Nghiên cứu chiết tác enzym protease bằng amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy bacillus subtilis natto

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến Bảng 3.3: Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã Bảng 3.4: Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2013

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

ĐINH THỊ THANH THẢO

NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Bacillus subtilis natto

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

LỜI CẢM ƠN

Với tất cả sự kính trọng và lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lời cảm ơn

chân thành nhất tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân – Giảng viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội và DS Đinh Thu Hương, những

người đã luôn quan tâm, tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trên con đường học tập, nghiên cứu khoa học

Đồng thời, tôi cũng xin cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh cùng toàn thể các thầy,

cô giáo, các anh chị kỹ thuật viên bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, các thầy

cô giáo trong trường và tất cả bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Hà Nội, tháng 5 năm 2013

Sinh viên

Đinh Thị Thanh Thảo

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 2

1.1 Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật 2

1.1.1 Enzym vi sinh vật 2

1.1.2 Chiết xuất và thu nhận enzym từ vi sinh vật 3

1.1.3 Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym 6

1.1.4 Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus 6

1.2 Phương pháp chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 9

1.2.1 Đặc điểm của Bacillus subtilis natto 9

1.2.2 Đặc điểm của protease ngoại bào của B subtilis natto 10

1.2.3 Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B subtilis natto 11

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 14

2.1.1 Vi sinh vật sử dụng 14

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 14

2.1.3 Môi trường 14

2.1.4 Máy móc và dụng cụ 14

2.2 Nội dung nghiên cứu 15

2.2.1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 15

2.2.2 Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được 15

2.3 Phương pháp nghiên cứu … 15

2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto 15

2.3.2 Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính các nhóm enzym 16

2.3.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease 17

2.3.4 Phương pháp chiết xuất và tinh sạch protease 17

2.3.5 Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease 19

2.3.6 Phương pháp điện di SDS – PAGE 21

2.3.7 Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin 21

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN 22

3.1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto………… 22

3.1.1 Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto 22

3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B subtilis natto 23

3.1.3 Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B subtilis natto 26

3.2 Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được 32

3.2.1 Tinh chế protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G – 75 32

3.2.2 Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế 36

3.2.3 Sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

trao đổi là cation carboxymethyl

Sắc kí trao đổi ion DEAE : Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm

trao đổi là anion diethylaminoethyl

giải fibrin của chất nghiên cứu)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus 7

Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B

Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến

Bảng 3.3: Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã

Bảng 3.4: Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột,

CMC của các dịch enzym khi chiết xuất với các nồng

độ amoni sulfat bão hòa khác nhau

27

Bảng 3.5: Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ

protease của các dịch enzym khi chiết xuất với các

nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau

29

Bảng 3.6: Khả năng phân giải casein, nồng độ protein và hoạt

độ protease của các dịch enzym thu được theo quy

trình kết tủa phân đoạn

31

Bảng 3.7: Kết quả thử khả năng phân giải casein của các phân

Bảng 3.8: Đánh giá sự có mặt của α – amylase và cellulase trong

các phân đoạn

34

Bảng 3.9: Kết quả các giai đoạn tách chiết và tinh chế protease 35

Bảng 3.10: Kết quả đo đường kính vòng phân giải fibrin 38

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ

Hình 1.1: Cơ chế thủy phân phân tử protein của protease 6

Hình 1.2: Năng suất và mức tinh sạch của protease chiết xuất từ

Hình 1.3: Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới

Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn B subtilis natto 10

Hình 3.1: Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein

Hình 3.2: Biểu đồ mẫu định lượng protein theo phương pháp

Hình 3.3: Khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của các

dịch enzym khi chiết xuất với các nồng độ amoni

sulfat bão hòa khác nhau

28

Hình 3.4: Mối liên hệ giữa hoạt tính enzym protease

Hình 3.5: Kết quả điện di SDS – PAGE 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay, các chế phẩm enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống con người Trong số đó, protease – enzym phá vỡ liên kết peptid giữa các acid amin của protein – là enzym có nhiều ứng dụng trong một số ngành như chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt trong lĩnh vực y tế, các protease đã được sử dụng làm thuốc điều trị và cho hiệu quả tốt

Bên cạnh các protease thu nhận được từ các tổ chức của động vật (renin, tripsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật cũng đang được nghiên cứu để tìm ra các phương pháp tách chiết tối ưu Một trong số các loài vi sinh vật có khả năng sinh ra protease và được ứng dụng nhiều là vi khuẩn

thuộc chi Bacillus [55]

Vi khuẩn Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis

được biết đến là “nguyên liệu” ủ cùng với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên món

ăn truyền thống Natto của Nhật Bản Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật đã phát hiện ra trong Natto có chứa nattokinase – một enzym thuộc nhóm các enzym protease có khả năng phân giải fibrin [53] Từ đó đến nay, nhiều nghiên cứu về

Bacillus subtilis natto đã được tiến hành và kết quả cho thấy chủng vi khuẩn này có

khả năng sinh ra nhiều enzym nhóm protease như nattokinase [31], elastase [62], bacillopeptidase F [64]…

Bacillus subtilis natto có khả năng sinh tổng hợp protease nhưng vấn đề đặt

ra là làm cách nào để có thể thu được protease từ môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu tách chiết enzym protease bằng amoni sulfat từ môi

trường nuôi cấy B subtilis natto” được thực hiện với hai mục tiêu:

1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto

2 Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.3 Enzym vi sinh vật và phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật

1.3.1 Enzym vi sinh vật

Enzym là các chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao, phần lớn có bản chất là protein; có ở trong tất cả các tế bào sống và có thể duy trì được hoạt tính xúc tác sau khi tách ra khỏi cơ thể sống (ở những điều kiện nhất định) [2],[8],[14]

Ngày nay, người ta có thể tổng hợp enzym bằng phương pháp hóa học (các synzym), tìm ra các kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có hoạt tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số các enzym hiện nay vẫn được chiết tách

từ các tổ chức của động vật; thực vật; và chủ yếu là từ vi sinh vật [3],[8]

Vi sinh vật là nguồn thu enzym rất phong phú trong đó có những enzym mà

cơ thể động vật và thực vật không thể tổng hợp được Vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym với một lượng lớn, trong thời gian ngắn Con người có thể tác động vào vi sinh vật để thu được enzym theo ý muốn Mặt khác enzym vi sinh vật thường

có hoạt tính mạnh [14],[17],[36]

Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ

yếu:

 Phân lập, tuyển chọn và cải tạo giống vi sinh vật

 Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym

 Chiết tách và thu nhận enzym

 Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym

Quá trình phân lập, tuyển chọn, cải tạo giống vi sinh vật nhằm tạo ra giống vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp enzym nghiên cứu với hiệu quả cao; sử dụng các biện pháp như: gây đột biến bằng tác nhân vật lý, hóa học, sinh học phân tử (biến nạp, tải nạp, tiếp hợp gen) [14],[17],[36]

Quá trình nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym được thực hiện bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt hoặc phương pháp nuôi cấy chìm Cần lựa chọn thành phần môi trường dinh dưỡng (đặc biệt là các chất cảm ứng); kiểm soát các thông số

của quá trình nuôi cấy như: nhiệt độ, pH, chế độ cấp khí… để quá trình sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật được diễn ra trong điều kiện tối ưu [14],[17],[36]

1.3.2 Chiết tách và thu nhận enzym từ vi sinh vật

Các bước của quá trình chiết tách và tinh sạch enzym từ vi sinh vật được tiến hành như sau:

a) Phá vỡ tế bào

Thực hiện với các enzym tập trung chủ yếu ở trong tế bào vi sinh vật (enzym nội bào) Đối với các enzym được xuất tiết ra khỏi tế bào vào môi trường nuôi cấy (enzym ngoại bào) có thể bỏ qua bước này Các phương pháp hay được sử dụng để phá vỡ tế bào: phương pháp cơ học (sử dụng sóng siêu âm, máy đồng hóa cao áp…); các phương pháp khác (sốc thẩm thấu, xử lý kiềm, sử dụng các chất tẩy rửa, dung giải bằng enzym, phương pháp “tự phân”…) Đối với những enzym tồn tại ở dạng gắn chặt vào màng tế bào thì phải sử dụng các chất tẩy không phân cực để tách

enzym ra khỏi màng [6],[14],[26],[36]

b) Chiết tách enzym

Sử dụng dung môi để chiết tách enzym như: nước, acid, kiềm loãng, dung dịch đệm, dung môi hữu cơ Nếu dịch chiết enzym có nồng độ thấp có thể cô đặc để tăng nồng độ enzym Thông thường, người ta hay dùng các dung dịch đệm có lực ion và pH thích hợp để chiết tách enzym [3],[14] Sau khi chiết tách tiến hành các bước sau:

Tách các phần tử không hòa tan: Dùng kỹ thuật li tâm, lọc [6],[14],[36] Loại các thành phần không phải protein: Chất phân tử lượng thấp (thẩm

tích, lọc gel, siêu lọc); acid nucleic (thủy phân bằng nuclease, protease); lipid (sử dụng dung môi hữu cơ) [6]

Tách phân đoạn protein và enzym: Tùy theo đặc tính của enzym như trọng

lượng phân tử, điện tích hay tính ổn định mà có các kỹ thuật tách chiết và tinh chế khác nhau [3],[14] Các nhóm phương pháp cụ thể thường được sử dụng bao gồm:

 Kết tủa enzym: Do đa số các enzym có bản chất là protein nên có thể sử dụng các yếu tố như pI, lực ion, trọng lượng phân tử… để kết tủa enzym từ dịch

chiết Phương pháp thường được sử dụng để kết tủa enzym là phương pháp diêm tích và phương pháp sử dụng dung môi hữu cơ [5],[6],[36]

Phương pháp diêm tích: Enzym có thể được kết tủa bằng muối do hiện tượng

“salting out” (tính tan của protein enzym giảm mạnh ở nồng độ muối cao) Mỗi enzym có một khoảng nồng độ muối mà enzym đó bị kết tủa hoàn toàn gọi là khoảng nồng độ muối tách; do đó nên tiến hành kết tủa phân đoạn nhằm thu được enzym mong muốn [6],[14],[26] Các loại muối được dùng để kết tủa enzym theo phương pháp này bao gồm: amoni sulfat, magnesi sulfat, natri sulfat… trong đó amoni sulfat hay được sử dụng nhất do có một số ưu điểm sau:

+ Amoni sulfat có mức độ hòa tan rất cao trong nước (720g/l ở 250C)

+ Ít làm mất hoạt tính enzym, có thể có tác dụng làm bền enzym

+ Có khả năng kết tủa chọn lọc protein enzym khi bổ sung từ từ muối vào dịch chiết enzym thô [3] Một ưu điểm khác của amoni sulfat là giá thành thấp [5]

Tuy nhiên, kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat còn có một số nhược điểm như: mất nhiều thời gian; nồng độ muối sử dụng thường cao nên tỷ trọng của dung môi lớn, để thu được protein enzym cần phải ly tâm ở tốc độ cao và nhiệt độ thấp Mặt khác, cần tiến hành tinh chế loại muối ra khỏi tủa enzym bằng phương pháp thẩm tích hoặc sắc kí lọc gel [3],[26]

Phương pháp kết tủa enzym bằng dung môi hữu cơ ở nhiệt độ thấp: Dung môi hữu cơ (có khả năng trộn lẫn với nước) được thêm vào dịch chiết enzym sẽ làm giảm hằng số điện môi của dung dịch, làm giảm độ tan của protein enzym và tạo kết tủa Các dung môi dùng phổ biến: aceton, ethanol, isopropanol Để hạn chế ảnh hưởng của dung môi đến hoạt tính của enzym cần tiến hành ở nhiệt độ thấp (dưới

00C) [5],[6],[14]

Ngoài ra khi kết tủa enzym còn sử dụng các phương pháp khác như: kết tủa enzym tại điểm đẳng điện, sử dụng các chất trợ (tinh bột, lactose) để cho tủa enzym tạo thành ở dạng hạt hay sử dụng dung dịch polymer để kết tủa enzym [14]

 Phương pháp sắc kí: Nguyên tắc của sắc kí trong chiết tách và tinh sạch enzym là tách các enzym khác nhau từ dịch chiết dựa vào bản chất các liên kết của

phân tử enzym đó Các enzym khác nhau sẽ di chuyển qua cột theo pha động với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào tương tác giữa pha tĩnh, pha động và enzym; do đó

có thể tách riêng được enzym Một số loại sắc kí và nguyên lí tách được trình bày

trên bảng 1.1 [5],[6],[14],[17],[26],[36]

Bảng 1.1: Các phương pháp sắc kí Loại sắc kí Nguyên lí Tách theo

Tương tác đặc hiệu

sinh học

Tương tác sinh học đặc hiệu (enzym – cơ chất) Cấu trúc phân tử

Quá trình chiết tách và tinh chế enzym thường sử dụng phương pháp sắc kí lọc gel (sắc kí lọc rây phân tử) Mỗi loại gel thường có khả năng tách và tinh chế các enzym có trọng lượng phân tử nằm trong một khoảng giới hạn thích hợp Gel được sử dụng rộng rãi nhất là gel Sephadex Gel Sephadex có đặc điểm là trung hòa

về điện tích nên không có tương tác anion và cation Dựa vào kích thước mắt lưới của mạng lưới rây phân tử và phạm vi phân tách các chất theo trọng lượng phân tử,

Sephadex được chia thành 5 loại theo bảng 1.2 Chỉ số càng nhỏ thì kích thước mắt

Loại gel Sephadex

Phạm vi phân tách theo TLPT (kDa)

điện di không gây biến tính protein Sau khi tách chiết và tinh chế, dịch enzym thu được có thể được cô đặc bằng phương pháp siêu lọc, đông khô hoặc cô chân không [3],[14]

1.3.3 Kiểm tra độ sạch của chế phẩm enzym

Điện di trên gel polyacrylamid biến tính có mặt SDS (SDS – PAGE): là phương pháp hay được sử dụng nhất Phương pháp này sử dụng gel và đệm có chứa SDS Dưới tác dụng của SDS, các protein enzym sẽ bị duỗi thẳng, tích điện âm và

di chuyển về phía cực dương trong điện trường Tốc độ di chuyển phụ thuộc vào trọng lượng phân tử của protein enzym Dựa vào các băng điện di xuất hiện trên điện di đồ sau khi nhuộm màu để kiểm tra mức độ tinh sạch của chế phẩm [14]

Ngoài ra có thể dùng một số phương pháp khác như: phương pháp phối hợp điện di với sắc kí lọc gel; điện di gel hoạt tính; kỹ thuật phân tích khối phổ hay xác định hoạt độ riêng của chế phẩm enzym [3],[6],[14]

1.3.4 Protease và chiết tách protease ngoại bào của vi sinh vật thuộc chi Bacillus

Hiện nay, các enzym vi sinh vật được sử dụng ngày càng phổ biến trong nhiều lĩnh vực; trong số đó có các enzym nhóm protease

a) Khái niệm về protease

Nhóm enzym protease là các enzym xúc tác quá trình thủy phân liên kết peptid (– CO – NH –) giữa các L – acid amin trong phân tử protein, polypeptid đến

sản phẩm cuối cùng là các L – acid amin (hình 1.1) Ngoài ra, nhiều protease cũng

có khả năng thủy phân liên kết ester và vận chuyển acid amin [12]

Hình 1.1: Cơ chế thủy phân phân tử protein của protease

Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) trong hệ thống phân loại các nhóm enzym [2] Có nhiều cách phân loại protease:

H 2 O

Protease

+ Phân loại theo pH tối ưu cho hoạt tính xúc tác của enzym, protease được chia thành 3 nhóm: protease acid (pH hoạt động từ 2 – 4); protease trung tính (pH hoạt động từ 7 – 8); protease kiềm (pH hoạt động từ 9 – 11) [12]

+ Phân loại theo vị trí tác dụng đặc hiệu với cơ chất, protease được chia thành hai loại: endopeptidase (protease thủy phân liên kết peptid ở phần giữa mạch polypeptid) và exopeptidase (protease phân cắt liên kết peptid ở đầu mạch polypeptid) [12] Các endoprotease có nhóm OH của Ser đóng vai trò quan trọng trong hoạt động xúc tác được gọi là protease serin Trong protease serin có hai họ được nghiên cứu nhiều là: chymotrypsin và subtilisin Đa số protease họ subtilisin

có nguồn gốc từ vi khuẩn như: subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN [12],[55] b) Protease ngoại bào của chi Bacillus và các phương pháp chiết tách

Chi Bacillus là chi vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp mạnh protease và

có nhiều ứng dụng trong công nghiệp; sản lượng protease trên 100 tấn/năm

[14],[36] Các sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus và một số ứng dụng

của chúng được đưa ra trong bảng 1.3

Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào của chi Bacillus [55]

phẩm

Novo Nordisk,

Đan Mạch

Hiện nay, quy trình chiết tách protease ngoại bào của chi Bacillus vẫn được

nghiên cứu cả trên quy mô PTN và quy mô công nghiệp

 Quy mô PTN: Quy trình chiết tách protease ngoại bào của loài Bacillus

subtilis thuộc chi Bacillus được nghiên cứu nhiều (bảng 1.4) Phương pháp chiết

tách hay được sử dụng là kết tủa bằng amoni sulfat 40 – 80% bão hòa; tinh chế bằng phương pháp thẩm tích và sắc kí

Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B subtilis

Thẩm tích Sắc kí lọc gel Sephadex G – 100 Điện di SDS – PAGE

4 Ravi Sankar

(2012) [59]

Sắc kí lọc gel Sephadex G – 100 Sắc kí trao đổi ion (DEAE) Điện di SDS – PAGE

5 F Mashayekhi

Mazar (2012) [43]

Hệ 2 pha: PEG 10.000 22%; citrat 18%

Hiệu quả và mức tinh sạch của chế phẩm enzym so với dịch chiết enzym thô

ban đầu của một số quy trình chiết tách protease theo thứ tự trong bảng 1.4 (từ quy trình 1 đến 5) được thể hiện trên đồ thị hình 1.2 Nhìn chung, hiệu quả của quy

trình chiết tách trên quy mô PTN sử dụng phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat (thứ tự từ 1 đến 4) thường nhỏ hơn 10% [30],[23],[22],[59],[43],[27]

Ở Việt Nam, ngoài nghiên cứu của Do Thi Bich Thuy, Trần Thị Hồng Nghi

bước đầu đã nghiên cứu khả năng ứng dụng protease của B subtilis làm chất thủy

phân phụ phẩm trong công nghiệp thủy sản với kết quả khả quan [9]

Hình 1.2: Hiệu quả và mức tinh sạch của protease

chiết tách từ môi trường nuôi cấy B subtilis

 Quy mô công nghiệp: Quy trình chiết tách một enzym ngoại bào họ subtilisin

của Bacillus sp theo phương pháp kết tủa bằng amoni sulfat trên quy mô công

nghiệp được thể hiện trên hình 1.3 Trong quy trình này, mầm kết tinh được thêm

vào để tủa tạo thành dưới dạng tinh thể Sản phẩm là subtilisin dưới dạng muối halogen [17],[36],[55]

Hình 1.3: Quy trình kết tinh công nghiệp của subtilisin dưới dạng muối halogen

1.4 Phương pháp chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis

natto

1.4.1 Đặc điểm của Bacillus subtilis natto

Tên khác: Bacillus subtilis subsp natto; Bacillus subtilis var natto

Bacillus subtilis natto là vi sinh vật thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis

được giáo sư Sawamura phân lập và định danh lần đầu tiên vào năm 1905 [57]

Các nghiên cứu theo

thứ tự bảng 1.4

Giá trị

Siêu lọc, cô đặc Tách tế bào, thu dịch trong

Lên men

Dung môi Nước rửa

Mầm kết tinh

Muối

Chất thải

a) Phân loại khoa học

Giới: Bacteria; Ngành: Firmicutes; Lớp: Bacilli; Bộ: Bacillales; Họ:

Bacillaceae; Chi: Bacillus; Loài: Bacillus subtilis [29] Phân loại dưới loài:

Bacillus subtilis natto [29],[57]

Khi mới được phát hiện ra, Bacillus natto được coi như là một loài vi sinh vật mới Hiện nay, dựa trên kết quả phân tích ADN nhiễm sắc thể B nato và B subtilis của Seki năm 1975 và Tamang năm 2002 [61],[65]; các khóa phân loại đã xếp B subtilis natto là một dòng thuộc loài B subtilis nhưng phân biệt với các dòng khác là có khả năng lên men tạo sản phẩm Natto [57] Trong dòng B subtilis natto còn có nhiều loại như B subtilis natto B – 12 [67], B subtilis natto OK2 [24] … b) Đặc điểm của B subtilis natto

B subtilis natto là trực khuẩn hình que, dị dưỡng, hiếu khí, bắt màu Gram (+),

nội bào tử hình que có kích thước dưới 1µm Các tế bào vi khuẩn đứng riêng rẽ hay

nối với nhau thành chuỗi (hình 1.4) B subtilis natto phát triển tối ưu trong khoảng

nhiệt độ từ 37 – 430C, pH trung tính Sự phát triển của vi khuẩn bị ức chế bởi nhiệt

độ lớn hơn 550C và pH ≤ 4,5 B subtilis natto có khả năng sinh bào tử và nhiệt độ

thích hợp cho sự nảy mầm của bào tử là 400C [57]

Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn B subtilis natto [75]

1.4.2 Đặc điểm của protease ngoại bào của B subtilis natto

Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, B subtilis natto có khả năng sinh

tổng hợp nhiều nhóm enzym ngoại bào khác nhau như: Nhóm enzym γ–transpeptidase theo Noda năm 1989 [50] và Ogawa năm 1991 [70]; amylase theo K Yamane năm 1974 [40]; phytase theo M Shimizu năm 1992 [58]; cellulase theo

Bào tử

Tế bào vi khuẩn

Sun Yan năm 2011 [63]; và nhóm enzym được nghiên cứu nhiều nhất là protease [31],[39],[44],[64],[67],[71]

B subtilis natto là vi khuẩn thuộc loài Bacillus subtilis Protease ngoại bào của loài B subtilis được tăng cường sản xuất và tiết ra bên ngoài tế bào vi khuẩn

vào cuối pha lũy thừa cùng với thời điểm bắt đầu hình thành bào tử Hai protease chính được sản xuất trong thời gian này là protease serin kiềm (subtilisin) và

protease trung tính [52],[56]

Đặc điểm của một số protease ngoại bào của B subtilis natto như sau:

 Nattokinase: là một enzym thuộc họ subtilisin; tên khác: subtilisin NAT hay

subtilisin BSP Kí hiệu: EC 3.4.21.62 Cấu tạo gồm một chuỗi polypeptid đơn có

275 gốc acid amin và không có cầu nối disulfua trong phân tử TLPT: 27,7kDa đến 29kDa; pI = 8,6 ± 0,3; ổn định trong khoảng pH từ 6 – 10, nhiệt độ <500C; được hoạt hóa bởi Zn2+; bị bất hoạt bởi điều kiện pH <5, nhiệt độ ≥700C và các ion Fe3+,

Al3+ Trung tâm hoạt động là bộ ba xúc tác: Ser, His và Asp Cơ chất đặc hiệu: Suc – Ala – Ala – Pro – Phe – pNA [31],[67]

 Elastase: Theo nghiên cứu của Sumi, elastase có TLPT: 20kDa, pI = 8,7

[62] Elastase mới do Muramatsu nghiên cứu có TLPT: 29,8kDa, pI = 8,5; ổn định hoạt tính trong khoảng pH từ 8 – 9; nhiệt độ 500C; bị bất hoạt bởi diisopropyl fluorophosphat, phenyl methyl sulphonyl fluorid và ion kim loại [44]

 Bacillopeptidase F: có TLPT khoảng 34kDa Trung tâm hoạt động là bộ ba

xúc tác: Ser, His, Asp [64]

 Protease serin có TLTP 90kDa: có TLPT khoảng 90kDa; pH và nhiệt độ tối

ưu cho hoạt động của enzym là 10 và 550C, pI = 3,9 Trung tâm hoạt động là bộ ba

xúc tác: Asp33, His81, Ser 259 [39],[71]

1.4.3 Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào của B subtilis natto

Các nghiên cứu về quy trình chiết tách các protease ngoại bào của B subtilis

natto trên quy mô PTN được nêu ra trong bảng 1.5 Phương pháp chiết tách hay

dùng là kết tủa protease bằng amoni sulfat 60% bão hòa Tinh chế bằng cách kết hợp nhiều phương pháp khác nhau Nhìn chung hiệu quả và mức tinh sạch enzym

sau chiết tách của các quy trình là rất khác nhau Tuy nhiên, các nghiên cứu chiết

tách protease ngoại bào của B subtilis natto đã cho thấy vi khuẩn này có nhiều tiềm

năng ứng dụng sản xuất protease phục vụ cho công nghiệp dược phẩm [57]

Bảng 1.5: Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B subtilis natto

Tetsuya Kato

(1992)

[39]

Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl, Butyl – toyopearl HW – 50F Sắc kí lỏng hiệu năng cao Fujita M

Thẩm tích Sắc kí kị nước Butyl – toyopearl Sắc kí trao đổi ion CM – toyopearl Sắc kí lọc gel Sephadex G – 50 Sumi H

(1999) [62]

Tách lấy E thô: NaCl 0,9%

Kết tủa enzym ở pI = 8,7

Sắc kí lọc gel Điện di SDS – PAGE Muramatsu

K (2000)

[44]

Sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 Hiệu quả: 10% Mức tinh sạch: 46,5 Huang Jun

(2005) [35]

Sắc kí trao đổi ion Hiệu quả: 77% Mức tinh sạch: 6,27

S Tokudome

(2005) [64]

Tách lấy E thô: nước Loại tạp: siêu lọc Làm giàu protein: cô dưới

áp suất giảm

Sắc kí kị nước Butyl – Toyopearl Quá trình tinh chế được lặp lại nhiều lần

Mức tinh sạch: 56,1 Xiaoyan Zu

(2010)

[73]

Tách lấy E thô: NaCl 0,9%

Kết tủa enzym: Ethanol 95%; AS 20% bh

Siêu lọc qua màng UF-1, UF-5 OPS Đông khô thu chế phẩm enzym Hiệu quả: 0,18%

Ở Việt Nam, quy trình chiết tách protease ngoại bào của B subtilis natto

chưa được tiến hành nghiên cứu nhiều Những năm gần đây, một số nghiên cứu về

nattokinase và enzym họ subtilisin của B subtilis đã được thực hiện như:

Năm 2008, Nguyễn La Anh và Đặng Thu Hương đã tách chiết enzym

nattokinase (fibrinase) từ dịch nuôi cấy B subtilis NT5, enzym có TLPT khoảng

27kDa, pI = 7,04; nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt tính enzym là 600C và 7,5; các điều kiện ổn định enzym là Ca2+ và Mg2+ với nồng độ 5 – 10 mM, pH = 7 – 7,8 Enzym đã được áp dụng làm thực phẩm chức năng làm tan tơ huyết bệnh lý thử nghiệm trên 24 đối tượng và cho kết quả khả quan [1]

Năm 2008, Nguyễn Thị Thảo và cộng sự đã nhân dòng, phân tích trình tự và

biểu hiện gen mã hóa subtilisin từ các chủng B subtilis G1 và RD23 trong E coli

BL21/pESUb [16]

Năm 2012, Lê Thị Bích Phượng và nhóm nghiên cứu ở Viện Sinh học

nhiệt đới và Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam đã phân lập, tuyển chọn được hai

chủng Bacillus sp.7.2, Bacillus sp.NP3 có khả năng sinh tổng hợp mạnh enzym

nattokinase (470 FU/g), chiếm khoảng 70 – 85% so với hoạt tính protease tổng [11]

Trong các protease ngoại bào của B subtilis natto, nattokinase có nhiều tiềm

năng được ứng dụng làm dược phẩm Bên cạnh các nghiên cứu về quy trình chiết

tách nattokinase; các nghiên cứu invivo, tiền lâm sàng và lâm sàng của Fujita năm

1995, Maruyama năm 1998, M Haritha năm 2011 đã chứng minh nattokinase có tác dụng làm tan cục máu đông và phòng chống huyết khối thông qua các cơ chế: trực tiếp giáng hóa fibrin trong cục máu đông; hoạt hóa quá trình tổng hợp t – PA trong huyết tương; thúc đẩy quá trình biến đổi plasminogen thành plasmin; tăng cường plasmin nội sinh [34],[46],[48] Năm 2009, kết quả của Kim J đã chỉ ra nattokinase có vai trò trong việc phòng ngừa và điều trị tăng huyết áp [38] Hiện nay, trên thị trường đang lưu hành một số thực phẩm chức năng chứa nattokinase dưới dạng viên nang nhập khẩu từ Nhật Bản và Mỹ như: Nattospes (3.000 FU/g), Japato (600 FU/g), Nattokinase plus TM (3.000 FU/g), Dosaka (300 FU/g) [11]

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1.Vi sinh vật sử dụng

Bacillus subtilis natto – Nhật Bản

2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng

Nguyên liệu và hóa chất sử dụng được đưa ra trong bảng 2.1

Bảng 2.1: Nguyên liệu và hóa chất

Nattospes

(300FU/viên)

Công ty IMC

Cách pha chế một số dung dịch hóa chất sử dụng trong đề tài được đưa ra

Bảng 2.2: Thiết bị được sử dụng

Các dụng cụ được sử dụng: Bình nón, bình định mức, cốc có mỏ, đĩa petri nhựa (đường kính 8,8cm), ống nghiệm, pipetman, pipet tip, thước kẹp Palmer…

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto

 Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto

 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào của B

subtilis natto

 Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B subtilis

natto

2.2.2 Sơ bộ tinh chế và xác định một số đặc tính của protease thu được

 Tinh chế protease bằng phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G – 75

 Điện di một số phân đoạn thu được sau tinh chế

 Sơ bộ thử khả năng phân giải fibrin của mẫu nghiên cứu

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp giữ giống và nuôi cấy Bacillus subtilis natto

a) Phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng

Pha môi trường thạch thường (theo phần 2.1.3), đun cho đồng nhất Chia đều

môi trường vào trong các ống nghiệm (5 – 6ml/ống), nút kín Hấp tiệt khuẩn ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn xong, đặt nghiêng các ống nghiệm và để nguội cho thạch đông lại Tiến hành cấy truyền từ ống giống gốc sang ống môi

trường mới theo hình ziczac Đặt các ống đã cấy giống vào tủ ấm, ủ ở 370C/24 giờ

1 – 2 tháng/lần [4],[10]

b) Phương pháp nhân giống trong bình nón

Pha 20ml môi trường canh thang (theo phần 2.1.3) cho vào bình nón 50ml,

nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để môi trường nguội xuống dưới 400C, dùng que cấy vô khuẩn cấy khuẩn lạc trong ống giống vào môi trường Nuôi trên máy lắc ở 370C/24 giờ, tốc độ lắc 100 vòng/phút [4],[10]

c) Phương pháp lên men

Pha 100ml môi trường canh thang (theo phần 2.1.3) cho vào bình nón 250ml,

nút kín Hấp tiệt khuẩn môi trường ở điều kiện 1atm/20 phút Sau khi tiệt khuẩn, để

trường mới với tỷ lệ cấy truyền là 10% Nuôi trên máy lắc ở 370C/24 giờ, tốc độ lắc

100 vòng/phút [4],[10]

2.3.2 Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính các nhóm enzym

a) Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính protease

Nguyên tắc: Dùng “casein” làm cơ chất, xác định khả năng phân giải protein của protease trên cơ sở đo vòng phân giải casein trên đĩa thạch [4]

Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% casein và 2% thạch trong cốc có

mỏ 200ml, thêm 10 giọt xanh methylen, khuấy đều và đun cho đồng nhất Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa petri Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch Ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ và đọc kết quả [15]

b)Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính amylase

Nguyên tắc: amylase có khả năng phân giải tinh bột thành các oligosaccharid

chất xác định sự tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính amylase có trong dịch chiết enzym [4]

Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 1% tinh bột và 2% thạch trong cốc có

mỏ 200ml, khuấy đều và đun cho đồng nhất Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa petri Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch Ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ Dùng Lugol nhỏ lên bề mặt thạch

để quan sát vòng phân giải tinh bột [4]

c) Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính cellulase

Nguyên tắc: Cellulase có khả năng phân giải CMC thành các oligosaccharid

tồn tại và sơ bộ thử hoạt tính cellulase có trong dịch chiết enzym [4],[10]

Tiến hành: Pha 100ml dung dịch chứa 0,5% CMC và 2% thạch trong cốc có

mỏ 200ml (chú ý ngâm cho CMC trương nở hoàn toàn), đun cho đồng nhất Đổ 16ml dung dịch trên vào các đĩa petri Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 370C/24 giờ Dùng Lugol nhỏ lên bề mặt thạch để quan sát vòng phân giải CMC [4]

2.3.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease

Xác định pH của dịch nghiên cứu Sau đó phân phối dịch vào các cốc có mỏ (10ml/1 cốc) Điều chỉnh pH đến giá trị pH nghiên cứu bằng cách thêm từng giọt dung dịch NaOH 0,1M hoặc HCl 0,1M (có kết hợp khuấy từ) Để ổn định 1 giờ ở nhiệt độ phòng Tiến hành thử khả năng phân giải casein của dịch nghiên cứu trước

và sau khi đã điều chỉnh pH theo mục a phần 2.3.2 [67]

2.3.4 Phương pháp chiết tách và tinh sạch protease

a) Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat

Nguyên tắc: Khi thêm muối vào dung dịch protein enzym; tính tan của protein enzym tăng nhẹ (salting in) ở nồng độ muối thấp và giảm mạnh (salting out)

ở nồng độ muối cao Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình solvat hóa, giảm tính hòa tan của protein enzym dẫn đến sự tủa [5],[26]

Tiến hành:

 Khảo sát nồng độ amoni sulfat sử dụng để kết tủa enzym

Dịch chiết enzym thô được giữ ở nhiệt độ 40C/1 giờ Thêm dần dần amoni sulfat vào 100ml dịch chiết enzym thô đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa theo yêu cầu Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ Li tâm dịch chiết với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để thu riêng tủa enzym Hòa tan tủa enzym vào 10ml dung dịch đệm thu được dịch enzym [23],[59]

 Kết tủa phân đoạn protein enzym

Ở nồng độ amoni sulfat bão hòa đầu tiên, tiến hành tương tự như trên Sau khi li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng tủa enzym; phần dịch còn lại được thêm dần dần amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ hai Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ Li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng phần tủa và dịch Phần tủa được hòa tan vào 10ml dung dịch đệm Phần dịch lại được thêm amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ ba Lặp lại các bước cho đến nồng độ amoni sulfat bão hòa cuối cùng [59]

b) Phương pháp tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel Sephadex G – 75

Nguyên tắc: Khi nạp mẫu vào cột sắc kí có pha tĩnh là các hạt gel xốp; các phân tử mẫu có kích thước lớn hơn kích thước của lỗ gel sẽ đi vào khoảng trống giữa các hạt gel và ra khỏi cột trước Các phân tử có kích thước nhỏ khuếch tán tối

đa vào trong các hạt gel và ra khỏi cột sau [6],[14],[26],[42]

Tiến hành: Ngâm gel Sephadex G –75 trong dung dịch đệm trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn

Cho một lớp bông thủy tinh vào đáy cột sắc kí Gel Sephadex G–75 được đưa vào cột cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ (tránh tạo bọt khí và phân lớp) Để gel lắng xuống dưới tác dụng của trọng lực Tiếp tục đổ gel vào cột cho đến khi gel trong cột cao được khoảng 15cm Đặt lên trên bề mặt gel một khoanh giấy lọc để cân bằng gel Cho dung dịch đệm chảy qua cột với tốc độ khoảng 7 ml/giờ trong vài giờ để ổn định cột

Mẫu cần tinh chế loại muối được đưa vào cột Chờ 30 phút để mẫu ngấm hết xuống Thêm dung dịch đệm vào cột và thu mỗi phân đoạn 1ml Đánh giá sơ bộ quá

trình lọc gel kết thúc: Cho dung dịch chảy ra từ cột phản ứng với dung dịch BaCl2, nếu tạo thành tủa trắng không tan trong dung dịch HCl loãng thì quá trình lọc gel kết thúc Rửa cột bằng dung dịch đệm trong khoảng 3 giờ [13],[26]

2.3.5 Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease

a) Xác định nồng độ protein

Nguyên tắc: Định lượng protein toàn phần trong mẫu thử bằng kỹ thuật Gornall dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret Các liên kết peptid của protein khi phản ứng với ion Cu++ trong môi trường kiềm sẽ cho phức hợp màu tím, độ đậm màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu thử [12]

Tiến hành:

Xây dựng biểu đồ mẫu: Từ dung dịch protein chuẩn 1% và dung dịch đệm có

pH thích hợp pha chính xác thành các dung dịch protein có nồng độ từ 1,0 đến 10,0mg/ml và thực hiện phản ứng như sau:

Hệ số protein Ki: Ki = Nồng độ protein/Mật độ quang

Hệ số trung bình Ktb: Ktb = ∑ Ki/n

(n: tổng số mẫu chuẩn; với thí nghiệm trên n = 10)

Nồng độ protein C: C = Ktb x D

b) Xác định hoạt độ protease

Nguyên tắc: Dưới tác dụng của enzym, một phần protein bị thủy phân, giải phóng các acid amin tan trong acid tricloroacetic Phần protein còn lại sau phản ứng

bị tủa trong acid tricloroacetic Định lượng protein còn lại bằng phương pháp Biuret

vào mỗi ống nghiệm 3ml dung dịch tricloroacetic 10% để ngừng phản ứng Lắc đều,

để 10 phút ở nhiệt độ phòng Li tâm 4.000 vòng/10 phút để thu tủa Hòa tan tủa bằng dung dịch đệm và tiến hành phản ứng Biuret [12]

+ Cách tính kết quả:

Dựa trên biểu đồ mẫu, tính ra lượng casein bị thủy phân

P = P1 + P2 – P3 Trong đó: P1 là lượng protein trong ống cơ chất (mg)

P2 là lượng protein trong ống chứng (mg) P3 là lượng protein trong ống thử (mg) Hoạt độ enzym: Từ năm 1972; khái niệm đơn vị hoạt độ enzym Katal (Kat) được đưa ra: 1 Katal là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn Đơn vị đo mức độ phân giải protein của chế phẩm enzym được dùng là nanoKatal (nKat): 1nKat = 10-9 Kat [8],[36]

Mức độ phân giải protein (MDP) được tính theo công thức:

MDP =P B L 10

Trong đó: P là lượng protein (mg) bị thủy phân (tính theo biểu đồ mẫu)

B là độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym

M là trọng lượng phân tử gam của protein (của casein là 23.600)

L là số liên kết peptid của phân tử protein (của casein là 209)

T là thời gian thủy phân (3.600 giây)

m là lượng chế phẩm enzym dùng thử nghiệm (ml hay mg)

2.3.6 Phương pháp điện di SDS – PAGE

Nguyên tắc của phương pháp điện di: Trong môi trường pH khác pI của protein, protein sẽ tích điện trên bề mặt và chuyển dịch về phía điện cực trái dấu khi

có dòng điện chạy qua: protein tích điện càng lớn sẽ di chuyển càng nhanh trong điện trường và ngược lại Nhờ đó có thể phân tách riêng biệt các protein có trọng lượng phân tử khác nhau bằng phương pháp điện di [14],[26]

Tiến hành: Các protein biến tính được tải vào các giếng trên bản gel polyacrylamid, đặt trong đệm thích hợp Khi đặt dòng điện một chiều với hiệu điện thế phù hợp vào, các protein tích điện âm sẽ dịch chuyển qua gel với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng phân tử của chúng Sau điện di, gel được nhuộm bằng thuốc nhuộm thích hợp Các protein khác nhau sẽ xuất hiện ở các băng phân biệt trong gel [26]

2.3.7 Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin

Nguyên tắc: Nattokinase có khả năng phân giải fibrin Dựa trên nguyên tắc của phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, tiến hành thử khả năng phân giải fibrin bằng cách tạo ra môi trường thử: thạch – fibrin; với mục đích sơ bộ xác định

sự có mặt của nattokinase trong mẫu nghiên cứu sau khi đã có kết quả trọng lượng phân tử của protein enzym Thời điểm phối hợp fibrin với môi trường thạch là khi môi trường thạch đạt nhiệt độ 450C để tránh làm phân hủy fibrin [51]

Tiến hành: Tạo 20ml hỗn dịch fibrin trong nước; cho vào cốc có mỏ 200ml Đun chảy 80ml dung dịch thạch 2,5% Để thạch nguội đến 450C và phối hợp với hỗn dịch fibrin theo nguyên tắc đồng lượng Đổ 16ml môi trường thử trên vào các đĩa petri Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 370C/18 giờ Quan sát vòng phân giải fibrin

trên đĩa thạch (Xem chi tiết ở phụ lục 2) [51]

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết

protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto

3.1.1 Sơ bộ xác định các enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto

Môi trường nuôi cấy được chọn là môi trường canh thang do môi trường này

hay được sử dụng để nhân giống B subtilis natto và B subtilis [22],[23],[28],[43],

[49],[67] Nhiệt độ và thời gian nuôi cấy lần lượt là 370C và 24 giờ để tối ưu hóa

khả năng sinh tổng hợp protease của B subtilis nói chung và B subtilis natto nói

riêng [22],[25],[37],[47],[49],[59],[68]; đồng thời hạn chế lượng cellulose (đạt tối

đa sau 48 giờ nuôi cấy [63])

Theo các nghiên cứu đã được công bố, trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto có nhiều loại enzym khác nhau [40],[57],[58],[63],[70] Vì vậy, thí nghiệm

được tiến hành để sơ bộ xác định sự tồn tại của một số enzym, đặc biệt là các

protease ngoại bào của B subtilis natto

Mục đích: Bước đầu khảo sát sự tồn tại của các enzym trong môi trường nuôi

cấy B subtilis natto

Tiến hành: Nuôi cấy B subtilis natto theo phương pháp được nêu ra trong

mục c phần 2.3.1 Li tâm dịch lên men (4.000 vòng/20 phút) để thu riêng phần dịch

nổi hay dịch trong Thử khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của dịch trong

theo các phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.2 Mẫu trắng là môi trường canh

thang không cấy B subtilis natto và được điều chỉnh pH tương đương với pH dịch

trong Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Kết quả: Kết quả thí nghiệm được thể hiện trên bảng 3.1

Bảng 3.1: Sơ bộ thử hoạt tính các enzym trong dịch nuôi cấy B subtilis natto

Dịch

trong

Mẫu trắng

Lần2 18,9 (-) (+) (-) (+) (-)

Chú thích (+): Xuất hiện vòng phân giải cơ chất

(-): Không xuất hiện vòng phân giải cơ chất

Nhận xét: Kết quả đưa ra trên bảng 3.1 cho thấy trong cả 3 lần thí nghiệm,

dịch trong thu được từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto đều có khả năng phân

giải cơ chất casein, tinh bột, CMC Mẫu trắng không cho vòng phân giải cơ chất do

đó đã loại trừ được ảnh hưởng của nền mẫu đến kết quả thí nghiệm

Kết luận sơ bộ: Trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto có mặt cả

protease, amylase và cellulase

Bàn luận: Kết quả thí nghiệm phù hợp với kết quả nghiên cứu về các loại

enzym có mặt trong môi trường nuôi cấy B subtilis natto Trong phạm vi đề tài này,

enzym được quan tâm là protease; được sơ bộ xác định bằng khả năng phân giải casein Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới [31],[35],[39],[44],[62],[64],[67],[73]

và kết quả của Đào Thị Mai năm 2012 (tiến hành trên cùng giống vi khuẩn) [7], protease tập trung chủ yếu trong phần dịch nổi hay dịch trong Kết quả vòng phân giải casein của dịch trong ở thí nghiệm này (18,6mm) phù hợp với kết quả thí nghiệm của Đào Thị Mai năm 2012 (18,4mm) [7] và Hin Virek năm 2012

Mục đích: Xác định giá trị pH tối ưu cho hoạt tính phân giải casein của

protease ngoại bào sinh ra bởi B subtilis natto; nhằm lựa chọn hệ đệm có pH thích

hợp hòa tan tủa enzym trong bước chiết tách