Tổng hợp và thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư của 5benzyliden2thiohydrantoin và một số dẫn chất base mannich

BỘ Y TẾ fgh TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THU HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1101239 TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ CỦA 5-BENZYLIDEN-2-THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG THU HƯƠNG MÃ SINH VIÊN: 1101239 TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƯ CỦA 5-BENZYLIDEN-2-THIOHYDANTOIN VÀ MỘT SỐ DẪN CHẤT BASE MANNICH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Vũ Trần Anh Ths Hoàng Thu Trang Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa hữu HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Trần Anh Ths Hoàng Thu Trang, PGS TS Nguyễn Quang Đạt, Ds Tô Ái An hết lòng quan tâm, giúp đỡ hướng dẫn thời gian thực khóa luận Tôi xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình của: Ths Đặng Vũ Lương (Phòng NMR- Viện Hóa học- Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam), TS Phan Thị Nguyệt Hằng (Viện Dược liệu), TS Trần Thị Hồng Hà (Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên), TS Đào Thị Nhung (Bộ môn Hóa vật liệu- Khoa Hóa- Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội) toàn thể thầy cô giáo, cán kỹ thuật viên Bộ môn Hóa hữu cơ, thầy cô giáo trường, phòng ban - Trường Đại học Dược Hà Nội Mặc dù có nhiều cố gắng hạn chế thời gian, kiến thức tài liệu tham khảo nên khóa luận tránh khỏi sai sót, khiếm khuyết nội dung hình thức, mong nhận góp ý thầy cô để khóa luận hoàn thiện Hà Nội, ngày 12 tháng năm 2016 Sinh viên Hoàng Thu Hương MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tác dụng sinh học dẫn chất 2-thiohydantoin 1.1.1 Tác dụng ức chế tế bào ung thư 1.1.2 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm 1.1.3 Các tác dụng khác 10 1.2 Các phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin dẫn chất 11 1.2.1 Phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin 11 1.2.2 Phản ứng tổng hợp dẫn chất 5-benzyliden-2-thiohydantoin 13 1.2.3 Phản ứng tổng hợp dẫn chất base Mannich 17 CHƯƠNG NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ VÀ 19 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, hóa chất, dung môi 19 2.2 Thiết bị thí nghiệm 19 2.3 Nội dung nghiên cứu 20 2.4 Phương pháp nghiên cứu 20 2.4.1 Phương pháp tổng hợp 2-thiohydantoin, 5-benzyliden-2- 21 thiohydantoin dẫn chất base Mannich 2.4.2 Phương pháp xác định cấu trúc 21 2.4.3 Phương pháp thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư 21 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 24 3.1 Tổng hợp hóa học 24 3.1.1 Tổng hợp 2-thiohydantoin 25 3.1.2 Tổng hợp dẫn chất 5-benzyliden-2-thiohydantoin 27 3.1.3 Tổng hợp số dẫn chất base Mannich 5-benzyliden-2- 28 thiohydantoin 3.2 Xác định cấu trúc chất tổng hợp 33 3.2.1 Phổ hồng ngoại 33 3.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 33 3.2.3 Phổ khối lượng 33 3.3 Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư 39 3.4 Bàn luận 40 3.4.1 Về tổng hợp hóa học 40 3.4.1.1 Về phản ứng tổng hợp 2-thiohydantoin 40 3.4.1.2 Về phản ứng ngưng tụ tạo 5-benzyliden-2-thiohydantoin 42 3.4.1.3 Về phản ứng Mannich 43 3.4.2 Về xác định cấu trúc chất tổng hợp 44 3.4.2.1 Về phổ hồng ngoại (IR) 44 3.4.2.2 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR 45 3.4.2.3 Về xác định đồng phân hình học dẫn chất 5-benzyliden-2- 46 thiohydantoin base Mannich dựa phổ 1H-NMR 3.4.2.4 Về phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR 48 3.4.2.5 Về phổ MS 48 3.4.3 Về tác dụng gây độc tế bào ung thư 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 13 C-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance) H-NMR : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance) Ac2O : Anhydrid acetic AcOH : Acid acetic DMF : Dimethylformamid EtOH : Ethanol ESI : Phương pháp phun mù điện tử (Electron Spray Ionization) IC50 : Nồng độ ức chế 50% (Inhibitory Concentration 50) IR : Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) MeOH : Methanol MS : Khối phổ (Mass Spectrometry) Hep-G2 : Tế bào ung thư gan người DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1 Kết tổng hợp 2-thiohydantoin (BT) dẫn chất 33 (I, Ia-d) 3.2 Số liệu phổ 1H-NMR (A), (BM), (BT) 34 3.3 Số liệu phổ IR (I) dẫn chất base Mannich (Ia-d) 35 3.4 Số liệu phổ 1H-NMR (I) dẫn chất base Mannich 36 (Ia-d) 3.5 Số liệu phổ 13 C-NMR (I) dẫn chất base Mannich 37 Số liệu phổ ESI-MS (I) dẫn chất base Mannich (Ia- 37 (Ia-d) 3.6 d) 3.7 Kết thử hoạt tính ức chế tế bào ung thư dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 chất tổng hợp (theo phương pháp SRB) 46 ĐẶT VẤN ĐỀ Thuốc đóng vai trò to lớn công tác bảo vệ chăm sóc sức khỏe cộng đồng Việt Nam nói riêng giới nói chung Với vai trò quan trọng đó, việc nghiên cứu phát triển dược chất hoàn thiện hơn, hiệu đề lên hàng đầu Nguồn gốc dược chất vô đa dạng: chiết xuất từ thiên nhiên, bán tổng hợp, tổng hợp; tổng hợp hóa dược đường quan trọng giúp tìm nhiều hoạt chất ứng dụng rộng rãi mang lại lợi ích to lớn phòng bệnh chữa bệnh Một vấn đề sức khỏe toàn giới ung thư - tác nhân gây chết người hàng đầu Tại hội thảo “Tiếp cận điều trị ung thư hiệu đáp ứng khả chi trả” Bộ Y tế tổ chức ngày 12/4/2016 Hà Nội, Thứ trưởng Bộ Y tế Phạm Lê Tuấn cho biết năm nước có khoảng 150.000 ca ung thư mới, có 75.000 ca tử vong khiến Việt Nam trở thành quốc gia có tỷ lệ ung thư mức báo động Vì vậy, việc nghiên cứu phát triển hoạt chất có khả kháng tế bào ung thư với mục tiêu hiệu hơn, tác dụng phụ nhu cầu cấp thiết Trong lĩnh vực tổng hợp hóa dược, để nhanh chóng tạo thuốc mới, nhà nghiên cứu thường dựa cấu trúc chất dùng làm thuốc chất có hoạt tính sinh học có triển vọng để tạo chất dự đoán có tác dụng tốt hơn, độc tính có hiệu điều trị Trên giới, nhà khoa học quan tâm nghiên cứu tổng hợp hóa học, tác dụng sinh học ứng dụng làm thuốc dẫn chất 2thiohydantoin [9], [14], [29], [35]… Trong nhiều dẫn chất 5-aryliden-2thiohydantoin có tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus ức chế aldose reductase,… đáng quan tâm [1], [4], [6], [16], [20], [22], [36], [37] Để góp phần nghiên cứu, tìm kiếm dẫn chất 5-aryliden-2thiohydantoin có tiềm hoạt tính sinh học, đặc biệt có tác dụng tế bào ung thư, thực khóa luận với mục tiêu sau: Tổng hợp dẫn chất 5-benzyliden-2-thiohydantoin số dẫn chất base Mannich Thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 O 2' 1' 3' N 6' 4' 5' NH 6'' N 1'' S 5'' 2'' 3'' 4'' Phụ lục 5.3: Phổ 13C-NMR hợp chất (Ib) O 2' 1' 3' N 6' 4' 5' NH 6'' N 1'' S 5'' 2'' 3'' 4'' Phụ lục 5.4: Phổ MS hợp chất (Ib) O 2' 3' N 1' 6' 4' 5' NH 6'' N 1'' S 5'' 2'' N 3'' 4'' CH3 Phụ lục 6.1: Phổ IR hợp chất (Ic) O 2' 3' N 1' 6' 4' 5' NH 6'' N 1'' S 5'' 2'' N 3'' 4'' CH3 Phụ lục 6.2: Phổ 1H-NMR hợp chất (Ic) O 2' 3' N 1' 6' 4' 5' NH 6'' N 1'' S 5'' 2'' N 3'' 4'' CH3 Phụ lục 6.3: Phổ 13C-NMR hợp chất (Ic) O 2' 3' N 1' 6' 4' 5' NH 6'' N 1'' S 5'' 2'' N 3'' 4'' CH3 Phụ lục 6.4: Phổ MS hợp chất (Ic) O 2' 1' 3' N 6' 4' 5' NH 5'' N 1'' S 4'' 2'' 3'' Phụ lục 7.1: Phổ IR hợp chất (Id) O 2' 1' 3' N 6' 4' 5' NH 5'' N 1'' S 4'' 2'' 3'' Phụ lục 7.2: Phổ 1H-NMR hợp chất (Id) O 2' 1' 3' N 6' 4' 5' NH 5'' N 1'' S 4'' 2'' 3'' Phụ lục 7.3: Phổ 13C-NMR hợp chất (Id) O 2' 1' 3' N 6' 4' 5' NH 5'' N 1'' S 4'' 2'' 3'' Phụ lục 7.4: Phổ MS hợp chất (Id) PHỤ LỤC 8: PHIẾU TRẢ LỜI KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO (CYTOTOXICITY ASSAY) Chú thích: STT Ký hiệu mẫu Khóa luận Phiếu trả lời kết I TAH0 Ia TAH4 Ib TAH3 Ic TAH2 Id TAH1 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN Phòng Sinh học thực nghiệm Nhà 1H, số 18 Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy – Hà Nội -o0o Số: /SHTN-TLKQ Hà Nội, ngày tháng năm 2016 PHIẾU KẾT QUẢ Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào Nguời gửi mẫu: Vũ Trần Anh Cơ quan/địa chỉ: Đại học Dược Hà Nội Số lượng mẫu: 05 Loại mẫu: Mẫu tinh Ngày nhận: 16/3 /2016 Ngày trả kết quả: 22/3/2015 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Theo phương pháp Skehan & cs (1990) Likhiwitayawuid & cs (1993) áp dụng Viện nghiên cứu ung thư Quốc gia Mỹ (NCI) trường đại học Dược, đại học Tổng hợp Illinois, Chicago, Mỹ Dòng tế bào  Dòng Hep-G2 (Human liver carcinoma – Ung thư gan) Môi trường dụng cụ, hóa chất:  Môi trường DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) MEME (Minimum Essential Medium with Eagle’s salt) có bổ sung L- glutamine, Sodium piruvat, NaHCO3, PSF (Penicillin- Streptomycin sulfate Fungizone); NAA (Non-Essential Amino Acids); 10% BCS (Bovine Calf Serum)  Tripsin-EDTA 0,05%; DMSO (Dimethyl Sulfoside); TCA (Trichloro Acetic acid); Tris Base; PBS (Phosphate Buffered Saline); SRB (Sulfo Rhodamine B); Acid Acetic  Các dụng cụ dùng lần: Bình nuôi cấy tế bào, phiến vi lượng 96 giếng, pipet pasteur, đầu týp cho micropipet… Chất chuẩn chứng dương tính:  Dùng chất chuẩn có khả diệt tế bào: Elliticin pha DMSO Tính kết quả:  Kết đọc máy ELISA bước sóng 495-515 nm  Giá trị CS (Cell Survival): khả sống sót tế bào nồng độ chất thử tính theo % so với đối chứng Dựa kết đo chúng OD (ngày 0), DMSO 10% so sánh với giá trị OD trộn mẫu để tìm giá trị CS (%) theo công thức: %= OD (mẫu) − OD (ngày 0) 100 OD (DMSO) − OD (ngày 0)  Giá trị CS% sau tính theo công thức trên, đựơc đưa vào tính toán Excel để tìm % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn phép thử lặp lại lần theo công thức Ducan sau: Độ lệch tiêu chuẩn σ = (∑( − ̅ )^2)/( − 1)  Các mẫu có biểu hoạt tính (CS < 50%) chọn để thử nghiệm tiếp để tìm giá trị IC50 Cách tính giá trị IC50: Dùng giá trị CS 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình Table curve theo thang gía trị logarit đường cong phát triển tế bào nồng độ chất thử để tính giá trị IC50 Công thức: 1/y = a + blnX Trong Y: nồng độ chất thử; X: Giá trị CS (%) Tài liệu tham khảo Likhitayawuid K., Angerhofer C.K (1993) Cytotoxic and antimalarial bisbenzylisoquinoline alkaloids from Sephania evecta, Jounal of Natural Products 56 (1) pp 30-38 Skehan P., Storeng R., Scudiero D., Monks A., McMahon J., Vistica D., Warren J.T., Bokesch H., Kenney S., Boyd M.R (1991) New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer agents Eur J Cancer 27: 1162–1168 KẾT QUẢ TT Ký hiệu mẫu Nồng độ đầu Cell survival (%) mẫu (g/ml) Dòng tế bào Hep-G2 DMSO Kết luận 100,0 Ellipticin (+) 3,12±0,8 Dương tính TAH0 10 94,17±0,8 Âm tính TAH1 10 92,99±1,4 Âm tính TAH2 10 95,40±1,2 Âm tính TAH3 10 89,04±0,9 Âm tính TAH4 10 97,24±1,2 Âm tính Kết luận: Các mẫu thử (TAH0, TAH1, TAH2, TAH3 TAH4) không biểu hoạt tính ức chế dòng tế bảo ung thư gan Hep-G2 in vitro nồng độ thử nghiệm Xác nhận Viện Phó trưởng phòng TS Trần Thị Như Hằng Người đọc kết Trần Thị Hồng Hà [...]... húa cht, dung mụi STT Tờn nguyờn liu Ngun gc Hm lng 1 Glycin Trung Quc 99% 2 Amoni thiocyanat Trung Quc 98,5% 3 Benzaldehyd Merck 98% 4 Formaldehyd Trung Quc 37-40% 5 Morpholin Merck 98% 6 Piperidin Merck 98% 7 N-methyl piperazin Merck 99% 8 Pyrolidin Merck 99 9 Aceton Trung Quc 99% 10 Anhydrid acetic Trung Quc 99% 11 Natri acetat Trung Quc 99% 12 Methanol Trung Quc 99,5% 13 Hexan Trung Quc... khoa Húa hc, trng i hc Khoa hc T nhiờn, i hc Quc gia H Ni 2.3 Ni dung nghiờn cu - Tng hp v xỏc nh cu trỳc dn cht 5-benzyliden-2-thiohydantoin v mt s dn cht base Mannich - Th nghim hot tớnh gõy c t bo trờn dũng t bo ung th gan HepG2 ca cỏc cht tng hp c 2.4 Phng phỏp nghiờn cu 2.4.1 Phng phỏp tng hp 5-benzyliden-2-thiohydantoin v dn cht base Mannich - S dng cỏc phng phỏp thc nghim trong húa hu c tng hp... tng hp cỏc base Mannich trong iu kin dung mụi EtOH, kt qu thu c cht (Ia) v (Ib) cú kt tinh sau khi phn ng, hiu sut khong 65%; cỏc cht (Ic) v (Id) khụng kt tinh, sau ct quay hiu sut thp, sn phm b keo, d chy lng Kt qu trờn l do tan ca cỏc amin khỏc nhau, dn n s khỏc nhau gia tan ca cỏc base Mannich tng hp c Vỡ vy, da vo ti liu [5] chỳng tụi tin hnh kho sỏt phn ng ng iu ch (Ic) v (Id) vi dung mụi isopropanol,... 3.5 3.1.3 Tng hp mt s dn cht base Mannich ca 5-benzyliden-2thiohydantoin (Ia-d) Trong phn tng quan, chỳng tụi ó trỡnh by v phn ng Mannich Cn c trờn cỏc kt qu nghiờn cu ó cụng b, chỳng tụi chn iu kin tin hnh phn ng Mannich ca 5-benzyliden-2-thiohydantoin (I) l nhit 850C vi t l s mol dn cht 2-thiohydantoin : formaldehyd : amin l 1:1:1 Chỳng tụi tin hnh tng hp mt s dn cht Mannich ca cht (I) bng cỏch cho... acetat trong dung mụi acid acetic tng hp 5-arylidene-2-thiohydantoin (5-benzylidene-2-thiohydantoin ) i t benzaldehyd 1.2.3 Phn ng tng hp cỏc dn cht base Mannich Phn ng Mannich l phn ng aminomethyl húa cỏc hp cht hu c cú nguyờn t H linh ng bng tỏc dng ca formaldehyd (hoc cỏc aldehyd khỏc) v cỏc amin bc 1, amin bc 2 hoc amoniac [23], [31] R1 R H + CH2O + HN R H2 C 2 R R1 N R2 Phn ng Mannich thng c... enol to ra hp cht cha nhúm aminomethyl (base Mannich) : R1 H O C C C H + H2C O N R2 C OH C C H2 C N R1 R2 O -H+ C C H2 C N - H+ [Typ R1 R2 + Trng hp hp cht cú hydro linh ng khụng cú kh nng enol húa (nh trng hp hydro linh ng cỏc liờn kt N-H, S-H, Se-H, P-H hoc liờn kt C-H nhõn indol, pyrol) thỡ cation aminomethyl phn ng vi nguyờn t mang H linh ng to ra sn phm base Mannich: R2 R H + H2C -H+ R N R1 -H +... nh: khỏng t bo ung th [8], [9], khỏng t bin gen [29], khỏng virus [14], khỏng virus HIV [20], khỏng khun [17], [21], [22], c ch enzyme aldose reductase [33] Ngoi ra 2-thiohydantoin cũn c s dng nhiu trong cỏc lnh vc khỏc nh sn xut thuc tr sõu [34], thuc nhum [34] 1.1.1 Tỏc dng c ch t bo ung th Merbaron l mt dn cht ca 2-thiobarbituric, cú tỏc dng gõy c t bo vi t bo ung th mỏu v mt s t bo ung th khỏc O... 99% 12 Methanol Trung Quc 99,5% 13 Hexan Trung Quc 99,5% 14 Ethyl acetat Trung Quc 99,5% 15 Dicloromethan Trung Quc 99% 16 Ethanol tuyt i c Giang (VN) 99,5% 17 Ethanol 96o c Giang (VN) 99,5% 18 Dimethyl formamid Trung Quc 95% 19 Bn mng silicagel Merck Silicagel 60 F254 2.2 Thit b thớ nghim - Dng c thy tinh (bỡnh cu 3 c dung tớch 100ml, sinh hn, ng ong, cc cú m cỏc loi, bỡnh lc hỳt ) - Dng c s (phu... dng chng ung th ca cỏc dn cht (thio)hydantoin rt ỏng quan tõm [11], [16], [35] Dn cht (thio)hydantoin cú tỏc dng c ch quỏ trỡnh phosphoryl húa t ng v bit húa mt s t bo ung th do yu t EGFR (receptor ca yu t tng trng biu mụ) [11], [35] Mt s nghiờn cu ca tỏc gi Tụ i An [1], tỏc gi Trn c Lai [6], tỏc gi Mai Cụng Hng [4] gn õy cho thy mt s dn cht ca 5-aryliden2-thiohydantoin cú tỏc dng c ch t bo ung th gan... trỳc ca cỏc sn phm tng hp c Cỏc s liu ph ca cỏc cht tng hp c i chiu vi ti liu 2.4.3 Phng phỏp th hot tớnh gõy c t bo ung th Th tỏc dng gõy c t bo ung th ca cỏc cht tng hp c theo phng phỏp SRB [10], [18], [28] Nguyờn tc õy l phng phỏp th nghim in vitro o s tng sinh v sng sút ca t bo T bo ung th c nuụi cy trong a 96 ging Hp cht Sulphorhodamin B (SRB) bin i thnh aminoxanthin cú mu hng, c cỏc acid amin cn