tinh khiết của chất TP-ET-02
Kiểm tra độ tinh khiết của chất TP-ET-02 bằng sắc kí lớp mỏng, khai triển bản mỏng với 3 hệ dung môi sau:
Hệ II: Cloroform/ethyl acetat/acid formic [4 : 1 : 0,5]
Hệ III: Cloroform/methanol [4 : 1]
Kết quả cho thấy với các hệ dung môi khai triển khác nhau, chất TP-ET-02 không quan sát được ở ánh sáng thường, cũng như ánh sáng tử ngoại 254 nm, và đều chỉ cho 1 vết màu tím trên sắc kí đồ sau khi hiện màu bằng thuốc thử
vanillin/H2SO4. Chất TP-ET-02 có Rf lần lượt 0,17; 0,31; và 0,64 tương ứng với 3
hệ dung môi khai triển. Hình 3.4 là sắc ký đồ của chất TP-ET-02.
Hình 3.4. Sắc kí đồ của TP-ET-02 khai triển với các hệ dung môi I, II, và III khi hiện màu bằng TT vanillin/ H2SO4
Do vậy có thể sơ bộ kết luận rằng chất TP-ET-02 là tinh khiết.
3.1.5.3. Nhận dạng chất TP-ET-02
Tính chất lý hóa: thể vô định hình màu trắng. Ít tan trong EtOAc và CHCl3,
tan trong MeOH.
Phổ khối (MS-ESI): phổ negative chất TP-ET-02 cho pic phân tử [M-H-
2H2O]+ = 609 m/z và phổ positive cho pic phân tử [M+Na]+ = 597 m/z, vậy [M]+ =
574 m/z. Sở dĩ chúng tôi phải đo phổ khối 2 lần với 2 cách đo khác nhau để có được thông tin pic phân tử. Ở lần đo thứ nhất, phổ negative cho pic phân tử có số khối là
609 m/z, thông thường số khối này là số khối của pic [M-H]+, nhưng khi so số khối
này với phổ proton 1H-NMR của chất TP-ET-02 chúng tôi không thấy phù hợp nên
đã đề xuất đo phổ khối positive. Kết quả phổ khối positive phù hợp với khung cấu
trúc chúng tôi dự đoán hơn (có 35 tín hiệu carbon trên phổ 13C-NMR) , đặc biệt việc
xuất hiện pic mảnh có số khối m/z 413 tương ứng với [M-đường+H]+. Do vậy chất
TP-ET-02 có công thức phân tử là C35H58O6 hay C29H47 – O – C6H11O5, trong đó
phần đường được dự đoán là đường glucose và phần aglycon được dự đoán là stigmasterol hoặc đồng phân của stigmasterol.
Hình 3.5. Phổ khối MS-ESI positive của chất TP-ET-02.
Thực vậy phổ 1H-NMR và 13C-NMR chất TP-ET-02 được đo trong dung môi
DMSO-d6, ở tần số 500 MHz cho tín hiệu đặc trưng của khung cấu trúc stigmasterol hoặc đồng phân của stigmasterol và 1 phân tử đường glucose. Như vậy phần aglycon có thể là stigmasterol, hoặc β-sitosterol hoặc spinasterol.
Để dự đoán phần aglycon có cấu trúc sterol chúng tôi dựa vào 3 vùng tín
hiệu trên phổ 1H-NMR như sau: tín hiệu của các nhóm methyl; tín hiệu của proton
olefin trong vòng; tín hiệu của proton olefin ngoài vòng (phân biệt cấu trúc stigmasterol với β-sitosterol).
Trên phổ 1H-NMR của chất TP-ET-02 xuất hiện tín hiệu của 6 nhóm metyl
trong đó có 2 tín hiệu singlet tại độ dịch chuyển hóa học là 0,67 và 0,96 ppm (tương ứng với H-18 và H-19), 3 tín hiệu doublet tại δ 0,78 (H-27), δ 0,83 (H-26) (có cùng
hằng số tương tác J = 5,0 Hz là tương tác germinal của 2 nhóm metyl gắn vào nhóm
metin (CH3-CH)) và δ 1,00 (H-21) ppm (J = 6,5 Hz) và 1 tín hiệu triplet tại 0,78
ppm (H29) là tương tác của nhóm metyl gắn vào nhóm metylen (CH3-CH2). Với tín
hiệu 6 nhóm metyl này cho chúng tôi nhận dạng sơ bộ ban đầu chất TP-ET-02 có cấu trúc sterol. Để phân biệt với triterpenoid cấu trúc 5 vòng, ví dụ như nhóm oleanan các tín hiệu của nhóm metyl là singlet và có 7 nhóm metyl.
Hai chất stigmasterol và β-sitosterol có công thức như hình dưới đây, thực tế trên phổ proton chỉ khác nhau ở tín hiệu của proton olefin ở mạch nhánh (H-22 và H-23), còn lại các tín hiệu của 6 nhóm metyl và proton H-6 là giống nhau.
Stigmasterol β-Sitosterol Hình 3.6. Cấu trúc của stigmasterol và sitosterol
Trên phổ 1H-NMR vùng từ 5,0 ÷ 5,4 ppm, có nhóm tín hiệu của 3 proton
olefin tại 5,32 ppm (H-6) và 5,15 ppm và 5,05 ppm là 2 proton olefin ở vị trí trans
có hằng số tương tác J = 15 Hz. Đây là tín hiệu của 3 proton olefin của phần
Hình 3.7. Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của chất TP-ET-02 (4,9÷5,4 ppm)
Tiếp theo, ở vùng trường từ 4 ÷ 4,9 ppm cho tín hiệu của proton anomer tại δ
4,2 (J=7,5 Hz) cùng với vùng tín hiệu proton ở δ 4,39 và 4,84 ppm cho thấy sự có
mặt của 1 phân tử đường glucose trong phân tử hợp chất (hình 3.8).
Hình 3.8. Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) của chất TP-ET-02 (4,2÷4,9 ppm)
Như vậy, ban đầu dựa trên phổ 1H-NMR và phổ khối, chúng tôi nhận dạng