Để đạt được các mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài được thiết kế với các nội dung tiến hành như sau:
- Thực hiện mục tiêu 1: Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa với các mức liều khác nhau đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat.
- Thực hiện mục tiêu 2: Xác định sơ bộ cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in vivo của cao toàn phần mán đỉa trên thực nghiệm thông qua:
+ Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm.
+ Đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm.
Hình 2.2. Thiết kế nghiên cứu 2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat
Áp dụng mô hình gây tăng acid uric cấp bằng tiêm màng bụng kali oxonat trên chuột nhắt trắng [7], [42].
○ Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm và chia ngẫu nhiên thành các lô:
- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol.
- Các lô thử: uống cao toàn phần mán đỉa các mức liều.
Chuột được uống dung môi pha thuốc, thuốc đối chiếu allopurinol hoặc các chế phẩm thử với cùng thể tích 0,1 mL/10 g vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thí nghiệm. Trước khi uống dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường. Ngày thứ 5, chuột ở các lô được tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonat pha trong CMC-Na 0,5% với liều 500 mg/kg 1 giờ trước khi uống thuốc lần cuối. Sau khi uống thuốc 2 giờ, lấy máu từ xoang hốc mắt của chuột. Máu được để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ sau đó đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để lấy huyết thanh. Trong
Cao toàn phần mán đỉa Đánh giá ảnh hưởng đến nồng
độ acid uric huyết thanh Xác định cơ chế làm hạ acid uric
huyết thanh
Ảnh hưởng đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột
Ảnh hưởng đến sự thải trừ urat qua thận
thời gian chờ để định lượng acid uric, huyết thanh được bảo quản ở -20oC. Nồng độ acid uric được xác định thông qua việc đo mật độ quang của sản phẩm phản ứng giữa acid uric và hóa chất thử ở bước sóng 520nm.
Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.3.
Hình 2.3. Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến
nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat
○ Thông số đánh giá
- Nồng độ acid uric trong huyết thanh chuột thí nghiệm.
- Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng: I (%) = Cc-Ct
Cc x 100 Trong đó:
Cc, Ct: nồng độ acid uric huyết thanh của lô chứng, lô thử.
I (%): tỷ lệ giảm nồng độ acid uric huyết thanh của lô thử so với lô chứng.
2.3.2. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm enzym xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
Áp dụng mô hình đánh giá ảnh hưởng đến hoạt độ enzym gan chuột thí nghiệm [7], [13], [42], [77].
○ Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh. Chuột được nuôi ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành các lô:
Nhịn ăn Uống thuốc Lấy máu
Uống thuốc hàng ngày
4 ngày Ngày thứ 5
30 phút 60 phút 120 phút
Để lắng và ly tâm máu lấy
huyết thanh Tiêm
- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc.
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol. - Lô thử: uống cao toàn phần mán đỉa.
Chuột được uống dung môi pha thuốc, thuốc đối chiếu allopurinol hoặc các chế phẩm thử với cùng thể tích 0,1 mL/10 g vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thí nghiệm. Trước khi uống dung môi hoặc thuốc 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường.
○ Phương pháp chiết enzym
Kết thúc thực nghiệm, giết chuột bằng cách kéo dãn đốt sống cổ, lấy ngay gan từng chuột. Cân ngay 1 g gan, cắt thành các mảnh nhỏ, cho vào ống nghiền đồng thể đã để lạnh và có sẵn 1 mL dung dịch đệm phosphat lạnh (pH = 7,5). Nghiền gan trong điều kiện lạnh đến khi thu được dịch đồng thể, sau đó thêm dần đệm lạnh để thu được dịch đồng thể với tỷ lệ khối lượng gan : thể tích đệm tương ứng là 1:10. Dịch nghiền thu được đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút. Lấy phần dịch nổi tiếp đem ly tâm lạnh ở 0oC với tốc độ 10000 vòng/phút trong 60 phút. Sau khi ly tâm, phần dịch trong được dùng để xác định hoạt độ enzym.
○ Phản ứng enzym
Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm chứa 2,90 mL đệm phosphat (0,05M, pH 7,5), 2,50 mL dung dịch đệm cơ chất gồm xanthin 0,12 mM, EDTA 0,192 mM, kali oxonat 2,2 mM. Trước khi tiến hành phản ứng, dịch enzym và cơ chất được ủ ở 37oC trong 15 phút. Thời gian phản ứng được tính từ lúc thêm 0,1 mL dịch enzym vào ống nghiệm chứa dung dịch cơ chất. Tiếp tục ủ trong 30 phút. Hút 200 μL dịch sau phản ứng ra đĩa UV 96 giếng để tiến hành đo quang ở bước sóng 290 nm.
Song song tiến hành với mẫu trắng: thay 2,5 mL dung dịch cơ chất trong ống nghiệm bằng 2,5 mL đệm phosphat pH 7,5. Các bước thí nghiệm khác làm tương tự như ở ống nghiệm có phản ứng.
Hình 2.4. Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến
hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
○ Thông số đánh giá
- Đơn vị hoạt độ (U) của enzym được tính bằng lượng acid uric sinh ra trong 1 phút trên 1 g protein ở điều kiện 37oC, pH 7,5. Hàm lượng protein trong gan được định lượng bằng phương pháp Lowry [50].
+ Công thức tính hoạt độ tổng số cho 1 g gan: U1 = (ODthử - ODtrắng) x V x 10
12,2 x Ve x 0,6 x T [12] + Công thức tính hoạt độ riêng: U/g protein = U1
K Trong đó:
ODthử : mật độ quang của mẫu thử.
ODtrắng: mật độ quang của mẫu trắng tương ứng với mẫu thử.
12,2 : hệ số hấp thụ milimol phân tử của acid uric tại bước sóng 290nm (mM-1.cm-1).
10 : hệ số pha loãng. Uống thuốc
• Chuột được cho uống thuốc hàng ngày trong 5 ngày.
Chiết enzym gan
• Lấy gan động vật, nghiền thành dịch đồng thể.
• Ly tâm dịch đồng thể lấy dịch chiết để làm phản ứng enzym.
Tiến hành phản ứng
enzym
• Ủ dịch enzym và dung dịch cơ chất trong 15 phút ở 37oC. • Thực hiện phản ứng trong 30 phút ở 37oC.
0,6 : độ dày cuvet (cm). V : thể tích phản ứng (mL). Ve : thể tích enzym cho vào (mL). T : thời gian phản ứng (phút). K : số g protein/1 g gan.
- Tỷ lệ giảm hoạt độ enzym của lô thử so với lô chứng: I (%) = (1 – B/A) x 100 Trong đó:
A, B: hoạt độ riêng của enzym gan chuột lô chứng và lô thử. I (%): Tỷ lệ giảm hoạt độ enzym của lô thử so với lô chứng.
2.3.3. Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm trừ urat qua thận chuột thí nghiệm
Áp dụng mô hình đánh giá ảnh hưởng đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm của Yu và cộng sự [75].
○ Thiết kế thí nghiệm
Thí nghiệm được thực hiện trên chuột nhắt trắng đực, khỏe mạnh. Chuột được nuôi ổn định trong phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành các lô:
- Lô chứng: uống dung môi pha thuốc. - Lô thử: uống cao toàn phần mán đỉa.
Chuột được uống dung môi hoặc chế phẩm thử với thể tích 0,1 mL/10 g vào một giờ nhất định hàng ngày trong vòng 5 ngày trước khi làm thí nghiệm. Trước khi uống dung môi hoặc chế phẩm thử 1,5 giờ, chuột không được ăn nhưng được uống nước bình thường.
Ngày thứ 5, chuột ở các lô được tiêm màng bụng hỗn dịch kali oxonat pha trong CMC-Na 0,5% liều 500 mg/kg ngay sau khi uống thuốc lần cuối. Các chuột được chăm sóc trong lồng hứng nước tiểu riêng. Trong thời gian hứng nước tiểu, chuột được cho uống nước 1 lần với thể tích 0,1 mL/10 g. Nước tiểu của từng chuột được gom sau mỗi 1 giờ. Gộp nước tiểu thu được sau 4 giờ, ly tâm lấy dịch trong với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút.
Vào thời điểm kết thúc thực nghiệm, lấy máu từ xoang hốc mắt của chuột ở tất cả các lô. Máu được để lắng tự nhiên ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, sau đó được ly tâm để lấy huyết thanh với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút.
Nồng độ acid uric, creatinin được xác định thông qua việc đo mật độ quang của sản phẩm phản ứng giữa acid uric, creatinin và hóa chất thử tương ứng ở bước sóng 520nm, 495nm.
Quy trình thí nghiệm được mô tả ở hình 2.5.
Hình 2.5. Quy trình thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa
đến sự thải trừ urat qua thận chuột thí nghiệm
○ Thông số đánh giá
- Thể tích nước tiểu chuột thí nghiệm. - pH nước tiểu chuột thí nghiệm.
- Nồng độ acid uric nước tiểu chuột thí nghiệm. - Nồng độ acid uric huyết thanh chuột thí nghiệm. - Nồng độ creatinin nước tiểu chuột thí nghiệm. - Nồng độ creatinin huyết thanh chuột thí nghiệm.
- Hệ số thải trừ urat: HS = [57] Trong đó:
UAU, SAU: nồng độ acid uric trong nước tiểu, huyết thanh. UCr, SCr: nồng độ creatinin trong nước tiểu, huyết thanh. HS: hệ số thải trừ urat. Uống thuốc hàng ngày 4 ngày Nhịn ăn 1,5 giờ 4 giờ Lấy máu Ngày thứ 5 Hứng nước tiểu U𝐴𝑈/S𝐴𝑈 U𝐶𝑟/S𝐶𝑟 Ly tâm máu và nước tiểu Uống thuốc,
2.3.4. Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả được biểu diễn dưới dạng M ± SE (M: giá trị trung bình của từng lô, SE: sai số chuẩn). So sánh giá trị trung bình giữa các lô bằng phân tích One-Way ANOVA, dùng test hậu kiểm Dunnett t hoặc Dunnett’s T3 để so sánh giá trị trung bình của các lô thử so với lô chứng (đối với thiết kế nghiên cứu có từ 3 lô trở lên) hoặc dùng TTest (đối với thiết kế nghiên cứu có 2 lô).
Phân tích thống kê bằng phần mềm SPSS 20.0, sự khác biệt giữa các lô được coi là có ý nghĩa khi p < 0,05.
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
3.1. Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat
Thí nghiệm được thực hiện với mục đích xác định tác dụng hạ acid uric huyết thanh và tìm ra liều dùng có tác dụng của dược liệu mán đỉa.
Do liều dùng theo kinh nghiệm dân gian của mán đỉa chưa được công bố trong các tài liệu, đề tài lựa chọn mức liều thường được sử dụng trong các nghiên cứu về dược liệu là 10 g dược liệu/kg và tăng - giảm tạo các bước nhảy liều. Cụ thể, thí nghiệm được thiết kế với 3 mức liều: 3 g dược liệu/kg, 10 g dược liệu/kg và 30 g dược liệu/kg.
Chứng dương allopurinol được sử dụng với liều 10 mg/kg xác định theo các nghiên cứu đã công bố [7], [21], [42], [77].
Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định ở điều kiện phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành các lô như sau:
- Lô chứng: uống hỗn hợp dung môi PEG/nước (20/80).
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol liều 10 mg/kg pha trong dung môi PEG/nước.
- Lô mán đỉa 1: uống cao toàn phần mán đỉa liều tương đương 3 g dược liệu/kg pha trong dung môi PEG/nước.
- Lô mán đỉa 2: uống cao toàn phần mán đỉa liều tương đương 10 g dược liệu/kg pha trong dung môi PEG/nước.
- Lô mán đỉa 3: uống cao toàn phần mán đỉa liều tương đương 30 g dược liệu/kg pha trong dung môi PEG/nước.
Tiến hành thí nghiệm theo quy trình mô tả trong mục 2.3.1.
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh chuột thí nghiệm được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1.
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh
trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat
Lô Liều n
Nồng độ acid uric huyết thanh
(µmol/L)
Tỷ lệ giảm acid uric huyết thanh so với chứng (%)
Chứng - 10 140,69 ± 13,45 -
Allopurinol 10 mg/kg 9 24,01 ± 1,51** 82,9
Mán đỉa 1 3 g dược liệu/kg 9 108,62 ± 32,55 22,8
Mán đỉa 2 10 g dược liệu/kg 9 51,21 ± 6,61** 63,6
Mán đỉa 3 30 g dược liệu/kg 7 44,60 ± 3,86** 68,3 ** p < 0,01 khi so sánh với lô chứng
Hình 3.1. Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến nồng độ acid uric huyết thanh
trên mô hình gây tăng cấp bằng kali oxonat ** p < 0,01 khi so sánh với lô chứng
N ồng đ ộ acid ur ic huy ết tha nh ( µ m ol/ L) Chứng n = 10 Allopurinol 10 mg/kg n = 9 Mán đỉa 1 3 g DL/kg n = 9 Mán đỉa 2 10 g DL/kg n = 9 Mán đỉa 3 30 g DL/kg n = 7
Nhận xét:
- Cao toàn phần mán đỉa liều tương đương 10 g dược liệu/kg và 30 g dược liệu/kg có tác dụng làm hạ acid uric huyết thanh chuột nhắt trắng trên mô hình gây tăng acid uric cấp bằng kali oxonat. Tỷ lệ giảm nồng độ acid uric khi so sánh với lô chứng lần lượt là 63,6% và 68,3% (p < 0,01). Trong khi đó, mức liều tương đương 3 g dược liệu/kg không thể hiện tác dụng này.
- Thuốc đối chiếu allopurinol có tác dụng hạ acid uric huyết thanh rõ rệt, tỷ lệ giảm khi so sánh với lô chứng là 82,9% (p < 0,01).
- Khi so sánh nồng độ acid uric huyết thanh của 2 lô thử dùng cao toàn phần mán đỉa liều tương đương 10 g dược liệu/kg và 30 g dược liệu/kg, sự khác biệt là không có ý nghĩa thống kê. Do đó, mức liều tương đương 10 g dược liệu/kg được lựa chọn để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Cơ chế làm hạ acid uric huyết thanh in vivo của cao toàn phần mán đỉa
Cơ chế tác dụng của các thuốc làm hạ acid uric hiện nay chủ yếu là ngăn cản quá trình hình thành acid uric thông qua ức chế xanthin oxidase hoặc làm tăng thải trừ acid uric qua thận. Các thí nghiệm tiếp theo được thực hiện để bước đầu xác định tác dụng hạ acid uric của mán đỉa có được là do cơ chế nào trong 2 cơ chế trên.
3.2.1. Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm
Chuột nhắt trắng được nuôi ổn định ở điều kiện phòng thí nghiệm và được chia ngẫu nhiên thành các lô như sau:
- Lô chứng: uống hỗn hợp dung môi PEG/nước (20/80).
- Lô đối chiếu: uống thuốc đối chiếu allopurinol liều 10 mg/kg pha trong dung môi PEG/nước.
- Lô mán đỉa: uống cao toàn phần mán đỉa liều tương đương 10 g dược liệu/kg pha trong dung môi PEG/nước.
Tiến hành thí nghiệm theo quy trình được mô tả ở mục 2.3.2.
Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase gan chuột thí nghiệm được thể hiện ở bảng 3.2 và hình 3.2.
Bảng 3.2. Ảnh hưởng của cao toàn phần mán đỉa đến hoạt độ xanthin oxidase
gan chuột thí nghiệm
Lô Liều n Hoạt độ