Tổng hợp và thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của 5 (3 bromobenzyliden) 2 thiohydantoin và một số dẫn chất base mannich

BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MAI CÔNG HƢNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5-(3’- BROMOBENZYLIDEN)-2- THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2015 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MAI CÔNG HƢNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5-(3’- BROMOBENZYLIDEN)-2- THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ Ngƣời hƣớng dẫn: 1. TS. Vũ Trần Anh 2. DS. Tô Ái An Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa hữu cơ HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Trần Anh, DS. Tô Ái An và PGS. TS Nguyễn Quang Đạt đã hết lòng chỉ bảo, giúp đỡ và trực tiếp hƣớng dẫn tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin cảm ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của: Ths. Đặng Vũ Lƣơng (Phòng NMR- Viện Hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam), TS. Trần Thị Nhƣ Hằng (Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên), TS. Đào Thị Nhung (Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa- Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội) và toàn thể các thầy cô giáo, cán bộ kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa hữu cơ, các thầy cô giáo trong trƣờng, các phòng ban- Trƣờng Đại học Dƣợc Hà Nội. Mặc dù đã có nhiều cố gắng nhƣng do hạn chế về thời gian, kiến thức cũng nhƣ tài liệu tham khảo nên khóa luận của tôi không thể tránh khỏi những sai sót, khiếm khuyết trong nội dung và hình thức, tôi rất mong nhận đƣợc sự góp ý của các thầy cô để khóa luận đƣợc hoàn thiện hơn. Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015 Sinh viên MAI CÔNG HƢNG MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2 1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin 2 1.1.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thƣ 2 1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 7 1.1.3 Các tác dụng khác 9 1.2 Các phƣơng pháp tổng hợp 2-thiohydantoin và dẫn chất 10 1.2.1 Phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin 10 1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-aryliden-2-thiohydantoin 12 1.2.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất base Mannich 16 CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi 18 2.2 Thiết bị thí nghiệm 18 2.3 Nội dung nghiên cứu 19 2.4 Phƣơng pháp nghiên cứu 19 2.4.1 Phƣơng pháp tổng hợp 2-thiohydantoin, 5-(3‟- bromobenzyliden)-2-thiohydantoin và dẫn chất base Mannich 19 2.4.2 Phƣơng pháp xác định cấu trúc 20 2.4.3 Phƣơng pháp thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ 20 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Tổng hợp hóa học 23 3.1.1 Tổng hợp 2-thiohydantoin 24 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 5-(3‟-bromobenzyliden)-2-thiohydantoin 25 3.1.3 Tổng hợp một số dẫn chất base Mannich của 5-(3‟- bromobenzyliden)-2-thiohydantoin 26 3.2 Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc 29 3.2.1 Phổ hồng ngoại 29 3.2.2 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 30 3.2.3 Phổ khối lƣợng 30 3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thƣ 30 3.4 Bàn luận 37 3.4.1 Về tổng hợp hóa học 37 3.4.1.1 Về phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin 37 3.4.1.2 Về phản ứng ngƣng tụ tạo 5-(3‟-bromobenzyliden)-2- thiohydantoin 38 3.4.1.3 Về phản ứng Mannich 39 3.4.2 Về xác định cấu trúc của các chất tổng hợp đƣợc 39 3.4.2.1 Về phổ hồng ngoại (IR) 39 3.4.2.2 Về phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 1 H-NMR 40 3.4.2.3 Về xác định đồng phân hình học của dẫn chất 5-(3‟- bromobenzyliden)-2-thiohydantoin và các base Mannich dựa trên phổ 1 H-NMR. 41 3.4.2.4 Về phổ cộng hƣởng từ hạt nhân 13 C-NMR 42 3.4.2.5 Về phổ MS 43 3.4.3 Về tác dụng gây độc tế bào ung thƣ 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân carbon 13 1 H-NMR : Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton Ac 2 O : Anhydrid acetic AcOH : Acid acetic DMF : Dimethylformamid EGFR : Epidermal growth factor receptor (thụ thể của yếu tố tăng trƣởng biểu mô) EtOH : Ethanol ESI : Phƣơng pháp phun mù điện tử Hep-G2 : Tế bào ung thƣ gan ở ngƣời IC 50 : Nồng độ ức chế 50% IR : Phổ hồng ngoại MeOH : Methanol MS : Khối phổ (Mass spectrometry) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Trang 3.1 Kết quả tổng hợp 2-thiohydantoin (BT) và các dẫn chất của nó (I, Ia-c) 32 3.2 Số liệu phổ 1 H-NMR của A, BM, BT 33 3.3 Số liệu phổ IR và phổ 1 H-NMR của I và các dẫn chất base Mannich (Ia-c) 34 3.4 Số liệu phổ 13 C-NMR của I và các dẫn chất base Mannich (Ia-c) 35 3.5 Số liệu phổ ESI-MS của I và các dẫn chất base Mannich (Ia-c) 36 3.6 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 của các chất tổng hợp đƣợc (theo phƣơng pháp SRB) 36 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu và phát triển thuốc mới là một lĩnh vực khoa học tự nhiên đã ra đời rất lâu và ngày càng phát triển. Ở Việt Nam trƣớc đây lĩnh vực này chƣa phát triển song gần đây nghiên cứu và phát triển thuốc mới đã bắt đầu thu hút đƣợc sự chú ý của nhiều nhóm nghiên cứu và một số tập đoàn dƣợc phẩm lớn trong nƣớc. Trong quá trình nghiên cứu và phát triển thuốc mới cần phải tổng hợp một số lƣợng lớn dẫn chất để: xác định pharmacophore (cấu trúc tác dụng chính); xác định mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng; tìm dẫn chất với tác dụng tốt hơn, tác dụng phụ ít hơn hoặc dƣợc động học tối ƣu cho sử dụng trên cơ thể sống. Các hợp chất dẫn đƣờng có thể tìm kiếm từ nhiều con đƣờng khác nhau: sàng lọc từ các hợp chất thiên nhiên, sàng lọc bằng tổng hợp hữu cơ, sàng lọc từ các chất nội sinh trong cơ thể… Trong đó sàng lọc bằng tổng hợp hữu cơ là con đƣờng quan trọng mà phần lớn các hãng dƣợc phẩm lớn hiện nay đều sử dụng để nghiên cứu phát hiện thuốc mới. Trên thế giới, các nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu về tổng hợp hóa học, tác dụng sinh học và ứng dụng làm thuốc của các dẫn chất 2- thiohydantoin [9], [14], [30]… Trong đó nhiều dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng chống ung thƣ, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và ức chế aldose reductase,… đáng quan tâm [16], [20], [21], [23], [36], [39], [40]. Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm các dẫn chất 2-thiohydantoin có tiềm năng về hoạt tính sinh học, chúng tôi thực hiện khóa luận với các mục tiêu sau: 1. Tổng hợp dẫn chất 5-(3‟-bromobenzyliden)-2-thiohydantoin và một số dẫn chất base Mannich. 2. Thử hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thƣ gan Hep-G2 của các chất tổng hợp đƣợc. 2 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tác dụng sinh học của các dẫn chất 2-thiohydantoin. 2-thiohydantoin là hợp chất dị vòng đƣợc tạo thành nhờ phản ứng ngƣng tụ giữa một amino acid với một dẫn chất của thiocyanat. Bản thân 2- thiohydantoin không thể hiện tác dụng sinh học, tuy nhiên các dẫn chất của 2- thiohydantoin có tác dụng sinh học đã đƣợc biết đến trong thời gian dài. Nhiều công trình nghiên cứu tổng hợp và thử tác dụng sinh học cho thấy các dẫn chất của 2-thiohydantoin có tác dụng đa dạng nhƣ: kháng tế bào ung thƣ [1], [5], [10], [39], [40], kháng đột biến gen [30], kháng virus [14], kháng virus HIV [20], kháng khuẩn [21], [23], ức chế enzyme aldose reductase [36] … Ngoài ra 2-thiohydantoin còn đƣợc sử dụng nhiều trong các lĩnh vực khác nhƣ sản xuất thuốc trừ sâu [37], thuốc nhuộm [37]… 1.1.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư. Merbaron là một dẫn chất của 2-thiobarbituric, có tác dụng gây độc tế bào với tế bào ung thƣ máu và một số tế bào ung thƣ khác. HN N H H N O S O O Merbaron Dựa trên sự tƣơng tự về cấu trúc của 2-thiohydantoin, Blanc và Cussac [38] đã tiến hành tổng hợp một số dẫn chất của 2-thiohydantoin (1a-d), thử tác dụng gây tăng miễn dịch và gây độc tế bào. Kết quả thử nghiệm cho thấy các dẫn chất tổng hợp đƣợc 1(a-d) có tác dụng gây tăng miễn dịch yếu, và có tác dụng trên các tế bào ung thƣ thử nghiệm. [...]... chy: 22 9 -23 00C (ti liu [23 ], t0C= 23 0 -23 20C; Catalogue Sigma Aldrich, t0C= 22 9 -23 10C) Rf = 0,68 (TLC, silicagel 60 F 25 4 , h dung mụi CH2Cl2/MeOH (14:1)) 1 H-NMR (50 0 MHz, DMSO-d6), (ppm): xem ph lc 2. 2, bng 3 .2 3.1 .2 Tng hp dn cht 5- (3- bromobenzyliden)- 2- thiohydantion (I) Cụng thc: 26 Br 3' O 2' 1' 4' 5' 3 NH 1 2 4 CH 6' 5 N H S CTPT: C10H7BrN2OS, KLPT: 28 3,14 Tin hnh: Cho vo bỡnh cu phn ng 2, 32g (0, 020 mol)... Hep-G2 vớ d: (5- (4-clorobenzyliden) -2- 7 thiohydantion (IC50= 4,66 àg/ml), methylpiperazino)methyl -2- thiohydantoin 5- (4-clorobenzyliden)-3-(N- (IC50= 4, 95 àg/ml), 5- (2- hydroxybenzyliden) -2- thiohydantoin (IC50= 4, 72 àg/ml)) v t bo ung th i trng HTC116 ( 5- (2- clorobenzyliden) -2- thiohydantion (IC50= 24 ,40 àg/ml), 5- (4-clorobenzyliden) -2- thiohydantion (IC50= 27 ,08 àg/ml)) 1.1 .2 Tỏc dng khỏng khun, khỏng nm... chy: 21 6 -21 70C Rf = 0, 82 (TLC, silicagel 60 F 25 4 , h dung mụi CH2Cl2 : MeOH (14:1)) Rf = 0,60 (TLC, silicagel 60 F 25 4 , h dung mụi Hexan : Aceton (3: 2) ) IR (KBr, max (cm-1)): xem ph lc 3.1, bng 3.3 1 H-NMR (50 0 MHz, DMSO-d6), (ppm): xem ph lc 3 .2, bng 3.3 13 C-NMR (1 25 MHz, DMSO-d6), (ppm): xem ph lc 3.3, bng 3.4 ESI - MS, (m/z, %): xem ph lc 3.4, bng 3 .5 3.1.3 Tng hp mt s dn cht base Mannich ca 5- (3- bromobenzyliden )2 -thiohydantion... 1' 4' 5' 6' 4 CH 5 O 4'' 1 2 N H 1'' N 3N 2' ' 5' ' 6'' S CTPT: C15H16BrN3O2S; KLPT: 3 82, 28 Tin hnh: 0,71g (0,0 025 mol) cht I, 0 ,21 ml formol (0,0 025 mol formaldehyd), 0 ,22 g (0,0 025 mol) morpholin, 15ml hn hp EtOH, 3 git acid acetic bng 28 Theo dừi phn ng bng SKLM vi h dung mụi khai trin CH 2Cl2/MeOH (14:1) un hi lu trong vũng 6 gi, kt tinh li trong 8 ml EtOH Sn phm thu c l 0,45g cht kt tinh mu vng Hiu sut... 5- (3- bromobenzyliden)- 3-piperidinomethyl -2- thiohydantoin (Ib) Cụng thc: Br 3'' O 3' 2' 1' 4' 5' 6' N 3N 5 1 2 4 CH N H 2' ' 4'' 1'' 5' ' 6'' S CTPT: C16H18ClN3OS; KLPT: 380,3 Tin hnh: 0,71g (0,0 025 mol) cht I, 0 ,21 ml formol (0,0 025 mol formaldehyd), 0 ,21 g (0,0 025 mol) piperidin, 15ml hn hp EtOH, 3 git acid acetic bng Theo dừi phn ng bng SKLM vi h dung mụi khai trin CH 2Cl2/MeOH (14:1) un hi lu trong vũng 2 gi, kt tinh li trong 12ml EtOH... hc, trng i hc Khoa hc T nhiờn, i hc Quc gia H Ni 2. 3 Ni dung nghiờn cu - Tng hp v xỏc nh cu trỳc dn cht 5- (3- bromobenzyliden)- 2thiohydantoin v mt s dn cht base Mannich - Th hot tớnh gõy c t bo trờn dũng t bo ung th gan Hep-G2 ca cỏc cht tng hp c 2. 4 Phng phỏp nghiờn cu 2. 4.1 Phng phỏp tng hp 5- (3- bromobenzyliden)- 2- thiohydantoin v dn cht base Mannich 20 - S dng cỏc phng phỏp thc nghim trong húa hu... Gosling [ 15] v Jỏnos Marton [23 ] S phn ng: OH H2N O Glycin NH4SCN, Ac2O 1000C, 30 phỳt O H N S HCl 10% O H N S N đun hồi l-u, 1 giờ O 1-acetyl -2- thiohydantoin (A) N H 2- thiohydantoin (BT) - Tng hp 5- (3- bromobenzyliden)- 2- thiohydantion (I) bng phn ng ngng t 2- thiohydantoin (BT) vi 3-bromobenzaldehyd: - Tng hp cỏc dn cht base Mannich ca 5- (3- bromobenzyliden)- 2thiohydantion (Ia-c) theo s phn ng sau: 24 3.1.1... 47,09% Nhit núng chy: 158 - 159 0C Rf = 0,94 (TLC, silicagel 60 F 25 4 , h dung mụi CH2Cl2 : MeOH (14:1)) Rf = 0,77 (TLC, silicagel 60 F 25 4 , h dung mụi H2O : AcOH : MeOH (5: 1:4)) IR (KBr, max (cm-1)): xem ph lc 4.1, bng 3.3 1 H-NMR (50 0 MHz, DMSO-d6), (ppm): xem ph lc 4 .2, bng 3.3 13 C-NMR (1 25 MHz, DMSO-d6), (ppm): xem ph lc 4.3, bng 3.4 ESI - MS, (m/z, %): xem ph lc 4.4, bng 3 .5 2) 5- (3- bromobenzyliden)- 3-piperidinomethyl -2- thiohydantoin. .. Ar H C N CH2CH2OH Ar - H2O C H N CH2CH2OH OH H - Xỳc tỏc base (ethanolamin) ly i 1 Hydro ca nhúm methylen hot ng ca 2- thiohydantoin to carbanion Anion ny tn cụng vo imin to thnh hp cht trung gian -aminocarbonyl 14 HOH2CH2C NH2 O H H HN O H N R - HOCH3NH2 O H N Ar NH HN CH2CH2OH HO(H2C )2 N S S O H C H + H2O HN NH HN S H CH NH HN S Ar O H NH H C Ar - OH HN NH HO(H2C )2 S O NH S - Hp cht trung gian tỏch... tin lit tuyn R5 R4 Ar Ar R1 O NH HN R3 R2 S 21 Cỏc dn cht th v trớ 5 ca 2- deoxyuridin bi cỏc d vũng 5 cnh ó c nghiờn cu th tỏc dng khỏng virus [14], trong ú cú dn cht 5- (5bromothien -2- yl) -2- deoxyuridin v 5- (5- clorothien -2- yl) -2- deoxyuridin (21 ) cú tỏc dng c ch s nhõn lờn ca virus Herpes typ 1 Tỏc gi El-Barbary [14] ó s dng 5- methylen -2- thiohydantoin l d vũng 5 cnh tin hnh phn ng vi 2- deoxyuridin . 20 15 BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MAI CÔNG HƢNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5- (3’- BROMOBENZYLIDEN )-2- THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH. BỘ Y TẾ TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI MAI CÔNG HƢNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH KHÁNG TẾ BÀO UNG THƢ CỦA 5- (3’- BROMOBENZYLIDEN )-2- THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH . QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1 Tổng hợp hóa học 23 3.1.1 Tổng hợp 2 -thiohydantoin 24 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 5- (3‟-bromobenzyliden )-2- thiohydantoin 25 3.1.3 Tổng hợp một số dẫn chất base Mannich