CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. Phương pháp nghiên cứu …
2.3.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzym protease
Xác định pH của dịch nghiên cứu. Sau đó phân phối dịch vào các cốc có mỏ (10ml/1 cốc). Điều chỉnh pH đến giá trị pH nghiên cứu bằng cách thêm từng giọt dung dịch NaOH 0,1M hoặc HCl 0,1M (có kết hợp khuấy từ). Để ổn định 1 giờ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thử khả năng phân giải casein của dịch nghiên cứu trước và sau khi đã điều chỉnh pH theo mục a phần 2.3.2. [67]
2.3.4. Phương pháp chiết tách và tinh sạch protease a) Phương pháp chiết tách protease bằng amoni sulfat
Nguyên tắc: Khi thêm muối vào dung dịch protein enzym; tính tan của protein enzym tăng nhẹ (salting in) ở nồng độ muối thấp và giảm mạnh (salting out) ở nồng độ muối cao. Sự gia tăng lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình solvat hóa, giảm tính hòa tan của protein enzym dẫn đến sự tủa. [5],[26]
Tiến hành:
Khảo sát nồng độ amoni sulfat sử dụng để kết tủa enzym
Dịch chiết enzym thô được giữ ở nhiệt độ 40C/1 giờ. Thêm dần dần amoni sulfat vào 100ml dịch chiết enzym thô đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa theo yêu cầu. Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ. Li tâm dịch chiết với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để thu riêng tủa enzym. Hòa tan tủa enzym vào 10ml dung dịch đệm thu được dịch enzym. [23],[59]
Kết tủa phân đoạn protein enzym
Ở nồng độ amoni sulfat bão hòa đầu tiên, tiến hành tương tự như trên. Sau khi li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng tủa enzym;
phần dịch còn lại được thêm dần dần amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ hai. Sau khi muối tan hết, để yên 1 giờ. Li tâm với tốc độ 15.000 vòng/20 phút ở nhiệt độ 40C để tách riêng phần tủa và dịch. Phần tủa được hòa tan vào 10ml dung dịch đệm. Phần dịch lại được thêm amoni sulfat đến khi đạt nồng độ amoni sulfat bão hòa thứ ba. Lặp lại các bước cho đến nồng độ amoni sulfat bão hòa cuối cùng. [59]
b) Phương pháp tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel Sephadex G – 75
Nguyên tắc: Khi nạp mẫu vào cột sắc kí có pha tĩnh là các hạt gel xốp; các phân tử mẫu có kích thước lớn hơn kích thước của lỗ gel sẽ đi vào khoảng trống giữa các hạt gel và ra khỏi cột trước. Các phân tử có kích thước nhỏ khuếch tán tối đa vào trong các hạt gel và ra khỏi cột sau. [6],[14],[26],[42]
Tiến hành: Ngâm gel Sephadex G –75 trong dung dịch đệm trong 24 giờ để gel trương nở hoàn toàn.
Cho một lớp bông thủy tinh vào đáy cột sắc kí. Gel Sephadex G–75 được đưa vào cột cùng với dung dịch đệm qua phễu một cách từ từ (tránh tạo bọt khí và phân lớp). Để gel lắng xuống dưới tác dụng của trọng lực. Tiếp tục đổ gel vào cột cho đến khi gel trong cột cao được khoảng 15cm. Đặt lên trên bề mặt gel một khoanh giấy lọc để cân bằng gel. Cho dung dịch đệm chảy qua cột với tốc độ khoảng 7 ml/giờ trong vài giờ để ổn định cột.
Mẫu cần tinh chế loại muối được đưa vào cột. Chờ 30 phút để mẫu ngấm hết xuống. Thêm dung dịch đệm vào cột và thu mỗi phân đoạn 1ml. Đánh giá sơ bộ quá
trình lọc gel kết thúc: Cho dung dịch chảy ra từ cột phản ứng với dung dịch BaCl2, nếu tạo thành tủa trắng không tan trong dung dịch HCl loãng thì quá trình lọc gel kết thúc. Rửa cột bằng dung dịch đệm trong khoảng 3 giờ. [13],[26]
2.3.5. Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein và hoạt độ protease a) Xác định nồng độ protein
Nguyên tắc: Định lượng protein toàn phần trong mẫu thử bằng kỹ thuật Gornall dựa trên nguyên tắc của phản ứng Biuret. Các liên kết peptid của protein khi phản ứng với ion Cu++ trong môi trường kiềm sẽ cho phức hợp màu tím, độ đậm màu tỷ lệ thuận với nồng độ protein trong mẫu thử. [12]
Tiến hành:
Xây dựng biểu đồ mẫu: Từ dung dịch protein chuẩn 1% và dung dịch đệm có pH thích hợp pha chính xác thành các dung dịch protein có nồng độ từ 1,0 đến 10,0mg/ml và thực hiện phản ứng như sau:
Thành phần 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Protein mẫu (ml) 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 0 Dung dịch đệm
(ml) 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1,0 Nồng độ protein
(mg/ml) 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 0 Thuốc thử Gornall
(ml) 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
Lắc đều, để các ống 30 phút ở nhiệt độ phòng. Tiến hành đo quang phổ hấp thụ của các dung dịch ở bước sóng thích hợp. Từ kết quả đo quang dựng biểu đồ thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ protein C (mg/ml) – mật độ quang D. [12]
Hệ số protein Ki: Ki = Nồng độ protein/Mật độ quang.
Hệ số trung bình Ktb: Ktb =∑ Ki/n.
(n: tổng số mẫu chuẩn; với thí nghiệm trên n = 10) Nồng độ protein C: C = Ktb x D
b) Xác định hoạt độ protease
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của enzym, một phần protein bị thủy phân, giải phóng các acid amin tan trong acid tricloroacetic. Phần protein còn lại sau phản ứng bị tủa trong acid tricloroacetic. Định lượng protein còn lại bằng phương pháp Biuret như mục a phần 2.3.5. [12]
Tiến hành: Pha loãng dịch chiết enzym đến khi đạt nồng độ thích hợp bằng dung dịch đệm. Thực hiện phản ứng với cơ chất là casein (dung dịch 1%). Chuẩn bị 3 ống nghiệm và sử dụng hóa chất như sau:
Ống cơ chất Ống chứng Ống thử
Casein 1% (ml) 1 0 1
Dung dịch đệm (ml) 1 1 1
Dung dịch thử (ml) 0 1 1
Để các ống nghiệm vào tủ ấm 370C/1 giờ cho phản ứng xảy ra. Sau đó cho vào mỗi ống nghiệm 3ml dung dịch tricloroacetic 10% để ngừng phản ứng. Lắc đều, để 10 phút ở nhiệt độ phòng. Li tâm 4.000 vòng/10 phút để thu tủa. Hòa tan tủa bằng dung dịch đệm và tiến hành phản ứng Biuret. [12]
+ Cách tính kết quả:
Dựa trên biểu đồ mẫu, tính ra lượng casein bị thủy phân P = P1 + P2 – P3
Trong đó: P1 là lượng protein trong ống cơ chất (mg) P2 là lượng protein trong ống chứng (mg) P3 là lượng protein trong ống thử (mg)
Hoạt độ enzym: Từ năm 1972; khái niệm đơn vị hoạt độ enzym Katal (Kat) được đưa ra: 1 Katal là lượng enzym có khả năng xúc tác làm chuyển hóa 1 mol cơ chất sau 1 giây ở điều kiện tiêu chuẩn. Đơn vị đo mức độ phân giải protein của chế phẩm enzym được dùng là nanoKatal (nKat): 1nKat = 10-9 Kat. [8],[36]
Mức độ phân giải protein (MDP) được tính theo công thức:
MDP =P. B. L. 10
M. m. T (nKat)
Trong đó: P là lượng protein (mg) bị thủy phân (tính theo biểu đồ mẫu) B là độ pha loãng của dung dịch chế phẩm enzym
M là trọng lượng phân tử gam của protein (của casein là 23.600) L là số liên kết peptid của phân tử protein (của casein là 209) T là thời gian thủy phân (3.600 giây)
m là lượng chế phẩm enzym dùng thử nghiệm (ml hay mg) 2.3.6. Phương pháp điện di SDS – PAGE
Nguyên tắc của phương pháp điện di: Trong môi trường pH khác pI của protein, protein sẽ tích điện trên bề mặt và chuyển dịch về phía điện cực trái dấu khi có dòng điện chạy qua: protein tích điện càng lớn sẽ di chuyển càng nhanh trong điện trường và ngược lại. Nhờ đó có thể phân tách riêng biệt các protein có trọng lượng phân tử khác nhau bằng phương pháp điện di. [14],[26]
Tiến hành: Các protein biến tính được tải vào các giếng trên bản gel polyacrylamid, đặt trong đệm thích hợp. Khi đặt dòng điện một chiều với hiệu điện thế phù hợp vào, các protein tích điện âm sẽ dịch chuyển qua gel với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng phân tử của chúng. Sau điện di, gel được nhuộm bằng thuốc nhuộm thích hợp. Các protein khác nhau sẽ xuất hiện ở các băng phân biệt trong gel. [26]
2.3.7. Phương pháp sơ bộ thử hoạt tính phân giải fibrin
Nguyên tắc: Nattokinase có khả năng phân giải fibrin. Dựa trên nguyên tắc của phương pháp khuếch tán qua giếng thạch, tiến hành thử khả năng phân giải fibrin bằng cách tạo ra môi trường thử: thạch – fibrin; với mục đích sơ bộ xác định sự có mặt của nattokinase trong mẫu nghiên cứu sau khi đã có kết quả trọng lượng phân tử của protein enzym. Thời điểm phối hợp fibrin với môi trường thạch là khi môi trường thạch đạt nhiệt độ 450C để tránh làm phân hủy fibrin. [51]
Tiến hành: Tạo 20ml hỗn dịch fibrin trong nước; cho vào cốc có mỏ 200ml.
Đun chảy 80ml dung dịch thạch 2,5%. Để thạch nguội đến 450C và phối hợp với hỗn dịch fibrin theo nguyên tắc đồng lượng. Đổ 16ml môi trường thử trên vào các đĩa petri. Khi thạch đông thì đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm. Nhỏ 0,05ml dịch thử vào giếng thạch, ủ trong tủ ấm 370C/18 giờ. Quan sát vòng phân giải fibrin trên đĩa thạch (Xem chi tiết ở phụ lục 2). [51]