Phân lập xác định cấu trúc và đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thư một số hợp chất hóa học từ loài thực vật tri mẫu anemarrhena asphodeloides

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM ĐÀO MAI PHƢƠNG PHÂN LẬP, XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH ỨC CHẾ TẾ BÀO UNG THƢ MỘT SỐ HỢP CHẤT HĨA HỌC TỪ LỒI THỰC VẬT TRI MẪU (Anemarrhena asphodeloides ) Ngành: Hóa hữu Mã số: 8.44.01.14 LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS PHẠM VĂN KHANG THÁI NGUYÊN - 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Học viên Đào Mai Phƣơng NHẬN XÉT CỦA NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN KHOA CHUYÊN MƠN HƢỚNG DẪN i LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành bày tỏ lịng kính trọng lời cảm ơn sâu sắc tới TS Phạm Văn Khang - người thầy tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn, động viên tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi suốt q trình học tập, nghiên cứu thực luận văn Đồng thời xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô giáo học viên cao học K24 phịng thí nghiệm Hóa hữu tạo mơi trường nghiên cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tơi hồn thành kế hoạch nghiên cứu Tôi xin chân thành cảm ơn em sinh viên nghiên cứu đề tài khoa học hợp chất thiên nhiên cộng tác với trong việc tiến hành thí nghiệm thuộc đề tài luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban lãnh đạo khoa Hóa phòng Đào tạo sau đại học - trường Đại học Sư phạm Thái Nguyên tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Thái ngun, tháng năm 2018 Học viên ĐÀO MAI PHƢƠNG ii MỤC LỤC Trang Trang bìa phụ Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt dùng luận văn iv Danh mục bảng v Danh mục hình vi MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Khái quát loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) 1.1.1 Đặc điểm thực vật học 1.1.2 Cơng dụng lồi Tri mẫu[1] 1.2 Tình hình nghiên cứu hoạt tính sinh học lồi Tri mẫu 1.3 Tình hình nghiên cứu thành phần hóa học lồi Tri mẫu 14 1.3.1 Nhóm hợp chất saponin 14 1.3.2 Nhóm hợp chất phenolic 21 Chƣơng THỰC NGHIỆM 25 2.1 Hóa chất thiết bị phân lập 25 2.1.1 Hóa chất 25 2.1.2 Hóa chất tế bào dùng để thử hoạt tính sinh học 25 2.1.3 Thiết bị 25 2.2 Phương pháp xử lý mẫu thực vật, chiết tách xác định cấu trúc chất phân lập 26 2.2.1 Xử lý mẫu thực vật 26 2.2.2 Chiết tách chất 26 2.2.3 Xác định cấu trúc chất 26 2.3 Phương pháp thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư 26 2.3.1 Vật liệu hóa chất 26 2.3.2 Phương pháp xác định tính độc tế bào ung thư (cytotoxic assay) 27 2.4 Chiết xuất hợp chất từ thân rễ Tri mẫu 28 iii 2.4.1 Chiết xuất cao etanol từ thân rễ loài Tri mẫu 28 2.4.2 Phân lập, tinh chế hợp chất 28 2.4.3 Các giá trị phổ 1H, 13C-NMR AA1, AA2 AA3 31 2.4.4 Xác định hoạt tính độc tế bào dòng tế bào HeLa ( tế bào ung thư cổ tử cung) tế bào A549 (tế bào ung thư gan) 32 Chƣơng KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết phân lập hợp chất 34 3.2 Kết xác định cấu trúc hợp chất 34 3.2.1 Phân tích cấu trúc hợp chất AA1 34 3.2.2 Phân tích cấu trúc hợp chất AA2 41 3.2.3 Phân tích cấu trúc hợp chất AA3 47 3.3 Kết nghiên cứu hoạt tính độc tế bào dòng tế bào ung thư HeLa (cổ tử cung) A549 (tế bào ung thư gan) 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 PHỤ LỤC iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN 13 C-NMR : 13C-Nucler Magnetic Resonance : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C H-NMR : 1H-Nucler Magnetic Resonance : Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H NOESY : Nuclear Overhauser Spectroscopy : Phổ tương quan hai chiều H-H DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Tranfer : Phổ DEPT ESI-Ms : Electron Impact Mass Spectroscopy : Phổ khối lượng HMBC : Heternuclear multiple - Bond Corelation : Phổ tương quan hai chiều H-C HSQC : Heternuclear Spectroscopy- Quantum Coherence : Phổ tương tác C-H RP : Reversed – Phase Chromatography NP : Normal – Phase Chromatography iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Kết hạ đường huyết dịch chiết nước Tri mẫu [3] 11 Bảng 1.2 Kết hạ đường huyết cao Tri mẫu chiết cồn 80o [3] 11 Bảng 3.1: Mốt số tín hiệu cộng hưởng 1H-NMR chất AA1 Sarsasapogenin 35 Bảng 3.2 Giá trị phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H 13C 37 Bảng 3.3 Sự tương quan HC chất AA3 50 Bảng 3.4: Tác động gây độc tế bào ung thư mẫu nghiên cứu 53 v DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình vẽ mơ tả lồi Tri mẫu Hình 1.2 Hình ảnh loài Tri mẫu Hình 2.1 Sơ đồ sắc kí cột silicagel từ cao chiết n-butanol 29 Hình 3.1 Phổ 1H-NMR chất AA1 34 Hình 3.2 Phổ 13C-NMR chất AA1 36 Hình 3.3 Phổ DEPT-135 chất AA1 36 Hình 3.4 Phổ HSQC chất AA1 39 Hình 3.5 Sự tương quan HC chất AA1 (HMBC) 39 Hình 3.6 Phổ MS chất AA1 40 Hình 3.7 Cơng thức cấu tạo AA1 41 Hình 3.8 Phổ 1H-NMR chất AA2 42 Hình 3.9 Phổ 13C-NMR chất AA2 43 Hình 3.10 Phổ DEPT-135 chất AA2 43 Hình 3.11 Phổ HSQC chất AA2 45 Hình 3.12 Sự tương quan HC chất AA2 (HMBC) 45 Hình 3.13 Phổ MS chất AA2 46 Hình 3.14 Công thức cấu tạo AA2 47 Hình 3.15 Phổ 1H-NMR chất AA3 48 Hình 3.16 Phổ 13C-NMR chất AA3 48 Hình 3.17 Phổ HSQC chất AA3 49 Hình 3.18 Sự tương quan HC chất AA3 (HMBC) 50 Hình 3.19 Phổ khối lượng AA3 51 Hình 3.20 Cơng thức cấu tạo AA3 51 Hình 3.21 Hình ảnh ức chế tế bào A549 54 Hình 3.22 Hình ảnh ức chế tế bào Hela 54 vi MỞ ĐẦU Ngành hóa học hợp chất thiên nhiên ngày khẳng định vai trò quan trọng nghiên cứu sử dụng thuốc Các nghiên cứu từ hợp chất thiên nhiên tạo tiền đề nguồn cung cấp nguyên liệu cho ngành công nghiệp, nông nghiệp, mĩ phẩm, dược phẩm Các hợp chất tìm thấy thiên nhiên có hoạt tính sinh học tốt dùng trực tiếp y học Ngày nay, hợp chất thiên nhiên dẫn xuất chúng chiếm 50% lượng thuốc điều trị lâm sàng Việt Nam ta có nguồn hợp chất thiên nhiên vô phong phú đa dạng, phân bố toàn đất nước Từ nhiều kỉ trước, người nghiên cứu sử dụng trực tiếp thuốc, thuốc từ thiên nhiên để chữa nhiều bệnh hiệu Tuy nhiên ngày nay, ô nhiễm môi trường, thực phẩm bẩn, thói quen sinh hoạt xấu làm gia tăng ngày nhiều loại bệnh nghiêm trọng như: ung thư, tiểu đường, béo phì, tim mạch, tiêu hóa Vì việc tìm hiểu nghiên cứu sâu hợp chất thiên nhiên có hoạt tính tốt vơ quan trọng Trong số nguồn thảo dược phong phú đặc biệt ý loài Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides Bunge) thuộc họ Thùa (Agavaceae) Loài thường mọc hoang trồng phổ biến vùng núi phía Bắc nước ta Trên giới, có nhiều cơng trình nghiên cứu lồi Tri mẫu chứng minh dịch chiết hợp chất phân lập từ lồi thực vật có khả ức chế nhiều dòng tế bào ung thư, có khả bảo vệ tế bào nhiều tác dụng khác Ở Việt Nam chưa có nhiều cơng trình nghiên cứu thành phần hóa học lồi Tri mẫu, việc khai thác sử dụng thực vật chưa quan tâm mức Dó chúng tơi đề xuất đề tài: „„Phân lập, xác định cấu trúc đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ số hợp chất hóa học từ lồi thực vật Tri mẫu (Anemarrhena asphodeloides)” Đề tài hồn thành cung cấp thơng tin khoa học giá trị làm sở khoa học quan trọng để sử dụng loài thực vật làm thuốc chữa bệnh sàng lọc hợp chất có hoạt tính tốt để tiến hành nghiên cứu Đồng thời góp phần vào đào tạo nguồn nhân lực cho vùng núi phía Bắc nước 20 Tsukamoto S, Wakana T, Koimaru K, Yoshida T, sato M, Ohta T (2005), “7-Hydroxy-3-(4-hydroxybenzyl) chromanand Broussonin B: Neurotrophic Compounds, Isolated from Anemarrhena asphodeloides Bunge, Functionas Proteasome Inhibitors”, Biol Pharm Bull, 28(9), 1798-1800 21 Hu Y, Xia Z, Sun Q, Orsi A, Rees D (2005), "A new approach to the pharmacological regulation of memory: Sarsasapogenin improves memory by elevating the low muscarinic acetylcholine receptor density in brains of memory-deficit rat models", Brain research, 1060(1-2), 26-39 22 Kang L P, Ma B, shit T, Zang J, Xiong C (2006), “two new furostanol saponins from rhizomes of Anemarrhena asphodeloides ”, Acta Pharmaceu Sinica, 41(6), 527-532 23 Nian H, Qin L P, Chen W S, Zhang Q Y, Zheng H C, Wang Y (2006), "Protective effect of steroidal saponins from rhizome of Anemarrhena asphodeloides on ovariectomy-induced bone loss in rats", Acta Pharmacologica Sinica, 27(6), 728-734 24 Ren L X, Luo Y F, Li X, Zuo D.Y, Wu Y L (2006), "Antidepressant-Like Effects of Sarsasapogenin from Anemarrhena asphodeloides Bunge", Bio Pharn Bull, 29(11), 2304-2306 25 Sun Q, Sun A, Liu R (2006), “Preparative isolation and purification of compounds asphodeloides from by the Chinese high-speed medicinal herb counter-current Anemarrhena chromatography”, Chromatography A, 1104, 69 -74 26 Xiao SZ, Xu ME, Ge YK, Xiao GF (2006), " Inhibitory effects of saponins from Anemarrhena asphodeloides Bunge on the growth of vascular smooth muscle cells", Biomedical and Environmental Sciences, 19(3), 185-191 27 Bae G, Yu JR, Lee J, Chang J, Seo EK (2007), "Identification of nyasol and structurally related compounds as the active principles from Anemarrhena asphodeloides against respiratory syncytial virut (RSV)", Chem Biodivers, 4(9), 2231-2235 58 28 Bao W, Pan H, Lu M, Ni Y, Zhang R, Gong X(2007), "The apoptotic effect of Sarsasapogenin from Anemarrhena asphodeloides on HepG2 human hepatoma cells", Cell Biology International, 31(9), 887-892 29 Oh J K, Hyun S Y, Oh H R, Jung J W, Park C, Lee S Y, Park J H, Kim S Y, Kim K H, Kim Y K, Ryu J H (2007), "Effects of Anemarrhena asphodeloides on Focal Ischemic Brain InJury Induced by Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats", Bio Pharn Bull, 30(1), 38-43 30 Peng Y, Sun Y, Liu L, Liu B, Lin D, Li L, Song S(2007), saponins from Anemarrhena asphodeloides “Two new Bunge”, Chinese Chemical Letters, 18, 171-174 31 Sy L K, Che C M, Yan S C, Lok C N, Man R Y (2008), "Timosaponin A-III induces autophagy preceding mitochondria-mediated apoptosis in HeLa cancer cells", Cancer Res, 68, 10229-10237 32 Zhang Y, Xia Z, Hu Y, Orsi A, Rees D (2008), "Role of glial cell derived Role of glial cell derived neurotrophic factor in the protective effect of smilagenin on rat mesencephalic dopaminergic neurons damaged by MPP ”, FEBS Letters,582,956–960 33 Ni Y, Gong X G, Lu M, Chen H M, Wang Y (2008), "Mitochondrial ROS burst as an early sign in sarsasapogenin-induced apoptosis in HepG2 cells", Cell Biology International, 32, 337-343 34 Nicholson Ralph, Vermerris Wilfred (2008), “Phenolic Compound Biochemistry”, springer, USA, 35 Qin L, Han T, Zhang Q, Cao D, Nian H, Rahman K, Zheng H(2008), “Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula”, Journal of Ethnopharmacology, 118(2), 271-279 36 Shin J S, Noh Y S, Kim D H, Cho Y W, and Lee K T (2008), "Mangiferin isolated from the rhizome of Anemarrhena asphodeloides inhibits the LPS-induced nitric oxide and prostagladin E2 via the NF- κB inactivation in inflammatory macrophages", Natural product sciences, 14(3), 206-213 59 37 Youn U J, Lee Y S,Jeung H, Nam J W, Lee Y J, son Y M, Hwang E S, seo E K (2009), "Minor phenolic constituents of the Anemarrhena asphodeloides ", Natural Product Sciences, 15(4), 2003-2007 38 Lee B, Jung K, Kim D K (2009), “Timosaponin A-III, a saponin isolated from Anemarrhena asphodeloides , ameliorates learning and memory deficits in mice”, Pharmacol Biochem Behav, 93(2), 121-127 39 Lim H, Nam J W, Seo E K, Kim Y S, Kim H P (2009), " (-)-Nyasol (cishinokiresinol), a Norneolignan from the Rhizomes of Anemarrhena asphodeloides , is a Broad Spectrum Inhibitor of Eicosanoid and Nitric Oxide Production", Arch Pharm Res, 32(11), 1509-1514 40 Lu WQ, Qiu Y, Li TJ, Tao X, sun LN, Chen WS (2011), “antiplantelet and antithrombotic activities of timosaponin B-II, an extract of Anemarrhena asphodeloides ”, Clin Exp Pharmacol Physiol, 38(7), 430-434 41 Miura T, Ichiki H, Iwamoto N, Kato M, Kubo M, Sasaki H, Okada M, Ishida T, Seino Y, Tanigawa K (2011), " Antidiabetic activity of the rhizoma of Anemarrhena mangiferin and its asphodeloides and active components, glucoside", Biol Pharm Bull, 24(9), 1009-1011 42 Xiao S F, Xue H B, Li X, Chen C, Li G J, Yuan C M, Zhang M Y(2011), "A double-blind, placebo-controlled study of traditional Chinese medicine sarsasapogenin added to risperidone in patients with negative symptoms dominated schizophrenia", Neurosci Bull, 27(4), 258-268 43 Chae S, Piao M J, Kang K A, Zhang R, Kim K C, Youn U J, Nam K W, Lee J H, Hyun J W (2011), "Inhibition of Matrix metalloproteinase-1 induced by oxidative stress in human keratinocytes by mangiferin isolated", Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 75(12), 2321-2325 44 Han SY, Chin YW(2011), "A FLT3-inhibitory constituent from the rhizomes of Anemarrhena asphodeloide", Journal of Enzyme Inhibition andMedicinal Chemistry, 26(3),445-448 60 45 Kang Y J, Chung H J, Nam J W, Phark H J, seo E K, Kim Y S, Lee D, Lee S K (2011), “Cytotoxic and antineoplastic activity of timosaponin AIII for human colon cacer cells”, J Nat Prod, 74(4), 701-706 46 Kim H S, Song J H, Youn U J, Hyun J W, Jeong W S, Lee M Y, Choi H J, Lee H K, Chae S (2012), "Inhibition of UVB-induced wrinkle formation and MMP-9 expression by mangiferin isolated from Anemarrhena asphodeloides ", European Journal of Pharmacology, 689(3), 38-44 47 Park E , Yang Y J, Kim A, Kwak J H, Jung Y H, Kang S C, Kim I S (2012), “Synthesis of norlignans and in vitro inhibitory activity of antigeninduced degranulation”, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 22, 3653-3655 48 Huang J F, Shang L, Liu P, Zhang M Q, Chen S, Chen D, Fan C L, Wang H, Xiong K (2012), "Timosaponin-BII inhibits the up-regulation of BACE1 induced by Ferric Chloride in rat retina", BioMed central, 12(189) 49 Jung J S, Jung K, Kim DH, Kim HS(2012), "Selective inhibition of MMP9 gene expression by mangiferin in PMA-stimulated human astroglioma cells: Involvement of PI3K/Akt And MAPK Signaling pathways", Pharmacological Research, 66, 95-103 50 Kwon J, KondaJi G, song S, Kim C, Lee K, Kim W, Choi Y (2013), “Synthesis of Naturally Occurring Norlignan (±)-Nyasol”, Bull Korean Chem Soc, 34(4), 1247-1249 51 Lee H J, Li H, Chang H R, Jung H, Lee D Y, Ryu J H (2013), "(-)Nyasol, isolated from Anemarrhena asphodeloides suppresses neuroinflammatory response through the inhibition of I-κBα degradation in LPS stimulated BV-2 microglial cells", Inhibition and Medicinal Chemistry, 28(5), 954-959 52 Li X, Cui X, Wang J, Yang J, sun X, Li X, Zhu Q, Li W (2013), “Rhizome of Anemarrhena asphodeloides counteracts diabetic ophthalmopathy progression in streptozotocin-induced diabetic rats”, Phytother Res, 27(8), 1243-1250 61 53 Liu Q B , Peng Y , Li L Z , Gao P Y, sun Y, Yu L H & Son S J (2013), "Steroidal saponins from Anemarrhena asphodeloides ", Journal of Asian Natural Products Research, 15(8), 891-898 54 Shen S, Zhang Y, Zhang R, Gong X(2013), "Sarsasapogenin induces apoptosis via the reactive oxygen species-mediated mitochondrial pathway and ER stress pathway in HeLa cells", Biochemical and Biophysical Research Communications, 441(2), 519-524 55 Jang S E, Jeong J J, Huam S R, Han M J, Kim D H (2013), “anticolitic effect of the Rhizome mixture of Anemarrhena asphodeloides and Coptidis chinensis (AC-mix) in mice”, Biomol ther (Seoul), 21(5), 398-404 56 Liu M, Tao L, Chau S L, Wu R, Zhang H, Yang Y, Yang D, Bian Z, Lu A, Han Q, Xu H (2014), "Folding fan mode counter-current chromatography offers fast blind screening for drug discovery Case study: finding anti-enterovirut 71 agents from Anemarrhena asphodeloides ", Journal of Chromatography A, 14(1368), 116-124 57 Yuan J C, Zhang J, Wang F X, Pang X, Zhao Y, Xiong C Q, Ma B P (2014), "New steroidal glycosides from the rhizome of Anemarrhena asphodeloides ", Asian Natural Products Research, 16(9), 901-909 58 Appian Subramoniam (2016), Plants with anti-diabetes mellitus properties, Taylor & Francis Group, U.S, 58-59 59 Sy L K, Lok C N, Wang J Y, Liu Y, Cheng L, Wan P K, Leung C T, Cao B, Kwong W L, Chang C C Che C M (2016), “Identification of "sarsasapogenin-aglyconed" timosaponins as novel Ab-lowering modulators of amyloid precursor protein processing”, Chemical Science 60 Bing-You Yang, Xue-Yan Bi, Yan Liu, Guo-Yu Li, Xin Yin and Hai-Xue Kuang (2017) “Four New Glycosides from the Rhizoma of Anemarrhena asphodeloides”, Molecules , 22 61 P.V.Khang, D.M.Phuong, Lei Ma (2017), “New steroids from Anemarrhena asphodeloides rhizome and their α-glucosidase inhibitory activity” , Journal of Asian Natural Products Research, vol 19 (5), 468-473 (SCI-E) 62 PHỤ LỤC Hình S1: Phổ 1H-NMR giãn chất AA1 Hình S2: Phổ 1H-NMR giãn chất AA1 Hình S3: Phổ 13C-NMR giãn chất AA1 Hình S4: Phổ 13C-NMR giãn chất AA1 Hình S5: Phổ DEPT giãn chất AA1 Hình S6: Phổ HSQC giãn chất AA1 Hình S7: Phổ HSQC giãn chất AA1 Hình S8: Phổ HMBC giãn chất AA1 Hình S9: Phổ HMBC giãn chất AA1 Hình S10: Phổ NOESY chất Hình S11: Phổ 1H-NMR giãn chất AA2 Hình S12: Phổ 1H-NMR giãn chất AA2 Hình S13: Phổ 13C-NMR giãn chất AA2 Hình S14: Phổ 13C-NMR giãn chất AA2 Hình S15: Phổ DEPT giãn chất AA2 Hình S16: Phổ HSQC giãn chất AA2 Hình S17: Phổ HSQC giãn chất AA2 Hình S18: Phổ HMBC giãn chất AA2 Hình S19: Phổ HMBC giãn chất AA2 ... phần hóa học lồi Tri mẫu, việc khai thác sử dụng thực vật chưa quan tâm mức Dó chúng tơi đề xuất đề tài: „? ?Phân lập, xác định cấu trúc đánh giá hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ số hợp chất hóa học. .. tinh chế hợp chất 28 2.4.3 Các giá trị phổ 1H, 13C-NMR AA1, AA2 AA3 31 2.4.4 Xác định hoạt tính độc tế bào dòng tế bào HeLa ( tế bào ung thư cổ tử cung) tế bào A549 (tế bào ung thư gan)... để xác định cậu trúc đánh giá hoạt tính sinh học 3.2 Kết xác định cấu trúc hợp chất 3.2.1 Phân t ch cấu trúc hợp chất AA1 Cấu trúc hóa học AA1 xác định dựa vào kết hợp phổ 1HNMR, 13C-NMR, HSQC,