Thử tác dụng gây độc tế bào ung thƣ của các chất tổng hợp đƣợc theo phƣơng pháp SRB [18], [29], [33].
Nguyên tắc:
Đây là phƣơng pháp thử nghiệm in vitro để đo sự tăng sinh và sống sĩt của tế bào. Tế bào ung thƣ đƣợc nuơi cấy trong đĩa 96 giếng.
Hợp chất Sulphorhodamin B (SRB) biến đổi thành aminoxanthin cĩ màu hồng, đƣợc các acid amin cần thiết trong tế bào sống hấp thu. Càng nhiều tế bào sống, sự hấp thu càng nhiều. Các tế bào sống, sau đĩ đƣợc cố định. Định lƣợng các chất màu đƣợc tế bào hấp thu bằng máy quang phổ kế ở bƣớc sĩng 495-515 nm. Từ đĩ tính đƣợc số lƣợng tế bào sống sĩt. Phƣơng pháp này hiện đang đƣợc áp dụng tại Viện nghiên cứu ung thƣ quốc gia Mỹ (National Cancer Institution - NCI).
Dịng tế bào thử nghiệm:
-Dịng tế bào Hep-G2 (tế bào ung thƣ gan).
Chất chuẩn dƣơng tính
Sử dụng chất chuẩn cĩ khả năng diệt tế bào: Ellipticine của hãng Sigma.
Tiến hành thử hoạt tính
-Tế bào ung thƣ đƣợc duy trì ở điều kiện tiêu chuẩn. Sau khi tế bào đƣợc hoạt hĩa phát triển đến phase log sẽ đƣợc sử dụng cho thử test với các chất thử đã chuẩn bị sẵn ở 4 - 10 thang nồng độ khác nhau, lặp lại ba lần trên phiến vi lƣợng 96 giếng đối với phƣơng pháp SRB.
-Mẫu thử nghiệm bao gồm: tế bào + mơi trƣờng nuơi cấy + mẫu thử đƣợc ủ trong tủ ấm CO2/370C để tế bào tiếp tục phát triển.
-Ủ đĩa nuơi cấy từ 48 giờ-72 giờ (37o
C, 5% CO2)cho phép chất thử phát huy tác dụng.
b/ Quy trình thử nghiệm độc tính tế bào theo phương pháp SRB [29]
-Tế bào sau khi đƣợc ủ từ 48-72 giờ đƣợc cố định bằng TCA ở 40
C trong 1 giờ, sau đĩ rửa sạch bằng nƣớc và để khơ tự nhiên.
-Thêm 50 μl dung dịch sulphorhodamin B (SRB) vào mỗi giếng của đĩa nuơi cấy, nhuộm ở nhiệt độ phịng trong 30 phút.
-Rửa sạch dung dịch sulphorhodamin B (SRB) dƣ bằng dung dịch acid acetic 1% 5 lần.
-Hồn trả sulphorhodamin B đã đƣợc nhuộm vào tế bào. Lắc kỹ để hịa tan hồn tồn.
-Đọc mật độ quang ở bƣớc sĩng 492-515 nm. Mật độ quang sẽ phản ánh số lƣợng tế bào sống sĩt.