enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
Áp dụng mô hình đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzym gan chuột thí nghiệm [7], [13], [42], [77].
○ Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành các lô:
Nhịn ăn Uống thuốc Lấy máu
Uống thuốc hàng ngày
4 ngày Ngày thứ 5
30 phút 60 phút 120 phút
Để lắng và ly tâm máu lấy
huyết thanh Tiêm
- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol. - Lô thử: uống cao toàn phần mán đỉa.
Chuột được uống dung môi pha thuốc, thuốc đối chiếu allopurinol hoặc các chế phẩm thử với cùng thể tích 0,1 mL/10 g vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thí nghiệm. Trước khi uống dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường.
○ Phương pháp chiết enzym
Kết thúc thực nghiệm, giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ, lấy ngay gan từng chuột. Cân ngay 1 g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiền đồng thể đã để lạnh và có sẵn 1 mL dung dịch đệm phosphat lạnh (pH = 7,5). Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm dần đệm lạnh để thu được dịch đồng thể với tỷ lệ khối lượng gan : thể tích đệm tương ứng là 1:10. Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch nổi tiếp đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 10000 vòng/phút trong 60 phút. Sau khi ly tâm, phần dịch trong được dùng để xác định hoạt độ enzym.
○ Phản ứng enzym
Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm chứa 2,90 mL đệm phosphat (0,05M, pH 7,5), 2,50 mL dung dịch đệm cơ chất gồm xanthin 0,12 mM, EDTA 0,192 mM, kali oxonat 2,2 mM. Trước khi tiến hành phản ứng, dịch enzym và cơ chất được ủ ở 37oC trong 15 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,1 mL dịch enzym vào ống nghiệm chứa dung dịch cơ chất. Tiếp tục ủ trong 30 phút. Hút 200 μL dịch sau phản ứng ra đĩa UV 96 giếng để tiến hành đo quang ở bước sóng 290 nm.
Song song tiến hành với mẫu trắng: thay 2,5 mL dung dịch cơ chất trong ống nghiệm bằng 2,5 mL đệm phosphat pH 7,5. Các bước thí nghiệm khác làm tương tự như ở ống nghiệm có phản ứng.
Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến
hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
○ Thông số đánh giá
- Đơn vị hoạt độ (U) của enzym được tính bằng lượng acid uric sinh ra trong 1 phút trên 1 g protein ở điều kiện 37oC, pH 7,5. Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry [50].
+ Công thức tính hoạt độ tổng số cho 1 g gan: U1 = (ODthử - ODtrắng) x V x 10
12,2 x Ve x 0,6 x T [12] + Công thức tính hoạt độ riêng: U/g protein = U1
K Trong đó:
ODthử : mật độ quang của mẫu thử.
ODtrắng: mật độ quang của mẫu trắng tương ứng với mẫu thử.
12,2 : hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290nm (mM-1.cm-1).
10 : hệ số pha loãng. Uống thuốc
• Chuột được cho uống thuốc hàng ngày trong 5 ngày.
Chiết enzym gan
• Lấy gan động vật, nghiền thành dịch đồng thể.
• Ly tâm dịch đồng thể lấy dịch chiết để làm phản ứng enzym.
Tiến hành phản ứng
enzym
• Ủ dịch enzym và dung dịch cơ chất trong 15 phút ở 37oC. • Thực hiện phản ứng trong 30 phút ở 37oC.
0,6 : độ dày cuvet (cm). V : thể tích phản ứng (mL). Ve : thể tích enzym cho vào (mL). T : thời gian phản ứng (phút). K : số g protein/1 g gan.
- Tỷ lệ giảm hoạt độ enzym của lô thử so với lô chứng: I (%) = (1 – B/A) x 100 Trong đó:
A, B: hoạt độ riêng của enzym gan chuột lô chứng và lô thử. I (%): Tỷ lệ giảm hoạt độ enzym của lô thử so với lô chứng.