Đánh giá tác dụng hạ acid uric thực nghiệm của mán đỉa

Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat .... Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đ

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ ANH THƯ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC

THỰC NGHIỆM CỦA MÁN ĐỈA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THỊ ANH THƯ

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC

THỰC NGHIỆM CỦA MÁN ĐỈA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Thùy Dương

2 TS Nguyễn Quỳnh Chi

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Dược lực

2 Bộ môn Dược liệu

HÀ NỘI - 2015

Trước tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Thùy Dương,

TS Nguyễn Quỳnh Chi và TS Nguyễn Hoàng Anh, những người thầy đã luôn tận

tình hướng dẫn, quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, phòng Đào tạo cùng các

bộ môn, phòng ban khác của Trường đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên tại Bộ môn Dược lực và Bộ môn Dược liệu đã luôn tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Xin cám ơn những người bạn đã và đang cùng nghiên cứu khoa học tại Bộ môn Dược lực, những người luôn động viên, giúp đỡ và đóng góp ý kiến cho tôi hoàn thành khóa luận

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và người thân, những người luôn bên cạnh

và ủng hộ hết lòng, là nguồn cổ vũ tinh thần lớn lao đối với tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Phan Thị Anh Thư

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về tăng acid uric máu 2

1.1.1 Định nghĩa 2

1.1.2 Nguyên nhân gây tăng acid uric máu 2

1.1.3 Hậu quả của tăng acid uric máu 5

1.1.4 Điều trị tăng acid uric máu 6

1.2 Tổng quan về dược liệu mán đỉa 10

1.2.1 Tên gọi và phân loại 10

1.2.2 Đặc điểm thực vật 11

1.2.4 Thành phần hóa học 11

1.2.5 Tác dụng sinh học và công dụng 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Nguyên liệu, phương tiện nghiên cứu 15

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu 15

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu 16

2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat 18

2.3.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm 19

2.3.3 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm 22

2.3.4 Phương pháp xử lý số liệu 24CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25

3.1 Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat 25

3.2 Cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in vivo của cao toàn phần mán đỉa 27

3.2.1 Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm 273.2.2 Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm 29CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 34

4.1 Về ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat 34

4.2 Về cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in vivo của cao toàn phần mán đỉa

364.2.1 Về ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm 364.2.2 Về ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm 37KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ALT : Alanine aminotransferase

CMC-Na : Natri carboxymethyl cellulose

DHBV : Duck hepatitis B virus (virus viêm gan B vịt)

DL/kg : Dược liệu/kg

ED50 : Mức liều đạt 50% đáp ứng

EDTA : Ethylendiamintetraacetic acid

FDA : Food and Drug Administration

(Cơ quan quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ)

IC50 : Nồng độ ức chế 50% hoạt độ enzym

GLUT9 : Glucose transporter 9 (kênh vận chuyển glucose 9)

HGPRT : Hypoxanthin-guanin phosphoribosyl transferase

HSV-1 : Herpes simplex virus type 1 (virus herpes đơn dạng loại 1) mARN : Messenger ribonucleic acid (acid ribonucleic thông tin)

OAT : Organic anion transporter (kênh vận chuyển anion hữu cơ) OAT1 : Organic anion transporter 1 (kênh vận chuyển anion hữu cơ 1) PEG : Polyethylen glycol

PEG 400 : Polyethylen glycol 400

PRPP : Phosphoribosyl pyrophosphat

RSV : Respiratory syncytial virus (virus hô hấp hợp bào)

URAT1 : Urate transporter 1 (kênh vận chuyển urat 1)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1 1.1 Một số hợp chất có trong dược liệu mán đỉa 12

Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng

độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

26

3 3.2 Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ

xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm 28

4 3.3 Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến thể tích

5 3.4 Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến pH

Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng

độ acid uric, creatinin trong nước tiểu, huyết thanh

và hệ số thải trừ urat chuột thí nghiệm

31

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

1 1.1 Quá trình chuyển hóa purin trong cơ thể 3

3 2.1 Ảnh chụp tiêu bản cành lá mán đỉa

(Archidendron clypearia (Jack) I.C.Nielsen, Fabaceae) 15

Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

19

Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm

21

Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm

23

Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

26

9 3.2 Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ

xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm 28

10 3.3

Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric, creatinin trong nước tiểu, huyết thanh chuột thí nghiệm

32

11 3.4 Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hệ số thải trừ

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tăng acid uric máu là chứng rối loạn chuyển hóa có thể dẫn đến gút, suy thận [23], [48] và liên quan đến các bệnh như tăng huyết áp [34], bệnh mạch vành [39], hội chứng chuyển hóa [51] Tình trạng tăng acid uric máu xảy ra khá phổ biến ở nhiều nước trên thế giới Tại Mỹ, năm 2007-2008 có 21,5% dân số trên 20 tuổi (tương ứng với khoảng 43,3 triệu người) bị tăng acid uric máu, tăng 2,4% so với giai đoạn 1988-

1994 [78] Tại Nhật Bản, tỉ lệ tăng acid uric ở nam giới năm 2006 là 30% [27] Tỉ lệ người mắc bệnh gút, căn bệnh có nguyên nhân trực tiếp do tăng acid uric, cũng gia tăng trong vài thập kỷ gần đây ở nhiều quốc gia như Mỹ, Anh, New Zealand [43], [61], [78] Tại Việt Nam, theo một nghiên cứu ở bệnh viện Bạch Mai, bệnh gút đứng thứ tư về tỉ lệ mắc trong các bệnh xương khớp, chiếm 8,57% [8]

Hiện nay đã có nhiều tân dược được sử dụng để kiểm soát nồng độ acid uric cho hiệu quả điều trị tốt Tuy nhiên, các thuốc này còn nhiều hạn chế do gây các tác dụng không mong muốn nặng nề cho bệnh nhân như phản ứng dị ứng, các bệnh về tiêu hóa, gan, thận [15], [19], [23] Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm ra thuốc mới có thể khắc phục nhược điểm của các thuốc đang được sử dụng, trong đó một hướng chính là tập trung nghiên cứu các nguồn thảo dược Năm 2013, Hoàng Thị Thanh Thảo đã tiến hành sàng lọc đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase, enzym tham gia vào quá trình tạo thành acid uric trong cơ thể - đích tác dụng của nhiều thuốc làm hạ acid uric máu hiện nay, của 91 mẫu dược liệu Việt Nam Kết quả cho thấy, trong 91 mẫu nghiên cứu mán đỉa là dược liệu có tác dụng tốt nhất Cao toàn phần cũng như một số phân đoạn và chất tinh khiết phân lập được từ mán đỉa

đều thể hiện tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro tương đối mạnh [14] Tác dụng

ức chế xanthin oxidase in vitro tốt mở ra khả năng mán đỉa có thể làm hạ acid uric

Để tiếp tục đánh giá tác dụng hạ acid uric của mán đỉa trên động vật thí nghiệm nhằm góp phần đưa dược liệu này vào ứng dụng trong thực tế điều trị, đề tài “Đánh giá tác dụng hạ acid uric thực nghiệm của mán đỉa” được thực hiện với 2 mục tiêu:

1 Đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết thanh in vivo của dược liệu mán đỉa

2 Xác định cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in vivo của dược liệu mán đỉa

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về tăng acid uric máu

1.1.1 Định nghĩa

Acid uric là sản phẩm chuyển hóa cuối cùng của các hợp chất nhân purin trong

cơ thể người Đây một acid yếu với pKa là 5,75 và 10,3 Trong huyết thanh, dịch ngoại bào và dịch khớp, 98% acid uric tồn tại dưới dạng muối mononatri urat ở pH 7,4 Nồng độ urat bão hòa trong huyết thanh là 6,8 mg/dL (405 µmol/L) ở 37oC [48]

Tăng acid uric máu được xác định khi nồng độ acid uric huyết thanh cao hơn khoảng

2 lần độ lệch chuẩn so với nồng độ acid uric trung bình của người khỏe mạnh (tùy theo lứa tuổi và giới tính), thường là 7 mg/dL (416 μmol/L) ở nam và 6 mg/dL (357 μmol/L) ở nữ [23]

1.1.2 Nguyên nhân gây tăng acid uric máu

Nồng độ acid uric được giữ ở mức sinh lý bình thường do có sự cân bằng giữa quá trình hình thành và đào thải Khi có bất thường xảy ra trong cơ thể hoặc do nguyên nhân bên ngoài, một trong hai hoặc cả hai quá trình bị rối loạn, acid uric bị tăng sinh hoặc giảm thải trừ sẽ dẫn đến tăng tích lũy trong các mô và máu [23], [48], [53]

1.1.2.1 Quá trình tăng tổng hợp acid uric

Acid uric là sản phẩm thoái giáng của các hợp chất nhân purin trong cơ thể thông qua một chu trình chuyển hóa có sự tham gia của nhiều enzym và cơ chất [23] Chính vì vậy, nguyên nhân dẫn đến tăng sinh acid uric có thể bắt nguồn từ sự gia tăng các hợp chất purin đi vào quá trình chuyển hóa hoặc do rối loạn các enzym tham gia xúc tác cho các quá trình đó Quá trình chuyển hóa purin tạo được mô tả ở hình 1.1

Hình 1.1 Quá trình chuyển hóa purin trong cơ thể [23]

Sự gia tăng các hợp chất purin có thể tới từ nguyên nhân ngoại sinh (chế độ

ăn giàu purin như gan, thận, tôm, cua, lòng đỏ trứng…) hoặc nội sinh (tăng tổng hợp mới base purin do rối loạn di truyền hoặc tăng tạo ra từ quá trình thoái hóa các acid nucleic khi dùng các thuốc diệt tế bào hay mắc các bệnh mà tế bào có chu trình sống ngắn như: bệnh đa hồng cầu, đa u tủy xương, vẩy nến ) [1], [2], [23], [48]

Sự rối loạn hoạt động của các enzym gây ảnh hưởng đến quá trình hình thành acid uric có thể kể đến là sự tăng hoạt tính của phosphoribosyl pyrophosphat (PRPP) synthetase và giảm hoạt tính hypoxanthin-guanin phosphoribosyl transferase (HGPRT) PRPP synthetase bị tăng hoạt tính khiến cho nồng độ của PRPP tăng lên, HGPRT bị giảm hoạt tính làm tăng chuyển guanin và hypoxanthin thành acid uric và khiến cho PRPP tham gia nhiều hơn vào quá trình kết hợp với glutamin trong bước

đầu tiên của quá trình chuyển hóa purin thành acid uric Kết quả cuối cùng của các hoạt động bất thường này là acid uric được tạo ra nhiều hơn trong khi sự thải trừ không thay đổi, urat bắt đầu tích lũy và có thể dẫn đến một số biểu hiện trên lâm sàng [1], [23], [48]

Mặc dù nguyên nhân gây tăng sinh acid uric là từ nguồn purin hoặc các enzym như PRPP synthetase hoặc HGPRT, hiện nay để ức chế hình thành acid uric đích tác dụng mà nhiều thuốc hướng đến là enzym xanthin oxidase Xanthin oxidase có nhiều

ở gan và ruột, là enzym chủ chốt xúc tác cho những bước cuối cùng tạo acid uric [28] Việc ức chế xanthin oxidase có thể làm giảm sản xuất acid uric mà không phụ thuộc vào nguyên nhân gây tăng acid uric

1.1.2.2 Quá trình giảm thải trừ acid uric

Thận là cơ quan đóng vai trò chủ yếu trong đào thải acid uric Sự thải trừ acid uric phụ thuộc vào 4 quá trình: lọc ở cầu thận, bài tiết, tái hấp thu và bài tiết sau khi

đã tái hấp thu ở ống thận Acid uric bị ứ đọng trong cơ thể có thể do giảm mức độ lọc cầu thận, giảm bài tiết hoặc tăng tái hấp thu, trong đó, nguyên nhân liên quan đến quá trình tái hấp thu thường được nhắc tới nhiều nhất [23], [48] Các tác nhân làm tăng tái hấp thu acid uric ở ống thận gồm có: tình trạng béo phì, kháng insulin, rối loạn lipid máu hoặc sử dụng các loại thuốc như: thuốc lợi tiểu, salicylat liều thấp, acid nicotinic,…Các tác nhân này chủ yếu làm tăng tái hấp thu acid uric do tác động đến các kênh vận chuyển anion hữu cơ (Organic anion transporter - OAT) ở ống thận [34], [48], [60] Hệ vận chuyển anion hữu cơ ở ống thận và một số thuốc liên quan đến thải trừ urat được minh họa trong hình 1.2

Hình 1.2 Hệ vận chuyển urat tại tế bào ống thận [60]

Acid uric bị giảm đào thải cũng có thể do bệnh nhân mắc một số bệnh về thận như suy giảm chức năng thận, bệnh thận mạn tính [1], [48]

Ngoài các nguyên nhân chỉ làm tăng sinh hoặc giảm thải trừ acid uric còn có những yếu tố ảnh hưởng tới cả 2 quá trình trên như: rượu, sốc, chứng suy giảm glucose-6-phosphatase hoặc giảm fructose-1-phosphate aldolase [48]

1.1.3 Hậu quả của tăng acid uric máu

Tình trạng tăng acid uric máu có thể không biểu hiện triệu chứng và không cần điều trị Tuy nhiên, tăng acid uric kéo dài có thể dẫn đến bệnh gút, sỏi urat tiết niệu hay suy thận cấp [23], [48], [53]

Khi lượng acid uric trong cơ thể tăng cao (nồng độ trong huyết thanh > 7mg/dL) thì tinh thể urat bắt đầu kết lắng Các tinh thể này có thể lắng đọng ở màng hoạt dịch, thận, sụn xương, gân, các mô dưới da… gây ra biểu hiện gút tại các cơ quan đó Tại khớp, urat lắng đọng gây hiện tượng nổi hạt tophi và viêm đa khớp Nổi hạt tophi thường thấy ở xung quanh khớp, màng hoạt dịch, đầu xương, sụn vành tai… Viêm đa khớp thường biểu hiện thành tình trạng viêm cấp với các triệu chứng dữ dội

chức kẽ thận, bể thận, niệu quản có thể gây sỏi tiết niệu (có ở 20 - 30% bệnh nhân gút), lắng đọng ồ ạt ở ống thận có thể gây suy thận cấp, lắng đọng lâu dài ở nhu mô thận có thể gây suy thận mạn Suy thận thường gặp ở bệnh nhân gút có hạt tophi, tiến triển chậm và là nguyên nhân gây tử vong Tại các cơ quan khác, urat lắng đọng tại gân, túi thanh dịch có thể gây đứt gân hoặc chèn ép thần kinh, lắng đọng ngoài da và móng tay chân thành từng vùng, mảng có thể gây nhầm lẫn với bệnh ngoài da khác (vẩy nến, nấm…) [1], [2]

Ngoài bệnh gút và bệnh thận do gút, hiện tượng tăng acid uric máu cũng được nhiều nghiên cứu chứng minh là có mối liên quan đến tăng huyết áp [34], [66], nguy

cơ bệnh mạch vành ở phụ nữ [39] và hội chứng chuyển hóa (béo phì, rối loạn chuyển hóa lipoprotein máu, rối loạn chuyển hóa glucose) ở người già [51]

1.1.4 Điều trị tăng acid uric máu

1.1.4.1 Các thuốc hóa dược sử dụng trong điều trị tăng acid uric máu

Hiện nay có 3 nhóm thuốc được sử dụng để điều trị tăng acid uric với 3 cơ chế tương ứng là: ức chế xanthin oxidase, làm tăng thải trừ acid uric qua thận và làm tiêu acid uric

○ Các thuốc ức chế xanthin oxidase

Xanthin oxidase là phức hợp molybdoflavoenzyme, xúc tác cho 2 bước cuối cùng trong chu trình chuyển hóa purin là quá trình hydroxyl hóa hypoxanthine thành xanthine và xanthine thành acid uric [28] Các thuốc ức chế enzym xanthin oxidase ngăn cản sự hình thành acid uric ở giai đoạn cuối, có tác dụng trên bệnh nhân bị tăng acid uric do bất kỳ nguyên nhân nào, được lựa chọn hàng đầu hiện nay để điều trị tăng acid uric máu và gút mạn tính [40], [76] Các thuốc được sử dụng trên lâm sàng: allopurinol và febuxostat [40], [53]

▪ Allopurinol

Allopurinol ức chế enzym xanthin oxidase theo cơ chế ức chế cạnh tranh ở nồng độ thấp và không cạnh tranh ở nồng độ cao Chất chuyển hóa chính của allopurinol là oxypurinol cũng ức chế không cạnh tranh với xanthin oxidase [19] Thuốc được sử dụng chủ yếu để điều trị tăng acid uric máu và nước tiểu trong gút

nguyên phát và thứ phát, tăng acid uric máu do dùng hóa trị liệu và bệnh sỏi canxi oxalat niệu tái phát [15] Tác dụng không mong muốn nguy hiểm nhất có thể gặp phải khi dùng allopurinol là phản ứng dị ứng nghiêm trọng (hội chứng Stevens-Johnson, phản ứng trên da và toàn thân) dẫn đến tử vong [40] Các tác dụng không mong muốn khác gồm: độc tính trên gan gây tăng transaminase trong máu, tác động lên thần kinh trung ương gây chóng mặt, mất tỉnh táo, có thể làm tăng tần số bị cơn gút cấp trong 6-12 tháng đầu điều trị [15]

▪ Febuxostat

Febuxostat tạo phức hợp bền vững với cả dạng oxy hóa và dạng khử của xanthin oxidase, do đó ức chế hoạt động của enzym [19] Thuốc được FDA phê duyệt

để điều trị tăng acid uric ở bệnh nhân gút năm 2009 [53] nhưng không được sử dụng

để điều trị tăng acid uric không triệu chứng [15], [19] Tác dụng không mong muốn:

có thể làm xuất hiện cơn gút cấp khi bắt đầu điều trị, buồn nôn, đau khớp, mẩn đỏ, rối loạn chức năng gan… [15]

○ Các thuốc làm tăng thải trừ urat qua thận

Các thuốc làm tăng thải trừ urat tác động chủ yếu vào quá trình tái hấp thu acid uric thông qua ức chế các chất vận chuyển anion ở tế bào ống thận [19] Nhóm thuốc này ít được sử dụng hơn nhóm ức chế xanthin oxidase [53], bị chống chỉ định với các bệnh nhân mẫn cảm, suy giảm chức năng thận (độ thanh thải creatinin < 50 mL/phút) và bệnh nhân bị tăng tổng hợp acid uric [23] Một số thuốc trong nhóm: probenecid, sulfinpyrazon, benzbromazon [53]

▪ Benzbromazon

Benzbromazon là thuốc có tác dụng làm tăng thải trừ acid uric mạnh, có thể dùng trên bệnh nhân suy thận nhẹ và vừa [76] Hiện nay, thuốc không được sử dụng tại Mỹ [40] và được lưu hành hạn chế ở một số nước châu Âu do có một số trường hợp báo cáo thuốc gây độc tính nghiêm trọng trên gan [19], [76]

○ Các thuốc làm tiêu acid uric

Các thuốc trong nhóm này được tái tổ hợp và biến đổi từ enzym uricase ở động vật, có tác dụng kích thích chuyển acid uric thành allantoin dễ tan khiến nồng độ acid uric máu hạ xuống Thuốc đại diện cho nhóm là pegloticase, được FDA phê duyệt năm 2010 để điều trị gút mạn tính không đáp ứng với các thuốc hạ acid uric khác [53] Ngoài ra còn có rasburicase dùng để kiểm soát nồng độ acid uric ở những bệnh nhân ung thư đang điều trị bằng hóa trị liệu [15], [53]

1.1.4.2 Các dược liệu và bài thuốc từ dược liệu

○ Các dược liệu và bài thuốc được sử dụng để điều trị thống phong

Tình trạng tăng acid uric máu không có chứng bệnh tương ứng trong Đông y, tuy nhiên, bệnh gút, căn bệnh có nguyên nhân trực tiếp do tăng acid uric thì được xếp vào chứng tý, được gọi là bệnh thống phong và được điều trị bằng nhiều vị thuốc và bài thuốc khác nhau [4]

▪ Các vị thuốc điều trị thống phong

Theo lý luận y học phương Đông, để điều trị thống phong cần sử dụng các vị thuốc thuộc các nhóm như: tán hàn (can khương, quế nhục, phụ tử…), trừ thấp (độc hoạt, tang ký sinh, sa kê, ngưu tất, hy thiêm, thương truật, ý dĩ, phục linh, tỳ giải…)

và hoạt huyết, bổ huyết (đương quy, xuyên khung…) [3], [4]

▪ Các bài thuốc điều trị thống phong

Các vị thuốc trên được phối hợp thành các bài thuốc khác nhau, được sử dụng tùy theo thể bệnh thống phong: Độc hoạt tang ký sinh gia giảm và Ngũ tích tán gia giảm được dùng để trị bệnh thể hàn tý, Ý dĩ nhân thang gia giảm dùng để trị bệnh thể thấp tý, Bạch hổ quế chi thang gia vị dùng để trị bệnh thể lịch tiết phong… [3], [4]

○ Một số dược liệu và bài thuốc đã được đánh giá tác dụng và cơ chế hạ acid uric

Nhiều dược liệu và bài thuốc từ dược liệu đã được đánh giá tác dụng và xác định cơ chế hạ acid uric máu theo 2 hướng chính: ức chế xanthin oxidase và làm tăng thải trừ urat qua thận

▪ Một số dược liệu và bài thuốc có tác dụng ức chế xanthin oxidase

Các nghiên cứu trên động vật đã chứng minh nhiều dược liệu có tác dụng hạ acid uric máu thông qua ức chế xanthin oxidase Một số dược liệu có thể kể đến là:

hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) [7], cần tây (Apium graveolens L.) [13], trắc bách diệp (Biota orientalis (L.) Endl.) [77] Các dược liệu này làm hạ acid uric huyết

thanh chuột nhắt trên mô hình gây tăng acid uric cấp và làm giảm hoạt độ xanthin

oxidase gan chuột Các nghiên cứu sàng lọc in vitro cũng cho thấy nhiều dược liệu thể hiện khả năng ức chế xanthin oxidase tốt Cúc hoa (Chrysanthemum sinense Sabine.) [54], mán đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I.C.Nielsen) [14], chòi mòi

mờ (Antidesma ambigum Pax & Hoffm), [10] là một số dược liệu tiềm năng có tác dụng ức chế xanthin oxidase in vitro tương đối mạnh với IC50 < 20 µg/mL

Các bài thuốc và chế phẩm phối hợp từ nhiều dược liệu cũng được đánh giá tác dụng hạ acid uric và khả năng ức chế xanthin oxidase Một trong số các bài thuốc

và chế phẩm đó là Ermiao wan của Trung Quốc (chứa thương truật và hoàng bá) Theo nghiên cứu năm 2004 của Kong và cộng sự, Ermiao wan làm hạ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng bị gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat và thể hiện tác dụng

ức chế xanthin oxidase in vivo [42]

▪ Một số dược liệu và bài thuốc có tác dụng làm tăng thải trừ acid uric

Ngoài các dược liệu làm hạ acid uric máu theo cơ chế ức chế xanthin oxidase, nhiều dược liệu có tác dụng hạ acid uric do có khả năng làm tăng thải trừ urat qua

thận Một dược liệu mới được nghiên cứu năm 2014 về tác dụng và cơ chế hạ acid

uric là tỳ giải (Dioscorea septemloba Thunb.) Trong nghiên cứu của Su và cộng sự,

trên mô hình gây tăng acid mạn tính bằng kali oxonat đường uống ở chuột nhắt, cao chiết nước của tỳ giải làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh, làm tăng lượng acid uric đào thải qua thận 24 giờ nhưng không ức chế xanthin oxidase gan chuột khi so sánh với lô chứng bệnh [64]

Theo các nghiên cứu tại Trung Quốc, một số bài thuốc điều trị gút cổ truyền của nước này như Shuang Qi (chứa long não, tam thất) [41], Simiao (chứa thương truật, hoàng bá, ý dĩ, ngưu tất) [29], Wuling san (chứa trạch tả, bạch truật, quế nhục, phục linh) [22], Xie Zhuo Chu Bi Fang (chứa thổ phục linh, ngưu tất) [65] thể hiện tác dụng làm hạ acid uric huyết thanh chuột nhắt Cơ chế hạ acid uric của các bài thuốc trên được xác đinh là làm tăng thải trừ urat thông qua tác động lên các yếu tố

liên quan đến hệ vận chuyển ion ở ống thận

▪ Một số bài thuốc vừa ức chế xanthin oxidase vừa làm tăng thải trừ urat qua thận

Trong 2 nghiên cứu được công bố năm 2010 và 2012 tiến hành trên chuột bị gây tăng acid uric mạn bằng kali oxonat, 2 bài thuốc của Trung Quốc là Simiao gia giảm (chứa hoàng bá, ý dĩ, ngưu tất, phấn tỳ giải, tri mẫu) [32] và Sanmiao (chứa hoàng bá, thương truật, ngưu tất) [69] làm hạ acid uric máu theo cả 2 cơ chế: ức chế xanthin oxidase và làm tăng thải trừ urat qua thận trên chuột nhắt trắng Cả 2 bài thuốc đều làm giảm nồng độ acid uric huyết thanh và hoạt độ xanthin oxidase gan chuột, làm tăng nồng độ acid uric nước tiểu 24 giờ và hệ số thải trừ urat của chuột khi so sánh với lô chứng

1.2 Tổng quan về dược liệu mán đỉa

1.2.1 Tên gọi và phân loại

○ Tên gọi

Tên khoa học: Archidendron clypearia (Jack) I.C.Nielsen [72]

Tên khác: Pithecellobium clypearia (Jack) Benth, Pithecellobium angulatum Bentham, Inga clypearia Jack, Abarema angulata (Bentham) Kostermans [6], [72]

Tên thường gọi: mán đỉa, giác, khét, hông linh, lim sẹt, ràng ràng [6]

○ Phân loại

Loài mán đỉa (Archidendron clypearia (Jack) I.C.Nielsen) thuộc chi

Archidendron, họ Đậu (Fabaceae), bộ Đậu (Fabales), phân lớp Hoa hồng (Rosidae), ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) [5]

1.2.2 Đặc điểm thực vật

○ Mô tả

Cây gỗ hay cây nhỡ cao 10-15m, nhánh ngang, có cạnh Lá kép lông chim 2 lần mang 4-5 cặp cuống bậc hai, mỗi cuống bậc hai mang 3-8 đôi lá chét Lá chét hình bình hành, hình trái xoan hay hình ngọn giáo ngược, gốc hình nêm không cân đối, đầu nhọn thường có mũi, có lông mịn ở hai mặt hoặc có lông tơ ở mặt dưới

Cụm hoa là chùm tán hay chùy ở ngọn, phân nhánh 3 lần, có lông, các cuống mang tán hay ngù gồm khoảng 10 hoa có cuống 1-3 mm Đài hình chén hay hình phễu; tràng hình phễu hay hình chuông, màu vàng nhạt Nhị 10-25, ống nhị bằng ống tràng; bầu có lông mịn hoặc lông tơ Quả 20 x 1cm, dẹp, xoắn theo hình trôn ốc, vỏ quả có màu cam ở mặt ngoài, đỏ ở mặt trong, có lông mềm hay lông tơ Hạt 5-10, hình bầu dục hay hình cầu, có áo hạt mỏng, màu đen lam

1.2.4 Thành phần hóa học

Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và Việt Nam cho thấy các chất hóa học đã phân lập được từ mán đỉa thuộc các nhóm hợp chất chính là flavonoid, các polyphenol cấu tạo nên tanin, các hợp chất terpenoid đóng vai trò là sapogenin [11], [18], [37], [45], [46], [49], [71], [73] Một số hợp chất hóa học đã phân lập được từ mán đỉa được trình bày ở bảng 1.1

Bảng 1.1 Một số hợp chất có trong dược liệu mán đỉa

Flavonoid

7,4′-di-O-galloyltricetiflavan [37], [46] (−)-5,7,3′,4′,5′-pentahydroxyflavan

[18] (−)-epigallocatechin-7-gallat

(+)-3,5,3',4',5'-pentahydroxyflavan-7-gallat

[37] (−)-5,3',4',5'-tetrahydroxyflavan-7-gallat

(2R,3R)-7-O-galloylplumbocatechin 5-hydroxy-3,7,3',4'-tetramethoxyflavon

[71] 5,4'-dihydroxy-3,7,3'-trimethoxyflavon

Luteolin (5,7,3',4'-tetrahydroxyflavon) Fisetin (3,7,3′,4′-tetrahydroxyflavon)

[49] Robinetin (3,7,3',4',5'-pentahydroxyflavon)

Quercetin (3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavon) [45], [73] Luteolin-7-O-β-D-glucopyranosid [71] Myricetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid [18] Quercetin-3-O-α-L-rhamnopyranosid [11], [18]

1.2.5 Tác dụng sinh học và công dụng

○ Sử dụng mán đỉa theo kinh nghiệm dân gian

Tại Việt Nam lá mán đỉa được dùng để nhuộm đen và nấu nước tắm trị ghẻ

Ở Ấn Độ, lá dùng làm bột trị ho, đau chân, phù, thủy đậu và đậu mùa, ở Lào dùng để trị vết thương [5], ở miền Bắc Thái Lan, mán đỉa trị sốt, đau răng, đau mắt [16], [56]

○ Các tác dụng sinh học

▪ Tác dụng chống viêm và chống dị ứng

Dịch chiết ethanol của mán đỉa và các chất phân lập thể hiện tác dụng chống viêm và chống dị ứng rõ rệt trên mô hình gây phù ở tai và chân chuột nhắt trong một nghiên cứu ở Trung Quốc năm 2009 [18] Nghiên cứu của Yang và cộng sự năm 2012

và 2013 cũng cho thấy dịch chiết methanol của mán đỉa có tác dụng chống viêm tốt trên mô hình gây viêm ruột kết bằng dextran natri sulfat và gây viêm dạ dày bằng ethanol/HCl ở chuột nhắt Cơ chế chống viêm của mán đỉa được chứng minh là có liên quan đến các yếu tố tham gia vào quá trình dịch mã tạo ra các enzym và chất trung gian hóa học trong phản ứng viêm [73], [74]

▪ Tác dụng kháng virus

Các nghiên cứu tại Trung Quốc cho thấy dịch chiết mán đỉa trong các dung môi khác nhau và một số hợp chất flavonoid phân lập được từ dịch chiết có tác dụng kháng virus cúm H1N1 [37], [46], virus đường hô hấp (RSV), virus herpes (HSV-1)

ở người [46] và virus viêm gan B ở vịt (DHBV) [44]

▪ Tác dụng bảo vệ gan

Mán đỉa có tác dụng làm giảm nồng độ ALT trong máu chuột trên mô hình

gây viêm gan bằng lipopolysaccharid của Propionibacterium acnes và paracetamol

theo 2 nghiên cứu năm 2009 và 2013 [11], [18]

▪ Tác dụng chống oxy hóa

Nguyễn Thị Hoài và cộng sự đã sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa in vitro của

một số cây thuốc của đồng bào Pako - Vân Kiều ở Quảng Trị và nhận thấy mán đỉa

có hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất với ED50 của cao toàn phần là 2,18 µg/mL [9] Nguyễn Khánh Thùy Linh tiếp tục nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa của các phân

đoạn mán đỉa và thu được kết quả phân đoạn ethyl acetat có tác dụng chống oxy hóa mạnh nhất với ED50 là 0,63 µg/mL [11]

▪ Tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro

Năm 2013, kết quả sàng lọc tác dụng ức chế xanthine oxidase in vitro của

Hoàng Thị Thanh Thảo cho thấy mán đỉa là dược liệu có tác dụng tốt nhất trong 91 mẫu dược liệu được nghiên cứu với IC50 của cao toàn phần là 15,6 µg/mL Phân đoạn

có khả năng ức chế xanthin oxidase in vitro mạnh nhất là phân đoạn ethyl acetat với

IC50 là 4,4 µg/mL Chất tinh khiết ACE8 phân lập được từ cao ethyl acetat có tác dụng ức chế enzym mạnh nhất đã được xác định cơ chế là ức chế không cạnh tranh [14]

Từ kinh nghiệm dân gian và các nghiên cứu khoa học, có thể thấy mán đỉa là dược liệu có nhiều ứng dụng để làm thuốc chữa bệnh Đặc biệt tác dụng chống viêm,

chống oxy hóa và khả năng ức chế xanthine oxidase in vitro tốt cho thấy dược liệu

này có nhiều tiềm năng trong điều trị tăng acid uric máu và bệnh gút

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu, phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Nguyên liệu nghiên cứu

2.1.1.1 Dược liệu nghiên cứu

Dược liệu nghiên cứu là cành lá của cây mán đỉa (Archidendron clypearia

(Jack) I.C.Nielsen) được thu hái tại Mê Linh, Hà Nội tháng 1 năm 2014

Mẫu dược liệu được TS Trần Thế Bách, phòng Thực vật, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam xác định tên khoa học

Mẫu tiêu bản cây được lưu giữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

Hình 2.1 Ảnh chụp tiêu bản cành lá mán đỉa

(Archidendron clypearia (Jack) I.C.Nielsen, Fabaceae)

2.1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu

Sau khi thu hái, dược liệu được làm sạch, sấy khô, xay thô Bột dược liệu được ngâm với dung môi methanol trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng Lặp lại 3 lần

Dịch chiết 3 lần được đem cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm và cô cách thủy đến cao đặc Sau khi điều chế, cao dược liệu được bảo quản ở nhiệt độ 0 - 4oC

Hàm ẩm dược liệu là 4,94% Hiệu suất chiết cao là 37,26%

2.1.2 Phương tiện nghiên cứu

2.1.2.1 Động vật thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, cân nặng từ 18-22g, khỏe mạnh do

Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp

Động vật được nuôi ổn định với điều kiện phòng thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện nghiên cứu, được nuôi dưỡng bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện

Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự do

2.1.2.2 Hóa chất, thuốc thử

- Allopurinol (Sigma Aldrich)

- Bộ hóa chất định lượng acid uric gồm hóa chất phản ứng và acid uric chuẩn (BioSystems)

- Bộ hóa chất định lượng creatinin gồm hóa chất phản ứng và creatinin chuẩn (Liquick Cor)

- Các dung môi, hóa chất pha hệ đệm dùng cho phản ứng enzym đạt tiêu chuẩn phân tích

- Dung môi dùng cho chiết xuất: methanol đạt tiêu chuẩn công nghiệp

- Kali oxonat 97%, dùng cho nghiên cứu và phát triển (Sigma Aldrich)

2.1.2.3 Thiết bị, dụng cụ

- Cân kĩ thuật Presica-BJ610C, TE412 (Sartorius)

- Cân phân tích AY 220 (Shimadzu)

- Đĩa UV 96 giếng đáy phẳng Costar 3635 (Corning)

- Hệ thống ELISA gồm máy đọc khay vi tinh thể (Biotek, Hoa Kì) và máy ủ lắc khay (Awareness, Hoa Kì)

- Lồng hứng nước tiểu

- Máy cất nước 2 lần (Halminton, Hoa Kì)

- Máy cất quay Buchi Rotavapor R210

- Máy đo pH (Eutech)

- Máy ly tâm EBA 20 (Hettich Zentrifugen, Đức)

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5702R và Centrifuge 5415R (Eppendorf)

- Máy siêu âm Power sonic 405

- Máy sinh hóa TC-3300 Plus (Teco Diagnostics USA)

- Nồi cách thủy SSY-H, GFL (Memmert)

- Thiết bị nghiền đồng thể WiseStir HS-30E (Daihan)

- Tủ ấm điều nhiệt (Memmert)

- Các dụng cụ sử dụng để pha thuốc, lấy mẫu và xét nghiệm: micropipet và đầu côn tương ứng, ống microtube, dụng cụ thủy tinh, chày, cối sứ, mao quản, bơm kim tiêm, ống nghiệm các loại

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài được thiết kế với các nội dung tiến hành như sau:

- Thực hiện mục tiêu 1: Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa với các mức liều khác nhau đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat

- Thực hiện mục tiêu 2: Xác định sơ bộ cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in vivo của cao toàn phần mán đỉa trên thực nghiệm thông qua:

+ Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm

+ Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm

Hình 2.2 Thiết kế nghiên cứu 2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat

Áp dụng mô hình gây tăng acid uric cấp bằng tiêm màng bụng kali oxonat trên chuột nhắt trắng [7], [42]

○ Thiết kế thí nghiệm

Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành các lô:

- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc

- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol

- Các lô thử: uống cao toàn phần mán đỉa các mức liều

Chuột được uống dung môi pha thuốc, thuốc đối chiếu allopurinol hoặc các chế phẩm thử với cùng thể tích 0,1 mL/10 g vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thí nghiệm Trước khi uống dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường Ngày thứ 5, chuột ở các

lô được tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonat pha trong CMC-Na 0,5% với liều 500 mg/kg 1 giờ trước khi uống thuốc lần cuối Sau khi uống thuốc 2 giờ, lấy máu từ xoang hốc mắt của chuột Máu được để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ sau đó đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết thanh Trong

Cao toàn phần mán đỉa

Đánh giá ảnh hưởng đến nồng

độ acid uric huyết thanh

Xác định cơ chế làm hạ acid uric

huyết thanh

Ảnh hưởng đến hoạt độ

xanthin oxidase gan chuột

Ảnh hưởng đến sự thải trừ urat

qua thận

thời gian chờ để định lượng acid uric, huyết thanh được bảo quản ở -20oC Nồng độ acid uric được xác định thông qua việc đo mật độ quang của sản phẩm phản ứng giữa acid uric và hóa chất thử ở bước sóng 520nm

Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.3

Hình 2.3 Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến

nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat

○ Thông số đánh giá

- Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm

- Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng:

I (%) = Cc-Ct

Cc x 100 Trong đó:

Cc, Ct: nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử

I (%): tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng

2.3.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm

Áp dụng mô hình đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzym gan chuột thí nghiệm

kali oxonat

- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc

- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol

- Lô thử: uống cao toàn phần mán đỉa

Chuột được uống dung môi pha thuốc, thuốc đối chiếu allopurinol hoặc các chế phẩm thử với cùng thể tích 0,1 mL/10 g vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thí nghiệm Trước khi uống dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường

○ Phương pháp chiết enzym

Kết thúc thực nghiệm, giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ, lấy ngay gan từng chuột Cân ngay 1 g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiền đồng thể

đã để lạnh và có sẵn 1 mL dung dịch đệm phosphat lạnh (pH = 7,5) Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm dần đệm lạnh để thu được dịch đồng thể với tỷ lệ khối lượng gan : thể tích đệm tương ứng là 1:10 Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Lấy phần dịch nổi tiếp đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 10000 vòng/phút trong 60 phút Sau khi ly tâm, phần dịch trong được dùng để xác định hoạt độ enzym

○ Phản ứng enzym

Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm chứa 2,90 mL đệm phosphat (0,05M, pH 7,5), 2,50 mL dung dịch đệm cơ chất gồm xanthin 0,12 mM, EDTA 0,192

mM, kali oxonat 2,2 mM Trước khi tiến hành phản ứng, dịch enzym và cơ chất được

ủ ở 37oC trong 15 phút Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,1 mL dịch enzym vào ống nghiệm chứa dung dịch cơ chất Tiếp tục ủ trong 30 phút Hút 200 μL dịch sau phản ứng ra đĩa UV 96 giếng để tiến hành đo quang ở bước sóng 290 nm

Song song tiến hành với mẫu trắng: thay 2,5 mL dung dịch cơ chất trong ống nghiệm bằng 2,5 mL đệm phosphat pH 7,5 Các bước thí nghiệm khác làm tương tự như ở ống nghiệm có phản ứng

Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.4

Hình 2.4 Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến

hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm

○ Thông số đánh giá

- Đơn vị hoạt độ (U) của enzym được tính bằng lượng acid uric sinh ra trong

1 phút trên 1 g protein ở điều kiện 37oC, pH 7,5 Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry [50]

+ Công thức tính hoạt độ tổng số cho 1 g gan:

U1 = (ODthử - ODtrắng) x V x 10

12,2 x Ve x 0,6 x T [12]

+ Công thức tính hoạt độ riêng: U/g protein = U1

KTrong đó:

ODthử : mật độ quang của mẫu thử

ODtrắng: mật độ quang của mẫu trắng tương ứng với mẫu thử

12,2 : hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290nm

• Lấy gan động vật, nghiền thành dịch đồng thể

• Ly tâm dịch đồng thể lấy dịch chiết để làm phản ứng enzym