Nghiên cứu chiết tác enzym protease bằng amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy bacillus subtilis natto

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐINH THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT ENZYM PROTEASE BẰNG AMONI SULFAT TỪ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Bacillus subtilis natto KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Đàm Thanh Xuân DS Đinh Thu Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Với tất kính trọng lòng biết ơn sâu sắc, tơi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới cô giáo TS Đàm Thanh Xuân – Giảng viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội DS Đinh Thu Hương, người quan tâm, tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi đường học tập, nghiên cứu khoa học Đồng thời, xin cảm ơn DS Lê Ngọc Khánh tồn thể thầy, giáo, anh chị kỹ thuật viên môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới tồn thể gia đình, thầy cô giáo trường tất bạn bè động viên, giúp đỡ suốt trình học tập Hà Nội, tháng năm 2013 Sinh viên Đinh Thị Thanh Thảo Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Trang DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Enzym vi sinh vật phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật 1.1.1 Enzym vi sinh vật 1.1.2 Chiết xuất thu nhận enzym từ vi sinh vật 1.1.3 Kiểm tra độ chế phẩm enzym 1.1.4 Protease chiết tách protease ngoại bào vi sinh vật thuộc chi Bacillus 1.2 Phương pháp chiết tách protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 1.2.1 Đặc điểm Bacillus subtilis natto 1.2.2 Đặc điểm protease ngoại bào B subtilis natto 10 1.2.3 Các phương pháp chiết tách protease ngoại bào B subtilis natto 11 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1 Nguyên vật liệu thiết bị 14 2.1.1 Vi sinh vật sử dụng 14 2.1.2 Nguyên liệu, hóa chất sử dụng 14 2.1.3 Môi trường 14 2.1.4 Máy móc dụng cụ 14 2.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2.1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp q trình tách chiết protease từ mơi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 15 2.2.2 Sơ tinh chế xác định số đặc tính protease thu 15 2.3 Phương pháp nghiên cứu … 15 2.3.1 Phương pháp giữ giống nuôi cấy Bacillus subtilis natto 15 2.3.2 Phương pháp sơ thử hoạt tính nhóm enzym 16 2.3.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzym protease 17 2.3.4 Phương pháp chiết xuất tinh protease 17 2.3.5 Phương pháp Biuret xác định nồng độ protein hoạt độ protease 19 2.3.6 Phương pháp điện di SDS – PAGE 21 2.3.7 Phương pháp sơ thử hoạt tính phân giải fibrin 21 CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN 22 3.1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp q trình tách chiết protease từ mơi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto………… 22 3.1.1 Sơ xác định enzym có mặt mơi trường nuôi cấy B subtilis natto 22 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzym protease ngoại bào B subtilis natto 23 3.1.3 Khảo sát nồng độ amoni sulfat để kết tủa protease ngoại bào B subtilis natto 26 3.2 Sơ tinh chế xác định số đặc tính protease thu 32 3.2.1 Tinh chế protease phương pháp sắc ký lọc gel Sephadex G – 75 32 3.2.2 Điện di số phân đoạn thu sau tinh chế 36 3.2.3 Sơ thử hoạt tính phân giải fibrin mẫu nghiên cứu 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT AS : Amoni sulfat bh : bão hòa CM : Carboxymethyl Sắc kí trao đổi ion CM : Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm trao đổi cation carboxymethyl CMC : Carboxy methyl cellulose DEAE : Diethylaminoethyl Sắc kí trao đổi ion DEAE : Sắc kí trao đổi ion có nhựa trao đổi ion mang nhóm trao đổi anion diethylaminoethyl E : Enzym FU : Fibrinolytic units (Đơn vị đánh giá khả phân giải fibrin chất nghiên cứu) kDa : kilo Dalton mBar : mili Bar N0 : Lần thí nghiệm nKat : nano Katal pI : Điểm đẳng điện protein Quy mơ PTN : Quy mơ phòng thí nghiệm SDS : Sodium dodecyl sulfat (Natri dodecyl sulfat) SDS – PAGE : Sodium dodecyl sulfat – Polyacrylamide Gel Electrophoresis Điện di SDS – PAGE : Điện di gel polyacrylamid với có mặt natri dodecyl sulfat TLPT : Trọng lượng phân tử t – PA : Tissue plasminogen activator (các tác nhân hoạt hóa plasminogen mơ) UF : Mảng siêu lọc Ultra Filtration DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1: Các phương pháp sắc kí Bảng 1.2: Các loại gel Sephadex Bảng 1.3: Sản phẩm protease ngoại bào chi Bacillus Bảng 1.4: Các nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào B subtilis Bảng 1.5: Một số nghiên cứu chiết tách protease ngoại bào B subtilis natto 12 Bảng 2.1: Nguyên liệu hóa chất 14 Bảng 2.2: Thiết bị sử dụng 15 Bảng 3.1: Sơ thử hoạt tính enzym dịch ni cấy B subtilis natto Bảng 3.2: Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzym protease dịch Bảng 3.3: Giá trị mật độ quang dung dịch protein biết nồng độ 22 24 26 Bảng 3.4: Kết đường kính vòng phân giải casein, tinh bột, CMC dịch enzym chiết xuất với nồng 27 độ amoni sulfat bão hòa khác Bảng 3.5: Kết định lượng protein xác định hoạt độ protease dịch enzym chiết xuất với 29 nồng độ amoni sulfat bão hòa khác Bảng 3.6: Khả phân giải casein, nồng độ protein hoạt độ protease dịch enzym thu theo quy 31 trình kết tủa phân đoạn Bảng 3.7: Kết thử khả phân giải casein phân đoạn thu sau tinh chế 33 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Bảng 3.8: Đánh giá có mặt α – amylase cellulase phân đoạn 34 Bảng 3.9: Kết giai đoạn tách chiết tinh chế protease 35 Bảng 3.10: Kết đo đường kính vòng phân giải fibrin 38 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Tên hình Hình 1.1: Cơ chế thủy phân phân tử protein protease Hình 1.2: Năng suất mức tinh protease chiết xuất từ môi trường nuôi cấy B subtilis Hình 1.3: Quy trình kết tinh cơng nghiệp subtilisin dạng muối halogen Hình 1.4: Hình thái vi khuẩn B subtilis natto Hình 3.1: Kết trung bình đường kính vòng phân giải casein giá trị pH khác Hình 3.2: Biểu đồ mẫu định lượng protein theo phương pháp Biuret Trang 9 10 24 26 Hình 3.3: Khả phân giải casein, tinh bột, CMC dịch enzym chiết xuất với nồng độ amoni 28 sulfat bão hòa khác Hình 3.4: Mối liên hệ hoạt tính enzym protease phân đoạn thể tích rửa giải (Ve ) Hình 3.5: Kết điện di SDS – PAGE 34 37 ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, chế phẩm enzym sản xuất sử dụng ngày rộng rãi nhiều lĩnh vực đời sống người Trong số đó, protease – enzym phá vỡ liên kết peptid acid amin protein – enzym có nhiều ứng dụng số ngành chế biến thực phẩm, sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da… Đặc biệt lĩnh vực y tế, protease sử dụng làm thuốc điều trị cho hiệu tốt Bên cạnh protease thu nhận từ tổ chức động vật (renin, tripsin), thực vật (bromelanin, papain), protease có nguồn gốc từ vi sinh vật nghiên cứu để tìm phương pháp tách chiết tối ưu Một số lồi vi sinh vật có khả sinh protease ứng dụng nhiều vi khuẩn thuộc chi Bacillus [55] Vi khuẩn Bacillus subtilis natto thuộc chi Bacillus, loài Bacillus subtilis biết đến “nguyên liệu” ủ với đậu tương nấu chín, lên men tạo nên ăn truyền thống Natto Nhật Bản Năm 1980, giáo sư Sumi người Nhật phát Natto có chứa nattokinase – enzym thuộc nhóm enzym protease có khả phân giải fibrin [53] Từ đến nay, nhiều nghiên cứu Bacillus subtilis natto tiến hành kết cho thấy chủng vi khuẩn có khả sinh nhiều enzym nhóm protease nattokinase [31], elastase [62], bacillopeptidase F [64]… Bacillus subtilis natto có khả sinh tổng hợp protease vấn đề đặt làm cách để thu protease từ mơi trường ni cấy vi sinh vật Vì vậy, khóa luận “Nghiên cứu tách chiết enzym protease amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto” thực với hai mục tiêu: Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp q trình tách chiết protease từ mơi trường ni cấy B subtilis natto Sơ tinh chế xác định số đặc tính protease thu Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.3 Enzym vi sinh vật phương pháp tách chiết enzym từ vi sinh vật 1.3.1 Enzym vi sinh vật Enzym chất xúc tác sinh học có tính đặc hiệu cao, phần lớn có chất protein; có tất tế bào sống trì hoạt tính xúc tác sau tách khỏi thể sống (ở điều kiện định) [2],[8],[14] Ngày nay, người ta tổng hợp enzym phương pháp hóa học (các synzym), tìm kháng thể có hoạt tính xúc tác (abzym), acid ribonucleic có hoạt tính xúc tác (ribozym)… Tuy nhiên, đa số enzym chiết tách từ tổ chức động vật; thực vật; chủ yếu từ vi sinh vật [3],[8] Vi sinh vật nguồn thu enzym phong phú có enzym mà thể động vật thực vật tổng hợp Vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzym với lượng lớn, thời gian ngắn Con người tác động vào vi sinh vật để thu enzym theo ý muốn Mặt khác enzym vi sinh vật thường có hoạt tính mạnh [14],[17],[36] Quy trình thu nhận chế phẩm enzym từ vi sinh vật gồm bốn giai đoạn chủ yếu:  Phân lập, tuyển chọn cải tạo giống vi sinh vật  Nuôi cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym  Chiết tách thu nhận enzym  Kiểm tra độ chế phẩm enzym Quá trình phân lập, tuyển chọn, cải tạo giống vi sinh vật nhằm tạo giống vi sinh vật có khả sinh tổng hợp enzym nghiên cứu với hiệu cao; sử dụng biện pháp như: gây đột biến tác nhân vật lý, hóa học, sinh học phân tử (biến nạp, tải nạp, tiếp hợp gen) [14],[17],[36] Q trình ni cấy vi sinh vật sinh tổng hợp enzym thực phương pháp nuôi cấy bề mặt phương pháp ni cấy chìm Cần lựa chọn thành phần mơi trường dinh dưỡng (đặc biệt chất cảm ứng); kiểm sốt thơng số Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 40 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Kết luận Qua trình nghiên cứu, đề tài thu kết sau: Khảo sát khoảng nồng độ amoni sulfat để kết tủa enzym protease từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto 20 – 80% amoni sulfat bão hòa Đã lựa chọn nồng độ amoni sulfat 60% bão hòa nồng độ tối ưu thu tủa enzym có hoạt độ protease cao nhất: 172,536nKat; đồng thời hạn chế lượng tối đa enzym khác có mặt môi trường nuôi cấy B subtilis natto (amylase cellulase) Lựa chọn dung dịch đệm phosphat pH = 7,6 dung mơi hòa tan tủa enzym Đã sơ tinh chế tủa protein enzym thu phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 đồng thời xác định số đặc tính protease thu Lựa chọn phân đoạn có hoạt độ protease cao phân đoạn 10: 27,221nKat Đã xác định có mặt số protease số phân đoạn thu sau tinh chế Kết cho thấy phân đoạn 10 có enzym nattokinase với khả phân giải mạnh chất fibrin Kết thu cho thấy đề tài giải hai mục tiêu: + Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp q trình tách chiết protease từ mơi trường nuôi cấy B subtilis natto + Sơ tinh chế xác định số đặc tính protease thu Đề xuất Qua trình nghiên cứu, xin đưa số đề xuất: Tiếp tục tiến hành tinh chế protease ngoại bào (đặc biệt nattokinase) B subtilis natto thu từ phương pháp kết tủa amoni sulfat 60% bão hòa Tiếp tục khảo sát độ lặp lại phương pháp thạch – fibrin để sơ đánh giá khả phân giải fibrin mẫu nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Nguyễn La Anh, Đặng Thu Hương (2009), “Nghiên cứu tách chiết enzym fibrinase từ chủng B subtilis NT5 ứng dụng làm thực phẩm chức năng”, Hội thảo khoa học, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, Hà Nội Bộ Y Tế (2009), Hóa sinh học, Nxb Y học, Hà Nội, tr 136 – 138, 190 Phạm Thị Trân Châu, Phan Tuấn Nghĩa (2007), Công nghệ sinh học – Enzyme ứng dụng, Nxb Giáo dục, tập 3, tr 22 – 28, 174 – 189 Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vương Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sư phạm, Hà Nội, tr 25 – 34, 96 – 100 Nguyễn Hoàng Lộc (2007), Giáo trình nhập mơn cơng nghệ sinh học, Nxb Đại học Huế, Huế, tr 209 – 236 Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ Enzym, Nxb Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh, tr 67 – 96 Đào Thị Mai (2012), Khảo sát khả sinh enzym tiêu fibrin vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 23, 30 Lê Thanh Mai, Nguyễn Thị Hiền, Phạm Thu Thủy, Nguyễn Thanh Hằng, Lê Thị Lan Chi (2007), Các phương pháp phân tích ngành cơng nghệ lên men, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 178 Trần Thị Hồng Nghi, Lê Thanh Hùng, Trương Quang Bình (2006), Nghiên cứu ứng dụng enzym protease từ vi khuẩn (Bacillus subtilis) để thủy phân phụ phẩm cá tra, Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Hồ Chí Minh 10 Lê Xuân Phương (2008), Thí nghiệm vi sinh vật học, Đại học Đà Nẵng, Đà Nẵng, tr 33 – 36, 43 – 49, 87 11 Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh, Trần Thạnh Phong, Lê Tấn Hưng, Trương Thị Hồng Vân, Lê Thị Hương (2012), “Phân lập tuyển chọn Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi số chủng Bacilus sinh tổng hợp nattokinase”, Tạp chí sinh học, 34(3), tr 99 – 104 12 Nguyễn Văn Rư (2002), Nghiên cứu tạo chế phẩm protease nguồn gốc động vật, thực vật ứng dụng phòng chống suy dinh dưỡng, Luận án tiến sĩ Dược học, tr – 5, 33 – 36 13 Bùi Thị Thiết (2012), Tinh chế chế thử bột chymopapain pha tiêm, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 32 – 35 14 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú (2012), Công nghệ enzym, Nxb Khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr 25 – 56 15 Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2004), “Ảnh hưởng yếu tố môi trường lên trình sinh trưởng sinh tổng hợp protease chủng Serratia sp DT3”, Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(2), tr 205 – 216 16 Nguyễn Thị Thảo, Quyền Đình Thi (2008), “Nhân dòng, phân tích trình tự biểu gen mã hóa subtilisin từ chủng B subtilis G1 RD23 E coli BL21/pESUb”, Hội nghị Khoa học - Những vấn đề nghiên cứu khoa học sống, Quy Nhơn 17 Nguyễn Văn Thanh (2009), Công nghệ sinh học Dược, Nxb Giáo dục Việt Nam, tr 149 – 150 18 Trương Thị Hương Tràm (2010), Bước đầu nghiên cứu khả sinh tách chiết nattokinase từ đậu tương lên men, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 27 – 31 19 Vũ Đình Vinh, Đặng Hạnh Phức, Đỗ Đình Hồ (1974), Kỹ thuật y sinh hóa, Nxb Trường Đại học Quân Y, Hà Nội, tr 243 – 244 20 Hin Vireak (2012), Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên khả tạo enzym protease vi khuẩn Bacillus subtilis natto, Khóa luận tốt nghiệp Dược sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội, tr 23 Tài liệu tiếng Anh 21 Astrup, Mullertz S (1952), “The fibrin plate method for estimating fibrinolytic activity”, Archives of Biochemistry and Biophysics, 40, Denmark, p 346 – 351 22 I Ahmed, Muhammad Anjum Zia (2011), “Purification and kinetic parameters characterization of an alkaline protease produced from Bacillus subtilis through submerged fermentation technique”, World Applied Sciences Journal, 12 (6), p 751 – 757 23 S Almas, Abdul Hameed (2009), “Purification and characterization of a novel protease from Bacillus strain SAL1”, African Journal of Biotechnology, 8(15), p 3603 – 3609 24 S Ashikaga, H Nanamiya (2000), “Natural genetic competence in Bacillus subtilis natto OK2”, Journal of Bacteriology, 182(9), p 2411 – 2415 25 P Chantawannakul, Anchalee Oncharoena (2002), “Characterization of proteases of Bacillus subtilis strain 38 isolated from traditionally fermented soybean in Northern Thailand”, Science Asia, 28, p 241 – 245 26 C Dennison (2002), A Guide to protein isolation, Kluwer Academic Publishers, p 87 – 64, 71 – 108, 129 – 133 27 Do Thi Bich Thuy, Salil Kumar Bose (2011), “Characterization of multiple extracellular proteases produced by a Bacillus subtilis strain and identification of the strain”, International Journal of Biology, 3(1), p 101 – 110 28 G Das, M.P Prasad (2010), “Isolation, purification & mass production of protease enzyme from Bacillus subtilis”, International Research Journals of Microbiology, 1(2), p 26 – 31 29 Paul De Vos et al (2009), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology – the Firmicutes, 3, Springer Science Business Media, p 20 – 24 30 E.M El - Safey, U.M Abdul - Raouf (2004), “Production, purification and charactrization of protease enzyme from Bacillus subtilis”, International Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi conferences for development and the environment in the Arab World, Assiut University, p 14 31 M Fujita et al (1993), “Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto, a popular soybean fermented food in Japan”, Biochemical and Biophysical research communication, p 1340 – 1347 32 C Guang, Wang Gang (2012), “Purification and characterization of Bacillus subtilis nattokinase”, Food science, 33(15), p 231 – 234 33 W.A Hassanein, Y.A El - Zawahry (2011), “Fibrinolysis and anticoagulant potential of a metallo protease produced by Bacillus subtilis K42”, Journal of Biosciences, 36, p 773 – 779 34 M Haritha, M Vangalapati (2011), “Nattokinase: A review on fibrinolytic enzyme”, International Journal of Chemical Environmental and Pharmaceutical Research, 2(1), p 61 – 66 35 H Jun, Mei Le-he (2005), “Screening of Bacillus subtilis natto from traditional Japanese Food Natto and separation of Nattokinase”, Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 19(4), p 518 – 522 36 A Illanes (2008), Enzyme Biocatalysis – Principles and Applications, Springer Science Publishing, p 58 – 59 37 Jian X., Xue – li Z., Guang C (2005), “Optimization of liquid fermentation conditions of nattokinase”, Journal of Jilin Agricultural University, p 38 Ji Young Kim, Si Nae Gum (2008), “Effects of nattokinase on blood pressure: A randomized, controlled trial”, Hypertension Research, 31, p 1583 – 1588 39 T Kato et al (1992), “Purification of a new extracellular 90 – kDa serine proteinase with isoelectric point of 3.9 from Bacillus subtilis (natto) and elucidation of its distinct mode of action”, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56 (7), p 1166 – 1168 40 K Yamane, Hiroshi M (1974), “Hybrid α – amylases produced by transformants of Bacillus subtilis – Purification and characterization of extracellular α – amylases produced by the parental strains and transformants”, Biochimica et Biophysica Acta, 365, p 235 – 247 41 Lü Ying, Zhang Lu, Feng Lei (2004), “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis”, China National Research Institute of Food and Fermentation Industries, Beijing 42 A Maurer (2010), Gel filtration – Principles and Methods, GE Healthcare UK, p 57 – 63 43 F Mashayekhi Mazar, H Shahbaz Mohammadi (2012), “Isolation, purification and characterization of a thermophilic alkaline protease from Bacillus subtilis BP – 36”, Journal of Sciences, 23(1), Islamic Republic of Iran, p – 13 44 K Muramatsu, N Yamawake (2000), “Purification and crystallization of a new Bacillus subtilis elastase”, Journal of Home Economics of Japan, 51(12), p 1127 – 1135 45 Mahmoud, RF Gamal (1978), “Production and chemical studies of protease from Bacillus subtilis (SH-6) Egyptian strain”, Zentralbl Bakteriol Naturwiss, 133(2), p 121 – 124 46 Maruyama, Sumi H (1998), “Effect of natto diet on blood pressure, in basic and clinical aspects of Japanese Traditional Food Natto II”, Japan Technology Transfer Association, p – 47 P Mahajan, Sagar V (2010), “Production of nattokinase using Bacillus natto NRRL 3666: media optimization, scale up and kinetic modeling”, Food Science and Biotechnology, 19(6), p 1593 – 1603 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 48 M Fujita, Hong K (1995), “Thrombolytic effect of nattokinase on a chemically induced thrombosis model in rat”, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 18(10), p 1387 – 1391 49 M Padmapriya, B Williams (2012), “Purification and characterization of neutral protease enzyme from Bacillus subtilis”, Journal of Microbiology and Biotechnology Research, (4), p 612 – 618 50 Noda K., Igata K (1989), “Synthesis of γ – glytamyl peptides catalyzed by transamidase from Bacillus natto”, Agricultural Biology and Chemistry, 44, p 2419 – 2423 51 Eiko Ohta, Yutaka Miura, Yoshio Tozawa (1972), “Fibrin-Agar-Plate method, a new method for estimation of fibrinolytic activity”, Rinsho Ketsueki, 13(5), p 793 – 799 52 Chi Hye Park, Sang Jun Lee (2004), “Hetero – and autoprocessing of the extracellular metalloprotease (Mpr) in Bacillus subtilis”, Journal of Bacteriology, 186(19), p 6457 – 6464 53 Holsworth (2002), “Nattokinase and Cardiovascular Health”, Special Report, p 54 R Dubey, J Kumar (2011), “Isolation, production, purification, assay and characterization of fibirnolytic enzymes (nattokinase, streptokinase and urokinase) from bacterial sources”, Afican Journal of Biotechnology, 10(8), p 1408 – 1420 55 R Gupta, Q K Beg (2002), “Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications”, Applied Microbiology and Biotechnology, 59, p 15 – 32 56 A Sloma, Gerald A Rufo (1991), “Cloning and characterization of the gene for an additional extracellular serine protease of Bacillus subtilis”, Journal of Bacteriology, 173(21), p 6889 – 6895 57 K Steinkraus (2004), Industrialization of indigenous fermented foods, p 227 – 230 58 M Shimizu (1992), “Purification and Characterization of Phytase from Bacillus subtilis (natto) N – 77”, Bioscience biotechnology and biochemistry, 56(8), p 1266 – 1269 59 R Sankar, Deepthi Y (2012), “Purification and characterization of an extracellular alkaline serine protease from Bacillus subtilis NR 18”, International Journal of Current Research, 4(3), p 98 – 103 60 B.V Reddy, B Rasmitha Reddy (2013), “Lyophilization (freeze – drying) – a review”, International Journal of Pharma World Research, 4(1), p – 20 61 Seki T., Oshima T deoxyribonucleic interspecific acid (1975), – “Taxonomic deoxyribonucleic transformation”, International study of Bacillus acid hybridization Journal of by and Systematic Bacteriology, 25(3), p 258 – 270 62 Sumi Hiroyuki, Yoshikawa Misako (1999), “Elastase activity in Natto, and its relation to nattokinase”, Nippon Nogeikagaku Kaishi, 73(11), p 1187 – 1190 63 Sun Yan, Wang JiaQi (2011), “Screening of protease and cellulase producing Bacillus subtilis natto strain and its growth characteristics”, Dongbei Nongye Daxue Xuebao Journal, 42(3), p 39 – 43 64 Shogo Tokudome, Kazunobu Omura (2005), “A newly derived protein from Bacillus subtilis natto with both antithrombotic and fibrinolytic effects”, Journal of Pharmacological Sciences, 99, p 247 – 251 65 Tamang J., Thapa S (2002), “Phylogenetic analysis of Bacillus strains isolated from fermented soybean foods of Asia: Kinema, Chungkokjang and Natto”, Journal of Hill Resarch, 15(2), p 56 – 62 66 Tran L., X.C.Wu, S L.Wong (1991), “Cloning and expression of a novel protease gene encoding an extracellular neutral protease from Bacillus subtilis”, Journal of bacteriology, 173, p 6364 – 6372 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi 67 C Wang, Ming Du (2009), “Purification and characterization of nattokinase from Bacillus subtilis natto B – 12”, Journal of Agricultural and food chemistry article, 57, p 9722 – 9729 68 Xie Qiuling Guo Jong (1999), “ The optimization of fermentation conditions of nattokinase”, Journal of south China university of technology (natural science), p 69 Jen - Kuo Yang, Ing - Lung Shih (2000), “Production and purification of protease from a Bacillus subtilis that can deproteinize crustacean wastes”, Enzyme and Microbial Technology, 26, p 406 – 413 70 Y., Ogawa, H Hosoyama, M Hamano, M Motai (1991), “Purification and properties of γ – glutamyltranspeptidase from Bacillus subtilis (natto)”, Agricultural Biology and Chemistry, 55, p 2971 – 2977 71 Youhei Yamagata, Rei Abe (1995), “Molecular cloning and nucleotide sequence of the 90k serine protease gene, hspK, from Bacillus subtilis (natto) No 16”, Current Microbiology, 31(6), p 340 – 344 72 Bai Zhen, Xu Mei (2004), “Purification and characterization of nattokinase”, Journal of Northeast Agricultural University 73 Xiaoyan Zu, Zhenya Zhang (2010), “Thrombolytic activities of nattokinase extracted from Bacillus subtilis fermented soybean curd residues”, International Journal of Biology, 2(2), University of Tsukuba 74 Zhu Jianhui et al (2006), “Purification and characterization of a strong fibrinolytic enzyme nattokinase”, Wei Sheng wu xue Tong bao, 33(1), p 68 – 71 Trang web 75 http://www.vedan.com.tw/english/02_products/02_products_01_001.html PHỤ LỤC Phụ lục 1: Cách pha chế số dung dịch hóa chất sử dụng đề tài Nước sử dụng để pha chế dung dịch nước cất  Dung dịch casein 1%: Hòa tan 1,0g casein hydroclorid dung dịch đệm phosphat pH = 7,6 vừa đủ 100,0ml dung dịch  Dung dịch acid tricloroacetic 10%: Hòa tan 10,0g acid tricloroacetic nước vừa đủ 100,0ml dung dịch  Thuốc thử Gornall: Hòa tan 1,5g CuSO4.5H2O 6,0g Na – K tatrat 500,0ml nước Thêm 300,0ml dung dịch NaOH 10% (hòa tan 30,0g NaOH 300,0ml nước), vừa thêm vừa lắc Thêm 1,0g KI, sau thêm nước vừa đủ 1.000ml Lắc kĩ, bảo quản lọ nút kín, ý: bỏ có cặn  Dung dịch natri hydroxyd 0,1M: Hòa tan 0,4g NaOH 50,0ml nước Thêm nước vừa đủ 100,0ml  Dung dịch acid hydrocloric 0,1M: Hút 0,85ml dung dịch HCl đặc, cho vào khoảng 50ml nước Sau thêm nước vừa đủ 100,0ml  Dung dịch đệm phosphat pH = 7,6: + Pha dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M: Hòa tan 1,36g KH2PO4 nước vừa đủ 50,0ml + Pha dung dịch natri hydroxyd 0,2M: Hòa tan 0,4g NaOH 30ml nước Thêm nước vừa đủ 50,0ml + Trộn 50,0ml dung dịch kali dihydrophosphat 0,2M với 42,8ml dung dịch natri hydroxyd 0,2M Thêm nước vừa đủ 200,0ml  Thuốc thử Lugol: Hòa tan 2,0g KI nước Tiếp tục hòa tan 1,0g Iod, thêm nước vừa đủ 100,0ml Bảo quản lọ nút kín  Chuẩn bị mẫu chứng Nattospes nattokinase: Chuẩn bị mẫu chứng Nattospes: Lấy hết phần bột nang Nattospes, bỏ vỏ nang Phần bột hòa vào 5ml dung dịch đệm phosphat pH = 7,6 Lọc bỏ phần cắn không tan, thu phần dịch Phần dịch mẫu chứng Nattospes Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Chuẩn bị mẫu chứng nattokinase: Hòa tan 1g nattokinase 5ml dung dịch đệm thu mẫu chứng nattokinase Phụ lục 2: Phương pháp tạo môi trường thạch fibrin để thử khả phân giải fibrin chất Do điều kiện phòng thí nghiệm, phương pháp tiến hành có khác biệt so với phương pháp Ekio Ohta (2008) [51] Fibrin tách trực tiếp từ huyết tương nghèo tiểu cầu Bước 1: Tạo màng fibrin [7],[19] + Chuẩn bị fibrin thử: Li tâm máu lợn khỏe mạnh (đã chống đơng) với tốc độ 1.500 vòng/phút phút thu huyết tương nghèo tiểu cầu + Tạo fibrin: dung dịch NaCl 0,9%: 50ml; huyết tương nghèo tiểu cầu: 1ml; dung dịch CaCl2 0,1M: 0,8ml + Khuấy kĩ đũa thủy tinh (một đầu mài ráp) Để tủ ấm – 370C (đũa thủy tinh cắm cốc) Sau đổ thêm vào cốc khoảng 20ml dung dịch NaCl 0,9% cho cục fibrin tách khỏi cốc, bám vào đũa thủy tinh Ấn nhẹ đũa thủy tinh vào thành cốc, vừa ấn vừa cuộn Fibrin bám vào thành đũa thủy tinh thành màng mỏng Đổ phần nước lại cốc, thay dung dịch NaCl 0,9% để rửa màng fibrin dính đầu đũa thủy tinh Rửa lại nước + Tách màng fibrin khỏi đũa thủy tinh, đặt vào đĩa petri + Bước tạo màng fibrin lặp lại nhiều lần thu fibrin vào đĩa petri Bước 2: Đông khô fibrin + Sau tách fibrin, tiến hành đông khô fibrin Phương pháp đông khô phương pháp tách nước khỏi nguyên liệu cách chuyển nước từ trạng thái đá (rắn) sang trạng thái khí mà khơng qua giai đoạn lỏng [60] Tiến hành tiền đông nhiệt độ – 85 0C; đông khô nhiệt độ – 550C, áp suất 0,055mBar Bước 3: Tạo đĩa thạch fibrin + Cân khoảng 1,5g fibrin đông khô Nghiền fibrin chày cối sứ, thêm nước vừa đủ 20ml theo nguyên tắc đồng lượng thu hỗn dịch fibrin nước + Cân 2,0g thạch, phân tán thạch vào 80ml nước Đun cho thạch tan hết Để nguội đến nhiệt độ 45 0C thu dung dịch thạch + Thêm dung dịch thạch vào 20ml hỗn dịch fibrin theo nguyên tắc đồng lượng Cốc đựng hỗn dịch fibrin đặt máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút để đảm bảo phân tán đồng thạch fibrin Sau tạo thành, hỗn dịch thạch – fibrin đổ vào đĩa petri chuẩn bị từ trước Khi thạch đơng lại thử khả phân giải fibrin mẫu phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Phụ lục 3: Một số hình ảnh q trình làm thí nghiệm Hình ảnh vi khuẩn khuẩn lạc B subtilis natto Vi khuẩn B subtilis natto Khuẩn lạc B subtilis natto Hình ảnh thử khả phân giải casein, tinh bột, CMC dịch hòa tan tủa protein enzym kết tủa nồng độ amoni sulfat 50% bão hòa (T50); 60% bão hòa (T60), 70% bão hòa (T70) 80% bão hòa (T80) Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi Cơ chất casein Cơ chất tinh bột Cơ chất CMC Mẫu protein để đo quang xây dựng đường chuẩn định lượng protein Hình ảnh thử khả phân giải fibrin mẫu nghiên cứu với mẫu đối chứng mẫu thử NP: Mẫu đối chứng Nattospes NT: Mẫu đối chứng nattokinase DTr: Mẫu thử dịch thu từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto T60: Mẫu thử dịch hòa tan tủa kết tủa enzym với amoni sulfat 60% bão hòa Pđ 10: Mẫu thử phân đoạn 10 sau tinh chế dịch enzym 60% phương pháp sắc kí lọc gel Sephadex G – 75 N: Mẫu trắng dung dịch đệm phosphat pH = 7,6 Ket-noi.com Ket-noi.com kho kho tai tai lieu lieu mien mien phi phi ... nồng độ amoni sulfat thích hợp q trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto 3.1.1 Sơ xác định enzym có mặt mơi trường nuôi cấy B subtilis natto Môi trường nuôi cấy chọn... nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp q trình tách chiết protease từ môi trường nuôi cấy Bacillus subtilis natto  Sơ xác định enzym có mặt môi trường nuôi cấy B subtilis natto. .. Nghiên cứu tách chiết enzym protease amoni sulfat từ môi trường nuôi cấy B subtilis natto thực với hai mục tiêu: Khảo sát nồng độ amoni sulfat thích hợp q trình tách chiết protease từ mơi trường