CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN
3.1. Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp trong quá trình tách chiết
3.1.3. Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B. subtilis natto
a) Xây dựng biểu đồ mẫu định lượng protein
Các bước được tiến hành theo phương pháp được nêu ra trong mục a phần 2.3.5. Đo quang ở bước sóng λ = 540nm. Kết quả đo quang được thể hiện trong bảng 3.3. Từ kết quả đo quang xây dựng biểu đồ mẫu được thể hiện trên hình 3.2.
Bảng 3.3: Giá trị mật độ quang của dung dịch protein đã biết nồng độ
C (mg/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
D 0,076 0,162 0,248 0,31 0,376 0,47 0,512 0,602 0,65 0,770 Chú thích C: nồng độ protein; D: giá trị mật độ quang tương ứng; Ktb = 13,036.
Hình 3.2: Biểu đồ mẫu định lượng protein theo phương pháp Biuret
Nhận xét: Trong khoảng nồng độ protein từ 1,0 – 10,0mg/ml, quan hệ giữa mật độ quang D và nồng độ protein C của mẫu chuẩn là mối quan hệ đồng biến tuyến tính; đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của D vào C là một đường thẳng có hệ số tương quan R = 0,997 (> 0,99) và R2 = 0,995.
y = 0.073x + 0.013 R² = 0.995
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
D
C (mg/ml)
b) Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào của B. subtilis natto
Quá trình kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat dựa trên hiện tượng tính tan của protein enzym giảm mạnh ở nồng độ muối cao. Nồng độ muối bão hòa tối ưu để kết tủa cho hoạt tính enzym protease cao nhất thay đổi theo điều kiện cụ thể (dao động từ 20% đến 80%) [6]. Do đó thí nghiệm được tiến hành nhằm tìm ra nồng độ muối thích hợp trong khoảng nồng độ khảo sát: 20 – 80% amoni sulfat bão hòa.
Mục đích: Lựa chọn nồng độ amoni sulfat để kết tủa protein có hoạt tính enzym protease cao nhất.
Tiến hành: Các nồng độ khảo sát: 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%
amoni sulfat bão hòa. Kết tủa protein enzym từ dịch trong theo các bước được nêu ra trong đoạn đầu mục a phần 2.3.4. Thử khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC;
định lượng protein và xác định hoạt độ protease của các dịch enzym (sau khi hòa tan các tủa thu được vào dung dịch đệm phosphat pH = 7,6) theo phương pháp được nêu ra trong phần 2.3.2 và 2.3.5. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả: Kết quả thử khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzym được thể hiện trên bảng 3.4. Kí hiệu dịch hòa tan tủa protein enzym tương ứng với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khảo sát là dịch enzym 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%.
Bảng 3.4: Kết quả đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzym khi chiết tách với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau
Nồng độ % amoni sulfat bão
hòa sử dụng
Đường kính vòng phân giải (mm)
Casein Tinh bột CMC
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 1
Lần 2
Lần 3
Lần 1
Lần 2
Lần 3 20% 16,7 17,2 17,0 10,9 11,0 10,6 11,2 10,8 11,3 30% 17,0 17,5 17,4 11,4 11,7 11,4 11,6 11,6 11,9 40% 18,0 18,4 18,1 11,7 11,8 11,4 12,4 12,2 12,6 50% 19,9 20,7 20,5 12,2 12,5 12,0 13,0 13,0 13,4 60% 23,6 24,3 23,8 12,7 12,9 12,6 13,2 13,0 13,4 70% 23,0 23,8 23,1 13,4 13,5 13,4 14,5 14,0 14,8 80% 22,8 23,5 23,3 14,3 14,6 14,2 16,2 15,9 16,8
Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC của dịch enzym 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% được thể hiện trên đồ thị hình 3.3.
Hình 3.3: Khả năng phân giải casein, tinh bột, CMC của các dịch enzym khi chiết tách với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau
Nhận xét: Kết quả đưa ra trên bảng 3.4 và đồ thị hình 3.3 cho thấy các dịch enzym 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% đều có khả năng phân giải casein, tinh bột và CMC.
+ Về khả năng phân giải casein: Khả năng phân giải casein của dịch enzym tăng dần theo lượng muối được thêm vào dịch trong đến nồng độ 60% amoni sulfat bão hòa. Đường kính vòng phân giải casein đạt giá trị lớn nhất (trung bình:
23,9mm) khi kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat 60% bão hòa.
+ Về khả năng phân giải tinh bột và CMC: Khả năng phân giải tinh bột và CMC của dịch enzym tăng dần theo lượng muối được thêm vào dịch trong. Đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC đạt giá trị lớn nhất (trung bình: 14,4mm và 16,3mm) khi kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat 80% bão hòa. Dịch enzym
10.8 11.5 11.6 12.2 12.8 13.4 14.4 17 17.3 18.2
20.4
23.9 23.3 23.2
11.1 11.7 12.4 13.1 13.2 14.4
16.3
0 5 10 15 20 25
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%
Đường kính vòng phân giải tinh bột (mm)
Đường kính vòng phân giải casein (mm)
Đường kính vòng phân giải CMC
Đường kính vòng phân giải (mm) (mm)
Nồng độ amoni sulfat sử dụng
70% cũng cho đường kính vòng phân giải tinh bột và CMC tương đối lớn (trung bình: 13,4mm và 14,4mm).
Kết luận sơ bộ: Dịch enzym 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% đều có protease, amylase và cellulase. Khi kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat 60%
bão hòa, tủa cho hoạt tính enzym protease cao nhất; cần kết hợp với kết quả thử hoạt độ để có đánh giá chính xác. Khi kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat 70%
và 80% bão hòa, tủa cho hoạt tính enzym amylase và cellulase cao nhất.
Kết quả trung bình khi định lượng protein và xác định hoạt độ protease của các dịch enzym được thể hiện trên bảng 3.5.
Bảng 3.5: Kết quả định lượng protein và xác định hoạt độ protease của các dịch enzym khi chiết tách với các nồng độ amoni sulfat bão hòa khác nhau Nồng độ amoni sulfat
bão hòa sử dụng Protein tổng số (mg) Hoạt độ protease (nKat)
20% 93,699 70,767
30% 109,315 84,246
40% 142,192 105,139
50% 152,877 118,618
60% 213,699 172,536
70% 214,521 168,492
80% 216,164 162,426
Nhận xét: Kết quả đưa ra trên bảng 3.5 cho thấy lượng protein enzym thu được tăng dần theo lượng amoni sulfat thêm vào dịch trong. Khi kết tủa protein enzym với nồng độ amoni sulfat 80% bão hòa thu được lượng protein enzym lớn nhất: 216,164mg.
Hoạt độ protease của các dịch enzym tăng dần từ dịch enzym 20% đến dịch enzym 60%; còn dịch enzym 70% và 80%, hoạt độ protease giảm. Hoạt độ protease của dịch enzym 60% lớn nhất: 172,536nKat.
Bàn luận: Các tủa thu được với các nồng độ amoni sulfat khảo sát là các hỗn hợp gồm nhiều protein enzym trong đó có enzym nghiên cứu là protease. Việc lựa chọn nồng độ amoni sulfat bão hòa sao cho thu được tối đa lượng protease, giảm thiểu lượng enzym tạp (amylase và cellulase) là cần thiết. Một số kết quả nghiên cứu trên thế giới như sau:
Đối với loài B. subtilis, nồng độ amoni sulfat được sử dụng để kết tủa protease rất khác nhau dao động từ 40% đến 80% amoni sulfat bão hòa. [22],[23], [30],[43],[59]
Đối với dòng B. subtilis natto, nồng độ amoni sulfat khoảng 60% bão hòa đã được nhiều tác giả sử dụng để kết tủa một số protease ngoại bào như theo nghiên cứu của Tetsuya Kato (1992) [39], Fujita năm 1993 [31], Muramatsu năm 2000 [44], Huang Jun năm 2005 [35], Cong Wang năm 2009 [67]. Ngoài ra, K. Yamane đã kết tủa amylase từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto bằng amoni sulfat 80%
bão hòa [40].
Kết quả thí nghiệm cũng đưa ra nồng độ amoni sulfat tối ưu để chiết tách protease ngoại bào là 60% bão hòa nên phù hợp với các kết quả nghiên cứu nói trên.
Mặt khác, hoạt tính enzym amylase lớn nhất khi kết tủa protein enzym tại nồng độ amoni sulfat 80% bão hòa cũng phù hợp với kết quả của K. Yamane năm 1974 [40];
do đó khi kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat 60% bão hòa sẽ thuận lợi hơn cho bước tinh chế so với khi kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat 70% hay 80%
bão hòa (lượng muối sử dụng, amylase và cellulase thấp hơn).
c) Kết tủa phân đoạn protein enzym từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto Kết quả khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease có sự khác biệt so với kết luận về nồng độ amoni sulfat tối ưu (80% bão hòa) của Trương Thị Hương Tràm năm 2010 khi kết tủa phân đoạn nattokinase từ môi trường lên men rắn [18].
Mặt khác nghiên cứu đầu tiên về quá trình chiết tách nattokinase từ môi trường lên men rắn của B. subtilis natto do Fujita tiến hành đã loại protein tạp ở nồng độ 25%
amoni sulfat bão hòa [31]. Vì vậy, thí nghiệm kết tủa phân đoạn protein enzym được thực hiện để đối chiếu với các kết quả trên.
Tiến hành: Kết tủa phân đoạn protein enzym từ dịch trong theo các bước được nêu ra trong đoạn sau mục a phần 2.3.4 với các nồng độ amoni sulfat 20%, 40%, 60%, 80% bão hòa. Thử khả năng phân giải casein, định lượng protein và xác định hoạt độ protease của các dịch enzym phân đoạn (sau khi hòa tan tủa protein enzym bằng dung dịch đệm phosphat pH = 7,6) theo các phương pháp được nêu ra trong mục a phần 2.3.2 và 2.3.5. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Kết quả: Kết quả trung bình đường kính vòng phân giải casein, định lượng protein; xác định hoạt độ protease của các dịch enzym thu được từ quy trình kết tủa phân đoạn được đưa ra trong bảng 3.6.
Bảng 3.6: Khả năng phân giải casein, nồng độ protein và hoạt độ protease của các dịch enzym thu được theo quy trình kết tủa phân đoạn
Các dịch enzym Đường kính vòng phân giải casein (mm)
Protein (mg)
Hoạt độ protease (nKat)
Dịch phân đoạn 20% bh 17,0 93,699 70,767
Dịch phân đoạn 40% bh 10,6 54,521 22,241
Dịch phân đoạn 60% bh 18,0 72,603 74,810
Dịch phân đoạn 80% bh (-) 8,767 2,359
Chú thích (-): Không xuất hiện vòng phân giải cơ chất.
Dịch phân đoạn 20%, 40%, 60%, 80% bh: dịch hòa tan tủa khi kết tủa phân đoạn protein enzym với nồng độ amoni sulfat 20%, 40%, 60%, 80% bão hòa.
Nhận xét: Kết quả đưa ra trên bảng 3.6 cho thấy tất cả các phân đoạn khảo sát đều có protein enzym kết tủa. Trong đó lượng protein enzym và hoạt độ protease của phân đoạn 20% bão hòa khá lớn (93,699mg và 70,767nKat). Phân đoạn 60%
bão hòa có hoạt độ protease cao nhất (74,810nKat). Phân đoạn 80% bão hòa còn protein (8,767mg) nhưng hoạt độ protease rất thấp (2,359nKat) và không cho vòng phân giải casein.
Kết luận sơ bộ: Phân đoạn 20% bão hòa có hoạt tính enzym protease khá lớn do đó không loại bỏ phân đoạn này trong quá trình chiết tách. Phân đoạn 60% bão hòa có hoạt tính enzym protease cao nhất. Phân đoạn 80% bão hòa có hoạt tính enzym protease thấp nên có thể bỏ qua phân đoạn này.
Bàn luận: Nhiều nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto từ môi trường nuôi cấy lỏng cũng không tiến hành loại protein tạp ở nồng độ muối thấp [35],[39],[44],[64],[67],[73]. Để hạn chế sự giảm hoạt tính enzym protease khi quá trình chiết tách có nhiều giai đoạn, trong đề tài này bước loại bỏ protein tạp không được tiến hành.
Tóm lại, các kết quả thí nghiệm cho thấy khi kết tủa protein enzym bằng amoni sulfat từ dịch trong (được tách ra từ môi trường nuôi cấy B. subtilis natto) với mục đích thu protease, sử dụng nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa có một số ưu thế sau:
+ Hoạt độ protease của protein enzym cao nhất trong các nồng độ khảo sát.
+ Lượng muối sử dụng, lượng enzym tạp (amylase, cellulase) thấp hơn so với các nồng độ khác có hoạt độ protease gần tương đương (nồng độ amoni sulfat 70%, 80% bão hòa).
+ Tuy không loại được protein tạp như khi kết tủa phân đoạn nhưng không làm giảm nhiều hoạt độ protease của enzym.
Dựa trên các kết quả có được, nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa được lựa chọn để chiết tách protease ngoại bào của B. subtilis natto trong các nghiên cứu tiếp theo của đề tài này.