Đánh giá tác dụng hạ acid uric máu trên thực nghiệm của phân đoạn n butanol cây hy thiêm (siegesbeckia orientalis l , asteraceae)

B ộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC • • B ộ V TẾ Dược HÀ NỘI • • KHỔNG THỊ HOA ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG HẠ ACID URIC MÁU TRÊN THựC CỦA PHÂN ĐOẠN • NGHIỆM • • N-BUTANOL CÂY HY THIÊM (Síegesbeckia orientalỉs L., Asteraceaẹ) Chuyên ngành: Dược lý - Dược lâm sàng Mã số: 60.73.05 LUẬN • VĂN THẠC • SỸ Dược • HỌC • Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Vũ Thị Ngọc Thanh ThS nguyễn thùy dư ơng 'r^’!j'ỞNG ỉ>fi ĩu jỤ f HÀ N Ộ I-N Ă M 2011 LỜI CẢM ƠN Hai năm học cao học tiến hành đề tài tốt nghiệp hoàn thiện luận văn tốt nghiệp trôi qua Đe cỏ kết mong đợi ngày hơm với tất lòng ỉdnh trọng biết ơn chân thành nhất, xin gửi ỉời cảm cm tới tồn thể thầy, giảo Trường Đại học Dược Hà Nội giảng dạy, đào tạo giúp đỡ tơi hồn thành tốt khố học Đặc biệt xỉn chân thành cảm ơn PGS TS Vũ Thị Ngọc Thanh, ThS Nguyễn Thuỳ D ương toàn thể thầy cô giảo môn Dược Lực Trường Đại học Dược Hà Nội tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên đóng góp ỷ kiến quỷ báu để tơi thực hồn thành tốt đề tài tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đmh, bạn bè, người bên cạnh động viên, giúp đỡ, tạo điầi kiện mặt giúp tơi ừongsuổt ừình học tập Tơi xin chăn thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 11 năm 2011 Khẳng Thị Hoa MỤC LỤC ĐẶT VẤN Đ È CHƯƠNG 1: TỒNG QUAN 1.1 Tăng acid uric máu bệnh gút 1.1.1 Acid uric máu tăng acid uric m áu 1.1.1.1 Acid uric m áu 1.1.1.2 Tăng acid uric m áu 1.1.2 Bệnh gút 1.1.2.1 Cơ chế bệnh sinh 1.1.2.2 Triệu chứng lâm sàng bệnh gút 1.1.2.3 Các thuốc điều trị bệnh gút 1.2 Cây hy thiêm {Sìegesbeckia oríentalis L., Asteraceae) 15 1.2.1 Đặc điểm thực vật, phận dùng 15 1.2.2 Thành phần hóa học 16 1.2.3 Công dụng tác dụng 18 1.2.3.1 Công dụng 18 1.2.3.2 Tác dụng 18 CHƯƠNG ; ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 Đối tượng nghiền cứu 20 2.1.1 Dược liệu 20 2.1.3 Động vật thực n ghiệm 21 2.2 Nguyên vật liệu thiết bị nghiên cứu 21 2.3 Phương pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Phương pháp chiết xuất phân đoạn n-buthanol hy thiêm .24 2.3.2 Phương pháp triển khai mơ hình gây tăng acid uric máu mạn tính acid oxonic 26 2.3.3 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng phân đoạn n-butanol hy thiêm đến nồng độ acid uric huyết mơ hình gây tăng acid uric máu 27 2.3.4 Phương pháp đánh giá tác dụng phân đoạn n-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase .28 2.3.4.1 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng phân đoạn n-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase in vitro 28 2.3.4.2 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng phân đoạn n-butanol hy thiêm đến hoạt độ xanthin oxidase gan ch u ộ t 29 2.3.5 Phương pháp đánh giá tác dụng lên thải trừ acid uric qua thận phân đoạn n-butanol hy th iê m 31 2.3.6 Phương pháp xử lý số liệu 33 CHƯƠNG 3: KÉT QUẢ T H ựC NGHIỆM 34 3.1 Chiết xuất phân đoạn n-butanol hy thiêm 34 3.2 Triển khai mơ hình gây tăng acid uric máu mạn tính chuột thực nghiệm acid oxonic 35 3.2.1 Sự thay đổi nồng độ acid uric huyết số thơng số sinh hố khác mơ hình gây tăng acid uric mạn tính acid oxonic 35 3.2.2 Ảnh hưởng mơ hình gây tăng acid uric máu mạn tính đến mơ bệnh học thận chuột 36 3.3 Tác dụng hạ acid uric máu phân đoạn n-butanol hy thiêm chuột gây tăng acid uric máu mạn tính 39 3.3.1 Ảnh hưỏng phân đoạn n-butanol hy thiêm đến nồng độ acid uric huyết th a n h 39 3.3.2 Anh hưởng phân đoạn n-butanol hy thiêm đến mô bệnh học thận 40 3.4 Ánh hưởng phân đoạn n-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase 41 3.4.1 Ảnh hưởng phân đoạn n-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase in vitro 41 3.4.2 Ảnh hưởng phân đoạn n-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thực nghiệm 3.5 Tác dụng lên thải trừ acỉd uric qua thận phân đoạn n-butanol hy th iêm 45 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 49 4.1 v ề lựa chọn phân đoạn n-butanol hy thiêm liều dùng phân đoạn nghiên c ứ u 49 4.2 v ề mơ hình gây tăng acid uric máu mạn tính add oxonic 50 4.3 v ề tác dụng phân đoạn n-butanol hy thiêm đến nồng độ acid uric máu chuột gây tăng acid uric máu mạn tính acid o x o n ic 54 4.4 v ề chế hạ acid uric máu phân đoạn n-butanol hy thiêm 56 4.4.1 Khả ức chế xanứiin oxidase phân đoạn n-butanol hy thiêm 56 4.4.2 Tác dụng phân đoạn n-butanol hy thiêm lên thải trừ acid uric qua thận 59 KẾT LUẬN 61 KIÉN N G H Ị 62 DANH MỤC CHỮ VIÉT TẤT ALT Alanin aminotransferase AST Aspartat aminotransferase AMP Adenosin monophosphat BMI Body mass index (chỉ số khối thể) EDTA Ethylen diamintetraacetic acid GMP Guanosin monophosphat HE Hematoxylin- Eosin Ig Immunoglobulin IC 50 Inhibitory concentration 50% (nồng độ ức chế 50%) IMP Inosin monophosphat NaCMC Natri carboxymethylcellulose NSAIDs Non Steroidal Anti-inflammatory Drugs (thuốc chống viêm không steroid) PG Prostaglandin XMP Xanthosin monophosphat XO Xanthin oxidase DANH MỤC CÁC BẢNG • Bảng 3.1 Các thơng số sinh hoá máu 35 Bảng 3.2 Tỷ lệ khối lượng thận khối lưọng thể chuột 36 Bảng 3.3 Ảnh hưởng phân đoạn «-butanol hy thiêm đến nồng độ acid uric huyết chuột gây tăng acid uric 39 Bảng 3.4 Ảnh hưởng phân đoạn w-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase invitro 42 Bảng 3.5 Nồng độ ức chế 50 % (IC 50) hoạt độ xanthin oxidase phân đoạn n-butanol hy thiêm 43 Bảng 3.6 Ảnh hưởng phân đoạn n-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase (XO) invivo 44 Bảng 3.7 Ảnh hưởng phân đoạn ^-butanol hy thiêm lên thể tích nước tiểu chuột cống trắng 45 Bảng 3.8 Ảnh hưởng phân đoạn /1-butanol hy thiêm lên pH nước tiểu chuột cống trắng 46 Bảng 3.9 Ảnh hưởng phân đoạn ^-butanol hy thiêm lên hệ số thải trừ urat chuột cống trắng 48 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức hố học acid uric Hình 1.2 Quá trình chuyển hoá tạo thành acid uric thể Hình 1.3 Hình ảnh ngón chân to bệnh gút Hình 1.4 Các chất phân lập từ hy thiêm 16 Hình 1.5 Các ent-pimarane diterpenoid phân lập từ hy thiêm 17 Hình 1.6 Cơng thức hố học rutin 17 Hình 2.1 Ảnh chụp hy thiêm {Sỉegesbeckia orỉentalỉs L., Asteraceae) Hồ Bình .20 Hình 2.2 Sơ đồ nghiên cứu 23 Hình 2.3 Sơ đồ chiết xuất phân đoạn w-butanol hy thiêm 25 Hình 2.4 Lồng hứng nước tiểu chuột cống 32 Hình 3.1 Kết chiết xuất phân đoạn «-butanol hy thiêm 34 Hình 3.2 Hình ảnh đại diện vi thể thận chuột lô chứng trắng 37 Hình 3.3 Hình ảnh đại diện vi thể thận chuột lô gây tăng acid uric 38 Hình 3.4 ỉỉình ảnh đại diện vi thể ứiận chuột lô uống phân đoạn n-butanol hy thiêm mơ hình gây tăng acid uric máu mạn 40 Hình 3.5 Nồng độ acid uric, creatinin huyết nước tiểu chuột .47 Hình 4.1 Vai trò gây tăng acid uric acid oxonic 51 ĐẶT VẤN ĐÈ Ngày theo xu hướng phát triển kinh tế ứiay đổi lối sống, sinh hoạt, bệnh coi bệnh kinh tế phát ừiển gia tăng nhanh ữong năm vừa qua ừên ứiế giới Việt Nam, lứa tuổi mắc bệnh cữig bị ữẻ hố, bao gồm: tim mạch, tiểu đường, xương khóp, béo phì, ung ứiư bệnh gút Bệnh gút ngưòd Ai Cập mô tả từ 2600 năm trước công nguyên vói dấu hiệu ngón chân to Thế kỷ 17, bác sỹ người Anh, Alfred Garrod khẳng đinh urat nguyên nhân gây viêm khóp bệnh gút người bình thường, nồng độ acid uric frong huyết tìr - mg/dL Nếu nồng độ acid uric vượt ngưỡng gây đợt gút cấp tạo thành hạt tophi ổ khóp [37] Trên giới có nhiều loại thuốc sử dụng để điều trị bệnh gút đem lại hiệu tốt Các thuốc tân dược sử dụng có tác dụng nhanh, mạnh, hiệu như: colchicin, thuốc chống viêm lchông steroid, glucocorticoid (giải triệu chứng đau, sưng, viêm), allopurinol, probenecid (làm giảm nồng độ acid uric máu) dùng thuốc kéo dài thường gây nhiều tác dụng không mong muốn giá thành điều trị cao Vì vậy, tìm kiếm đưa vào sử dụng thuốc điều trị gút có nguồn gốc từ thảo dược để hạn chế nhược điểm thuốc tân dược, tận dụng nguồn thảo dược quý thiên nhiên ban tặng xu hướng cần quan tâm M ột số thuốc phương thuốc cổ truyền, dân gian điều trị bệnh xương khớp nói chung bệnh gút nói riêng nghiên cứu, đưa vào sử dụng điều trị có hiệu Tại Việt Nam, hy thiêm sử dụng nhiều thuốc chữa bệnh xương khớp gút, đến chưa có nghiên cứu đánh giá tác dụng bệnh gút hy thiêm Năm 2009- 2011, có số nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ acid uric huyết chuột thực nghiệm phân đoạn dịch chiết hy thiêm mơ hình gây tăng acid uric máu cấp tính [7],[11],[13], sở bước đầu cho thấy tiềm điều trị bệnh gút hy thiêm Theo kết nghiên cứu này, phân đoạn chiết xuất từ hy thiêm, phân đoạn «-butanol có tác dụng hạ acid uric máu tốt [7],[11] Vì vậy, nhằm làm sáng tỏ chứng minh sở khoa học khả gây hạ acid uric máu hy thiêm, chọn phân đoạn để tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng hạ acid uric máu mơ hình gây tăng acid uric máu mạn tính cho phù hợp với chế bệnh sinh gút Do đó, đề tài: ''Đ ánh g iá tác dụng hạ acid uric máu thực nghiệm phân đoạn n-butanol Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L., A ste c e a ẹ )” tiến hành với hai mục tiêu sau: / Đảnh giá tác dụng hạ acid uric máu phân đoạn n-butanol Hy thiêm ừên mơ hình thực nghiệm gây tăng a d d uric máu mạn tính S xác định chế hạ acid uric máu phân đoạn n-butanol cày Hy thiêm Để đạt hai mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài cần thực nội dung cụ thể sau: - Chiết xuất phân đoạn «-butanol hy thiêm - Triển khai mơ hình gây tăng acid uric máu mạn tính chuột cống trắng - Đánh giá tác dụng hạ acid uric máu phân đoạn «-butanol hy thiêm mơ hình gây tăng acid uric máu mạn tính acid oxonic - Sơ xác định chế hạ acid uric máu dịch chiết phân đoạn «-butanol hy thiêm: + Ảnh hưởng đến hoạt độ enzym xanthin oxidase + Ảnh hưởng đến thải trừ acid uric qua thận nói riêng mở Trong thuốc có nguồn gốc hố dược, bên cạnh tác dụng dược lý, có nhiều tác dụng không mong muốn nguy hại kèm gây ảnh hưởng đến sức khoẻ người Thuốc, chế phẩm có nguồn gốc từ dược liệu, phát huy tác dụng chậm, tác dụng khơng thuốc hố dược, có tác dụng khơng mong muốn sử dụng lâu dài, phù họp với bệnh mạn tính, có bệnh gút Tại phân đoạn «-butanol hy thiêm lại có tác dụng hạ acid uric máu? Phải phân đoạn có chứa chất có tác dụng gây hạ acid uric máu? Các nhà khoa học giới phân lập từ hy thiêm số chất như: orientin, kirenol, orientalide, 3,7- dimethyl quercetin, entpimarane diterpenoid [10],[15],[23],[37],[48] đặc biệt Việt Nam, Phan Tống Sơn cộng chứng minh phân đoạn «-butanol hy thiêm có chứa 2,65 % rutin [12], Quercetin rutin với liều 50, 100, 150 mg/kg Zhu JX cộng chứng minh có tác dụng hạ acid uric thơng qua chế ức chế hoạt độ enzym xanthin oxidase in vitro [49] Enzym xanthin oxidase đóng vai trò quan trọng việc thoái giáng hypoxanthin, xanthin tạo thành acid uric máu Khi enzym bị ức chế, hypoxanthin xanthin không phân huỷ tạo thành acid uric, dẫn đến làm giảm nồng độ acid uric máu Do đó, quercetin rutin yếu tố liên quan đến tác dụng hạ acid uric phân đoạn «-butanol hy thiêm Bên cạnh việc đánh giá tác dụng hạ acid uric máu phân đoạn nbutanol hy thiêm, quan sát thay đổi mô bệnh học thận chuột (vì mơ hình gây tăng acid uric máu mạn tính, acid uric tăng cao kéo dài gây tổn thưoTig thận) Kết cho thấy, tiêu vi thể thận chuột lơ uống phân đoạn «-butanol hy thiêm xuất sung huyết mơ kẽ nhẹ, tồn tiêu lô chứng bệnh xuất sung huyết mô kẽ Như vậy, nồng độ acid uric máu tăng cao, liên tục 55 tuần gây tượng xung huyết mô kẽ lô chứng bệnh Hiện tượng xung huyết mô kẽ giảm lơ dùng phân đoạn «-butanol hy thiêm với liều 120 mg/kg/ngày Giả thiết bước đầu, phải phân đoạn có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric máu dẫn đến làm giảm nguy sung huyết mô kẽ làm giảm nguy tổn thương thận chuột thực nghiệm? 4.4 VÊ C CHẾ HẠ ACID URIC MÁU CỦA PHÂN ĐOẠN iV-BUTANOL HY THIÊM Các thuốc làm hạ acid uric máu thị trường thưòmg tác dụng theo hai chế sau: chế ức chế hoạt độ xanthin oxidase chế tăng thải trừ acid uric qua thận Vì vậy, nghiên cứu chế hạ acid uric phân đoạn «-butanol hy thiêm, đề tài tiến hành nghiên cứu đánh giá tác dụng phân đoạn «-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase ảnh hưởng lên thải trừ acid uric qua thận 4.4.1 Khả ức chế xanthỉn oxidase phân đoạn fỉ-butanol hy thiêm Tăng acid uric máu yếu tố nguy quan trọng bệnh gút Quá trình tạo thành acid uric thể cần có vai trò xanthin oxidase Vì vậy, thuốc có khả ức chế enzym này, làm giảm nồng độ acid uric máu thường dùng điều trị gút Cơ ché gây hạ acid uric dược liệu hy thiêm Nguyễn Thị Quỳnh Hoa nghiên cứu sàng lọc ảnh hưỏng phân đoạn dịch chiết hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase ỉn vitro Ket cho thấy, phân đoạn dịch chiết hy thiêm, có phân đoạn «-butanol với nồng độ cắn hỗn hợp phản ứng mg/ml có tác dụng ức chế xanthin oxidase, phần trăm ức chế so với chứng 22,8 %, khác biệt có ý nghĩa thống kê [9] Tuy nhiên, mói bước đầu, mang tính chất sàng lọc Do đó, đề tài tiến hành thử 56 nghiệm ỉn viữo để đánh giá tiềm lực ức chế xanthin oxidase để từ đánh giá ảnh hưỏng phân đoạn «-butanol lên hoạt độ xanthin oxidase in vivo Thử nghiệm in vitro đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase phân đoạn «-butanol với nồng độ khác (2, 5, 10, 20, 50, 70 I^g/ml) Kết nồng độ thể tác dụng ức chế hoạt độ xanthin oxidase Dựa kết đó, sử dụng phân tích thống kê probit phần mềm SPSS 16.0 xác định nồng độ phân đoạn n-butanol hy thiêm ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase 69,89 |j,g/ml Đồng thời để có sở so sánh, đề tài song song đánh giá tác dụng ức chế xanthin oxidase hai chất đối chiếu allopurinol (một chất kinh điển sử dụng điều trị gút với chế biết ức chế xanthin oxidase) quercetin (một flavonoid chiết xuất tinh khiết từ dược liệu, chứng minh có tác dụng ức chế xanthin oxidase) Allopurinol ức chế hoạt độ xanthin oxidase tốt nồng độ allopurinol ức chế 50% hoạt độ xanthin oxidase khoảng 0,12 |ig/ml Quercetin ức chế hoạt độ xanthin oxidase, nồng độ quercetin ức chế 50% hoạt độ enzym khoảng 10,08|ig/ml Cả allopurinol quercetin ức chế xanthin oxidase mạnh phân đoạn «-butanol hy thiêm Một mẫu cao dược liệu coi có hoạt lực ức chế xanthin oxidase IC 50 < 0 |ig/ml [33] Đây lý phân đoạn «-butanol hy thiêm sử dụng nồng độ nêu thử nghiệm để đánh giá tác dụng ức chế hoạt độ xanthin oxidase in vitro Kết phân đoạn «-butanol hy thiêm có IC 50 = 69,89 |ig/ml, có nghĩa phân đoạn có hoạt lực ức chế xanthin oxidase Trên thực tế chất có tác dụng in vitro chưa có biểu tác dụng in vivo Vì vậy, đề tài tiến hành đánh giá tác dụng phân đoạn «-butanol hy thiêm lên hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thực nghiệm với liều 120mg/kg/ngày Thử nghiệm nhằm đánh giá phân đoạn «-butanol hy thiêm thực có tác dụng ức chế xanthin oxidase thể sống hay 57 không? Kết cho thấy, phân đoạn «-butanol hy thiêm với liều 120 mg/kg/ngày tác dụng ức chế xanthin oxidase gan chuột tốt, tỷ lệ ức chế 32,69 % so với lơ chứng, khác biệt có ý nghĩa thống kê (p