Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ XUÂN TÌNH ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI 2015... Định

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN TÌNH

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ XUÂN TÌNH

ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN LẠC NHÂN NHẰM GIẢM NHIỄM ĐỘC TỐ VI NẤM AFLATOXIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn :

1 ThS Lê Thị Phương Thảo

2 ThS Đặng Thị Ngọc Lan Nơi thực hiện :

Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia

HÀ NỘI 2015

LỜI CẢM ƠN

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới ThS Lê Thị

Phương Thảo, ThS Đặng Thị Ngọc Lan đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt quá

trình thực hiện và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong bộ môn Hóa phân tích và Độc chất – Trường Đại học Dược Hà Nội, ban lãnh đạo cùng toàn thể cán bộ nhân viên Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu để thực hiện đề tài

Tôi gửi lời cảm ơn các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã quan tâm dìu dắt và truyền thụ kiến thức cho tôi trong năm năm học vừa qua Cảm ơn bạn bè thân thiết luôn sát cánh, nhiệt tình chia sẻ giúp đỡ tôi suốt quá trình học tập và thực hiện khóa luận

Cuối cùng, với tất cả lòng biết ơn sâu nặng, tôi xin dành cho bố mẹ, anh chị những người đã chăm sóc, cổ vũ động viên yêu thương và cảm thông sâu sắc

Hà Nội, ngày 14 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Lê Xuân Tình

MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG ii

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ iii

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Chương 1 TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về độc tố vi nấm aflatoxin 2

1.1.1 Chủng nấm sinh độc tố và điều kiện phát sinh độc tố aflatoxin 2

1.1.2 Cấu tạo và tính chất hóa lý của aflatoxin 3

1.1.3 Độc tính aflatoxin 4

1.1.4 Một số phương pháp xác định aflatoxin 6

1.2 Thực trạng sản xuất, sử dụng lạc và quy định giới hạn nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam 9

1.2.1 Thực trạng sản xuất và sử dụng lạc tại Việt Nam 9

1.2.2 Thực trạng nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam 10

1.2.3 Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong lạc 11

1.3 Một số nghiên cứu bảo quản lạc nhằm giảm nhiễm aflatoxin 11

1.3.1 Thế giới 11

1.3.2 Việt Nam 13

1.4 Công nghệ bảo quản 13

1.4.1 Bảo quản bằng bao bì 13

1.4.2 Bảo quản bằng điều biến khí quyển 15

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị 16

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ 16

2.1.2 Hóa chất, thuốc thử 17

2.2 Đối tượng và nội dung nghiên cứu 17

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2.2 Nội dung nghiên cứu 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 20

2.3.1 Phương pháp bảo quản 20

2.3.2 Phương pháp kiểm nghiệm 20

Chương III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN……… 24

3.1 Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản……… ……24

3.1.1 Xác định độ ẩm của lạc nhân trước khi bảo quản 24

3.1.2 Mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin 25

3.2 Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các giải pháp 25

3.2.1 Sự thay đổi độ ẩm 25

3.2.2 Xác định hàm lượng AF 30

3.3 Bàn luận 33

3.3.1 Về việc lựa chọn lạc nhân trước khi bảo quản 33

3.3.2 Về chất liệu bảo quản lạc nhân 34

3.3.3 Về thay đổi điều kiện môi trường bảo quản lạc nhân 34

3.3.4 So sánh phương pháp bảo quản truyền thống với phương pháp mới 35

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

KẾT LUẬN

KIẾN NGHỊ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BNNPTNT Bộ Nông nghiệp và Phát triển

Organization of the United Nations

ICRISAT Viện Nghiên cứu cây trồng

vùng bán khô hạn nhiệt đới quốc tế

The International Crops Research Institute for the Semi-Arid-Tropics

KQĐ Không quy định

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.3 Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong hạt lạc (sau khi đã tách vỏ) 11 Bảng 2.1 Đóng gói lạc với các vật liệu bao gói và môi trường khí quyển

Bảng 2.2 Mã hóa mẫu lạc nhân trong các điều kiện bảo quản 19

Bảng 3.6 Độ ẩm của lạc nhân trong suốt quá trình bảo quản 27 Bảng 3.7 Sự biến thiên độ ẩm của lạc nhân ở điều kiện bảo quản khác

Bảng 4.1 Hàm lượng AF trong lạc nhân bảo quản bằng các giải pháp 37

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 So sánh điều kiện cho sự phát triển và sản xuất aflatoxin bởi A

flavus và A parasiticus Tối ưu cho tăng trưởng (—) và cho sản

Hình 1.5 Sơ đồ chiến lược quản lý aflatoxin trong lạc trước và sau thu

Hình 3.1 Sự thay đổi độ ẩm của lạc nhân đã được lựa chọn và lạc nhân

chưa được chọn lựa cùng bảo quản trong bao đay điều kiện môi

Hình 3.2 Sự thay đổi độ ẩm của lạc nhân trong các điều kiện bảo quản

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây lạc (Arachis hypogaea L.) là cây công nghiệp ngắn ngày, có nguồn gốc từ

Nam Mỹ được trồng rộng rãi trên khắp đất nước Việt Nam cho năng suất và hiệu quả kinh tế cao Hạt lạc là nguồn cung cấp năng lượng (573 kcal/100g), bổ sung đạm và chất béo quan trọng cho con người do có chứa 27,5% protein, 44,5% lipit, 15,5% glucid, các nguyên tố vi lượng (kali, phospho, magie, mangan, sắt, natri, kẽm, đồng), các vitamin (PP, E, B5, B1, B2, B6, folat), các axit amin [11] Do có giá trị dinh dưỡng cao, từ lâu loài người đã sử dụng lạc như một nguồn thực phẩm và nguyên liệu cho công nghiệp dầu, magarin, kẹo bánh, nước chấm

Việt Nam có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển, trong đó có nhiều loài sinh độc tố vi nấm Trong khi lạc là cơ chất thích hợp đối với nấm mốc sinh độc tố aflatoxin (AF), chất được Cơ quan Nghiên cứu Ung thư quốc tế (IARC) phân loại thuộc nhóm có độc tính cao gây ung thư [23] Do

đó, việc nghiên cứu các giải pháp can thiệp nhằm giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm aflatoxin trong lạc và sản phẩm từ lạc là cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao nhằm bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng

Trên thế giới đã có các nghiên cứu về giải pháp nhằm hạn chế sự phát triển của nấm mốc sinh aflatoxin và biện pháp làm giảm hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm Đối với lạc sau thu hoạch, một số nghiên cứu có dùng hóa chất, hoạt chất từ thực vật hoặc vi sinh vật, tuy nhiên, các biện pháp này còn hạn chế do ảnh hưởng đến cảm quan và an toàn thực phẩm của lạc Lạc trong quá trình bảo quản vẫn tiếp tục hô hấp, sinh hơi nước tạo môi trường ẩm thuận lợi cho nấm mốc phát triển, trong đó có nấm sinh độc tố aflatoxin Do vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề

tài: “Đánh giá một số phương pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm độc tố

vi nấm aflatoxin” với mục tiêu của đề tài là:

1 Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm độc tố vi nấm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản

2 Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các biện pháp bảo quản khác nhau

Chương 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về độc tố vi nấm aflatoxin

Theo số liệu thống kê của tổ chức Nông lương thế giới (FAO), ước tính có khoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm độc tố vi nấm mycotoxin sản sinh chủ

yếu bởi chi nấm Aspergillus, Penicillium, Alternaria, Fusarium và Claviceps [21]

Trong số các độc tố vi nấm, aflatoxin được xem như độc tố chính được phát hiện sớm nhất và được nghiên cứu đầy đủ nhất về mọi phương diện

1.1.1 Chủng nấm sinh độc tố và điều kiện phát sinh độc tố aflatoxin

1.1.1.2 Điều kiện phát sinh độc tố

Các điều kiện thuận lợi cho sự nảy mầm và phát triển aflatoxin bởi loài A

flavus và A parasitcus qua khảo sát trong ống nghiệm được thể hiện trong hình 1.1

Hình 1.1: So sánh điều kiện cho sự phát triển và sản xuất aflatoxin bởi A flavus và

A parasiticus Tối ưu cho tăng trưởng (—) và cho sản xuất aflatoxin ( -)

Theo đó, điều kiện tối ưu có sản xuất aflatoxin bởi hai loài này là 33ºC và hoạt

độ nước là 0,99, trong khi điều kiện tối ưu cho tăng trưởng và phát triển là 35ºC và hoạt độ nước là 0,95 [25]

Aflatoxin có thể phát triển trong các sản phẩm nông nghiệp ở cả giai đoạn trước và sau thu hoạch nhưng việc ô nhiễm với hàm lượng cao thường liên quan tới

hư hỏng sau thu hoạch, bảo quản ở điều kiện độ ẩm và nhiệt độ cao làm cho nấm mốc phát triển nhanh Các sản phẩm thường có nguy cơ bị nhiễm aflatoxin cao nhất

Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của một số aflatoxin

AFB1 được chuyển hóa chủ yếu qua gan tạo thành AFB1-8,9-exo-epoxide và 8,9-endo-epoxide Exo-epoxide liên kết với DNA thành sản phẩm cộng 8,9-dihydro-8-(N7-guanyl)-9-hydroxy AFB1 (AFB1-N7-gua) chiếm ưu thế AFB1-N7-gua có thể được chuyển thành 2 thương tổn thứ cấp là vị trí apurinic và 1 vòng ổn định hơn được mở từ sản phẩm cộng AFB1-FAPY; sau này trong invivo sẽ xuất hiện bền vững hơn AFB1-N7-gua Tại gan, aflatoxin được chuyển hóa bởi nhóm enzyme cytochrome P450 chủ yếu là CYP3A4, 3A5, 3A7, 1A2

AFM1 là dẫn xuất hydroxyl hóa bậc một của AFB1 được tạo thành trong gan qua enzyme chuyển hóa cytochrome P450 Động vật có vú ăn thức ăn bị nhiễm AFB1 bài tiết một lượng chất chuyển hóa được hydroxyl hóa ở vị trí số 4 thành AFM1 vào trong sữa [21]

 Độc tính

Aflatoxin có thể gây ngộ độc cấp tính, xảy ra khi AF xâm nhập vào cơ thể qua đường ăn uống ở liều lượng cao trong thời gian ngắn Điều này diễn ra ở một vài nước đang phát triển ví dụ như ở Kenya năm 2004 đã xảy ra sự bùng nổ nghiêm trọng độc tính cấp của độc tố afatoxin với 317 ca được phát hiện trong đó 125 ca tử vong (chiếm 39.4%) Trong ca này, ngô được cung cấp cho người sử dụng bị nhiễm aflatoxin nồng độ dao động từ 20 đến 8000µg/kg Độc tính cấp trên người đặc trưng bởi tình trạng nôn, đau bụng, phù phổi hoặc não, gan nhiễm mỡ Các triệu chứng khác bao gồm chán ăn, trầm cảm, vàng da, tiêu chảy và nhạy cảm với ánh sáng [21] Tuy nhiên, AF gây ra ngộ độc mãn tính nguy hiểm hơn, ngay ở liều lượng thấp khi tiếp xúc trong thời gian dài Các aflatoxin được IARC xếp vào nhóm 1

(Phụ lục 2) Mặt khác, có bằng chứng đầy đủ trên động vật thử nghiệm về khả năng

gây ung thư của AFM1 (tiềm năng gây ung thư ước tính thấp hơn xấp xỉ 10 lần so với AFB1), đang được xếp vào nhóm có khả năng gây ung thư cho người (nhóm

2B) (Phụ lục 2)

Đối với con người, sự tiêu thụ lâu dài thực phẩm bị nhiễm aflatoxin có liên quan đến các bệnh khác nhau sau [21]:

- Ung thư gan Có bằng chứng chứng minh sự kết hợp giữa tác động của AF

và bệnh viêm gan virus B và/hoặc C là nguyên nhân gây ra ung thư tế bào biểu mô gan

- Ảnh hưởng đến chức năng sinh sản Aflatoxin gây ảnh hưởng xấu lên chức năng sinh sản của nam giới, là nguyên nhân của chứng tinh hoàn chậm phát triển, thoái hóa tinh hoàn, giảm lượng tinh trùng, thay đổi hình thái, giảm kích thước và trọng lượng tinh hoàn, khả năng phân bào giảm, giảm tỷ lệ phần trăm tinh trùng sống sót, tinh trùng bất thường gia tăng, sự thoái hóa của tế bào biểu mô và giảm nồng độ testosterone trong huyết tương

- Tác động lên hệ thống miễn dịch Aflatoxin hoạt động như những kháng nguyên, làm suy giảm khả năng chống nhiễm trùng thứ phát do nấm, ký sinh trùng

và vi khuẩn gây ra Hoạt động của tế bào lympho B hoặc T bị suy giảm, chức năng

thực bào của đại thực bào và bạch cầu trung tính bị suy yếu Sự tổng hợp các cytokines chống nhiễm trùng bị thay đổi, tế bào trung gian ly giải NK bị ức chế, kích hoạt gây ra các nhiễm trùng mãn tính, giảm khả năng miễn dịch khi tiêm chủng vaccin và làm giảm chức năng miễn dịch trong động vật đang phát triển

- Bệnh lý não với thoái hóa mỡ của nội tạng gần giống với hội chứng Reye Vai trò của aflatoxin trong sự phát triển của hội chứng Reye (thoái hóa mỡ, gan và thận to ra và nhợt nhạt, phù nề và đột quỵ) chưa bao giờ được chứng minh một cách

rõ ràng mặc dù aflatoxin được phát hiện là thường có trong gan của những đứa trẻ

bị chết bởi chứng bệnh này và do đó vấn đề này vẫn còn đang được thảo luận thêm

- Xơ hóa nhu mô phổi Người ta cho rằng aflatoxin qua đường hô hấp có thể gây nguy hiểm

1.1.4 Một số phương pháp xác định aflatoxin

1.1.4.1 Phương pháp ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)

Shi Chun Pei, Yuan Yuan Zhang, Sergei A Eremin, Won Jong Lee (2009) [22] đã dùng phương pháp cạnh tranh gián tiếp ELISA, sử dụng kháng thể đơn dòng

để đo AFM1 trong sữa và sản phẩm của sữa Giới hạn phát hiện nồng độ của AFM1

là 0,04ng/mL Mức độ nhiễm AFM1 được đo trong 12 mẫu sữa nguyên liệu, 15 mẫu sữa bột, 104 mẫu sữa nước và bốn mẫu phomat được lấy từ các siêu thị khác nhau ở Đông Bắc của Trung Quốc

Kỹ thuật này có ưu điểm: nhanh, đơn giản, tiết kiệm dung môi, đặc hiệu và khá nhạy cảm nhưng dễ cho kết quả dương tính và âm tính giả Phân tích ELISA thuận tiện cho việc xác định đồng thời các chất ô nhiễm trong một số lượng lớn các mẫu với chi phí thấp và thời gian ngắn Tuy nhiên, nó không thích hợp để định lượng các chất ô nhiễm vì nó có thể bị ảnh hưởng bởi hiệu ứng của nhiều mẫu và có khả năng để đánh giá quá cao các chất gây ô nhiễm ở nồng độ rất thấp

1.1.4.2 Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)

Jorg Stroka, Robert van Otterdijk, Elke Anklam (2000) [16] đã sử dụng phương pháp TLC một chiều để xác định AF trong các loại thực phẩm khác nhau bằng việc sử dụng dung môi chlor Sử dụng cột ái lực miễn dịch để làm sạch sau khi

được chiết với methanol Các giới hạn định lượng được tìm thấy là thấp hơn so với giới hạn quy định hiện hành về kiểm soát AF bên ngoài và trong cộng đồng Châu

Âu

Phương pháp TLC là một phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không cần đầu

tư lớn Nó thay thế cho phương pháp HPLC hiện đại nếu không có thiết bị HPLC, tuy nhiên không thể phát hiện và xác định được AF khi ở nồng độ thấp

1.1.4.3 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

TCVN [4, 5] và nhiều tác giả trên thế giới sử dụng HPLC có dẫn xuất sau cột

và làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch hoặc làm sạch bằng chiết pha rắn với detector huỳnh quang và detector UV để xác định các mycotoxin trong các loại ngũ cốc khác nhau Cụ thể:

TCVN 7930:2008 [5] Thực phẩm Xác định AFB1 và AF tổng trong ngũ cốc, quả có vỏ và sản phẩm của chúng

Theo Zhaohui Fu, Xueiang Huang, Shungeng Min (2008) [26] đã phát triển phương pháp sử dụng HPLC với detector UV để xác định aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong ngô và lạc Trong phương pháp này, aflatoxin được chiết với hỗn hợp của acetonitril trong H2O (86:14) và sau đó làm sạch bằng cột ái lực miễn dịch

Phương pháp HPLC là một phương pháp thông dụng để xác định các hợp chất hữu cơ Tuy nhiên, phương pháp có độ nhạy không cao khi sử dụng detector UV, còn khi sử dụng detector huỳnh quang, phương pháp có độ nhạy tốt hơn nhưng chỉ

có thể nhận biệt chất phân tích thông qua thời gian lưu Đối với những nền mẫu phức tạp như thực phẩm, rất khó có thể khẳng định chất cần phân tích bằng phương pháp này

Micromass Quattro Ultima Phương pháp này có độ tuyến tính R2≥0,9990, độ thu hồi trung bình (74,7 – 86,8%) và độ chính xác (độ lệch chuẩn tương đối ≤ 10,9%)

Nó đã được chứng minh là một phương pháp thích hợp để xác định đồng thời sáu

AF trong lạc và các sản phẩm của chúng

Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ đặc biệt là phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ, là một kỹ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây Phương pháp này có nhiều ưu điểm như độ chọn lọc cao, giới hạn phát hiện thấp, thời gian phân tích nhanh, có thể định lượng đồng thời các chất có thời gian lưu giống nhau

mà phương pháp sắc kí lỏng thông thường không làm được

Với những ưu điểm của phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ chúng tôi

đã chọn để phân tích độc tố aflatoxin trong lạc nhân để đánh giá một số biện pháp bảo quản lạc nhân nhằm giảm nhiễm AF

 Kỹ thuật sắc ký lỏng kết hợp với khối phổ

Mô hình đơn giản của hệ thống LC-MS như ở hình 1.3

Hình 1.3: Mô hình đơn giản hệ thống LC-MS

- Sắc ký lỏng (LC)

Sắc ký là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được chuyển lên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phân tích được phân bố liên tục giữa pha động

và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chất phân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nên khả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau Trong HPLC, pha tĩnh chính là chất nhồi cột làm nhiệm vụ tách hỗn hợp chất phân tích, đó là những chất rắn, xốp và kích thước hạt rất nhỏ, từ 3 – 7µm Pha động đóng góp một phần rất quan trọng trong việc tách các chất phân tích trong quá

tích khối

Detector/ Lưu giữ số liệu

trình sắc ký nhất định Mỗi loại sắc ký đều có pha động rửa giải riêng cho nó để có được hiệu quả tách tốt

- Khối phổ (Mass Spectrometry)

Khối phổ là thiết bị phân tích dựa trên cơ sở xác định khối lượng phân tử của các hợp chất hóa học bằng việc phân tách các ion phân tử theo tỉ số giữa khối lượng

và điện tích (m/z) của chúng Các ion có thể tạo ra bằng cách thêm hay bớt điện tích của chúng như loại bỏ electron, proton hóa, Các ion tạo thành này được tách theo

tỉ số m/z và phát hiện, từ đó có thể cho thông tin về khối lượng hoặc cấu trúc phân

tử của hợp chất

Hình 1.4: Sơ đồ cấu trúc của máy khối phổ MS

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm 3 phần chính: nguồn ion, thiết bị phân tích và bộ phận phát hiện (hình 1.4) Trước hết, các mẫu được ion hóa trong nguồn ion, sau đó đưa vào bộ phận phân tích khối để tách các ion theo tỉ số m/z Sau đó các ion đi vào bộ phận phát hiện (detector), sẽ được khuếch đại và chuyển thành tín hiệu Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ

1.2 Thực trạng sản xuất, sử dụng lạc và quy định giới hạn nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam

1.2.1 Thực trạng sản xuất và sử dụng lạc tại Việt Nam

Chân không cao Tránh ion phân tích va chạm

với ion trong không khí

Theo số liệu của Tổng cục Thống kê Việt Nam, diện tích gieo trồng lạc tính đến ngày 15 tháng 3 năm 2015 đạt 127,3 nghìn hecta đạt 100,5% so với cùng kỳ năm ngoái [28] Điều kiện thuận lợi và những cải thiện về giống sẽ góp phần thúc đẩy năng suất và sản lượng lạc Tổ chức USDA dự kiến sản lượng lạc năm 2015 của Việt Nam sẽ tăng lên 550 nghìn tấn Khu vực trồng lạc chủ yếu tập trung ở bờ biển Bắc Trung Bộ, khu vực miền núi và trung du Bắc Bộ và Duyên hải Nam Trung Bộ

Bảng 1.2 Sản lượng lạc của Việt Nam

1.2.2 Thực trạng nhiễm aflatoxin trong lạc tại Việt Nam

Ở Việt Nam có một số nghiên cứu về tình hình nhiễm mycotoxin trong thực phẩm Trong số các đề tài công bố gần đây như:

Virmani đã tiến hành nghiên cứu ở 7 vùng sinh thái của Việt Nam và đánh giá mối liên quan của nguy cơ nhiễm aflatoxin tại các vùng sinh thái tại 3 giai đoạn: (1) Giai đoạn sinh trưởng và phát triển

(2) Giai đoạn thu hoạch và làm khô

(3) Giai đoạn tàng trữ

Nhìn chung kết quả cho thấy nguy cơ nhiễm aflatoxin trong lạc trong quá trình tàng trữ ở mức độ cao trên toàn Việt Nam [24]

Theo khảo sát mức độ nhiễm mycotoxin trong lạc tại tỉnh Bắc Giang của tác giả Lê Thị Hồng Hảo [1], kết quả phân tích các mẫu lạc nhân cho thấy phát hiện có nhiễm aflatoxin tổng số chiếm 46,7%, trong đó 6,7% trong số các mẫu nhiễm có kết quả aflatoxin và AFB1 vượt quá ngưỡng cho phép theo QCVN 8-1:2011/BYT Mẫu lạc được lấy và kiểm nghiệm sau thu hoạch khoảng 2 tháng có tỉ lệ mẫu nhiễm AF ít hơn so với nghiên cứu sau thu hoạch 6 tháng có tỉ lệ nhiễm lên đến 98% Trong số các mẫu nhiễm aflatoxin 100% nhiễm AFB1, chỉ duy nhất 1/14 mẫu nhiễm AFB2 chiếm tỷ lệ 3,3% Có 2 mẫu nhiễm AFG1 chiếm tỉ lệ 6,7%, trong khi không có mẫu nào nhiễm AFG2

1.2.3 Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong lạc

Bảng 1.3 Giới hạn ô nhiễm aflatoxin trong hạt lạc (sau khi đã tách vỏ) [3]

1.3 Một số nghiên cứu bảo quản lạc nhằm giảm nhiễm aflatoxin

1.3.1 Thế giới

Viện nghiên cứu quốc tế cây lương thực bán khô hạn (ICRISAT) đã ban hành một quy trình tổng hợp nhằm quản lý nhiễm aflatoxin trong lạc trước và sau thu hoạch

Hình 1.5: Sơ đồ chiến lược quản lý aflatoxin trong lạc trước và sau thu hoạch [12]

Trên thế giới đã có các nghiên cứu về các giải pháp nhằm hạn chế sự phát triển của nấm mốc sinh AF và biện pháp làm giảm hàm lượng AF trong lạc sau thu hoạch như:

 Phân loại

Bước đầu tiên trong bảo quản lạc sau thu hoạch là sàng lọc để loại bỏ những hạt có nguy cơ bị nhiễm độc tố vi nấm Theo báo cáo của Dorner (2008) [15], lạc bị nhiễm AF thường bị đổi màu, bằng cách sử dụng kỹ thuật phân loại màu điện tử (ECS) có thể làm giảm 70% khả năng nhiễm AF

 Kiểm soát sinh học

Chủng Bacillus megaterium phân lập ở vùng biển Hoàng Hải phía Đông

Trung Quốc được đánh giá là có khả năng kiểm soát quá trình phân hủy của hạt lạc

gây ra bởi A flavus trong thử nghiệm in vitro và in vivo Theo đó, dịch tế bào vi

khuẩn này làm giảm quá trình sinh tổng hợp của AF và sự biểu hiện của gen afIR và

Lựa chọn kiểm soát

Thời vụ, cải tạo đất

Kỹ thuật thu hoạch và sau

thu hoạch

Làm khô và lưu trữ

Chuyển giao công nghệ và vấn đề xã hội

Nghiên cứu và theo dõi khu vực Nhận thức cộng đồng Tác động thương mại Hội đồng tư vấn

Tư vấn cho ngành công nghiệp

Đào tạo

Đánh giá/ Thực thi cấp khu vực

Đề ra biện pháp với từng khu vực

và xúc tiến thực hiện

Quản lý trước và sau thu hoạch

 Đóng gói điều biến khí quyển

Nghiên cứu của Hagit Navarro và cộng sự (2012) [14] cho thấy lạc được đóng kín trong điều kiện kiểm soát khí quyển 99% CO2 với độ ẩm 7% và 8% bảo quản được chất lượng tốt nhất với số bào tử nấm thấp (≤9,7 ×101CFU/g)

1.3.2 Việt Nam

Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Hiền Trang (2012) về việc sử dụng chế phẩm

sinh học Trichoderma để hạn chế nấm mốc vàng A flavus cho thấy có kết quả hàm

lượng AF trong các mẫu nghiên cứu thấp hơn ngưỡng cho phép [9]

Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Văn Thắng (2011) [8] về ảnh hưởng của công

nghệ sau thu hoạch tới sự phát triển của nấm mốc A flavus và khả năng sinh độc

tốaflatoxin ở lạc cho thấy lạc phơi nắng bảo quản an toàn hơn lạc sấy, lạc có độ ẩm

10 - 12% bảo quản tốt hơn so với lạc có độ ẩm 14 - 16%; Lạc bảo quản mát sau 6 tháng có hàm lượng AF thấp hơn lạc bảo quản thường, lạc bảo quản bao hai lớp có hàm lượng AF nhiễm cao hơn lạc bảo quản bằng bồ cót và bao dứa ở cùng điều kiện

1.4 Công nghệ bảo quản

1.4.1 Bảo quản bằng bao bì

Bao bì chứa đựng thực phẩm không chỉ có chức năng vận chuyển, chứa đựng

mà còn là phương tiện quan trọng để giữ gìn nguyên vẹn số lượng và chất lượng sản phẩm Bao bì chứa đựng có thể giúp sản phẩm kéo dài thời hạn sử dụng sản phẩm, duy trì chất lượng và an toàn thực phẩm, chống lại các yếu tác động môi trường, các nguy cơ ô nhiễm hoá học, vật lý và sinh học Bao bì chứa đựng thực phẩm có thể có nguồn gốc nguyên liệu từ thuỷ tinh, kim loại, nhựa Trong bảo quản lạc các dụng

cụ và vật liệu chứa đựng thông thường đối với hộ dân là bao tải, bao nilon, bao tải lót nilon hoặc với các hộ gia đình chứa ít lạc thì đựng trong chum, vại, lọ

 Màng bao PE

- Là chất trùng hợp của Etylen, được sản xuất đầu tiên ở Anh – 1933 (sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực bao gói vào những năm 50) và sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực bao gói

- Mạch phân tử không có cực, không có nhóm thế nên độ bền cơ học kém, nhưng chịu được nhiệt độ thấp, không độc

- Do PE có khoảng mềm dẻo rộng, đồng thời ở nhiệt độ cao bị nóng chảy chậm nên khi làm kín bằng phương pháp hàn nóng tạo ra mối ghép khá bền và kín

- PE chịu được tác động của axit hữu cơ, vô cơ (trừ loại đậm đặc khả năng ôxy hóa cao), các bazơ mạnh, cồn dưới 70º , không chịu Cl2, Br2 và I2 bị hấp thụ, ít chịu các loại dầu, hydrocarbon, xăng, bị phồng trong môi trương toluen, cacbontetrachlorid

- PE thấm khí (O2, CO2, SO2), thấm mùi, nhưng ít thấm hơi nước

- Khả năng bám dính các vật liệu trên bề mặt kém, do đó màng PE thường phải được xử lý bề mặt trước khi in (bằng các tác nhân ôxy hoá hoặc hồ quang)

 Màng bao PP (polypropylen)

- Là sản phẩm của phản ứng trùng hợp propylen tạo polymer có tính bền cơ học cao, khá cứng vững, không mềm dẻo như PE, không bị kéo giãn dài do đó được chế tạo thành sợi Đặc biệt khả năng bị xé rách dễ dàng khi có một vết cắt hoặc một vết thủng nhỏ

- Trong suốt, độ bền cơ học cao cho khả năng in ấn rõ nét

- Chịu được nhiệt độ cao hơn 100ºC

- Có tính chống thấm O2, hơi nước, dầu mỡ và các khí khác

Nghiên cứu của Mutegi về ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến chất lượng

và sự ô nhiễm aflatoxin trong lạc ở Kenya cho thấy lạc bảo quản sau 6 tháng trong bao đay bị nhiễm aflatoxin thấp hơn lạc bảo quản trong bao polyethylen và polypropylene [11] Trong nghiên cứu này, đề tài dùng bao đay bảo quản như mẫu

chứng, còn loại bao bì túi PP được sử dụng để thay đổi môi trường khí quyển trong bao gói

1.4.2 Bảo quản bằng điều biến khí quyển

Đóng gói trong môi trường khí điều biến (MAP – Modified Atmosphere Packaging) là kỹ thuật mà thực phẩm chứa trong một bao gói có khí quyển trong bao gói đó đã thay đổi hoặc thay thế các thành phần: cacbon dioxit, ôxy, nitơ, hơi nước và các khí lượng vết Quá trình này hạn chế hoạt động của vi sinh vật cũng như sinh hóa Sự điều biến này được thực hiện bằng cách bơm khí vào bao gói - không khí thoát ra và thay thế bằng hỗn hợp khí đã được kiểm soát

Việc biến đổi khí quyển có thể đạt được bằng cách chủ động hoặc bị động Biến đổi chủ động liên quan đến việc thay thế hỗn hợp khí thích hợp và kiểm soát được Biến đổi bị động xảy ra như kết quả của quá trình hô hấp thực phẩm và/ hoặc

sự trao đổi chất của vi sinh vật gắn liền với thực phẩm Sự thấm khí qua màng phụ thuộc vào bản chất của màng và nhiệt độ bảo quản, đồng thời ảnh hưởng bởi thành phần của khí quyển tạo nên

Trong quá trình bảo quản lạc, quá trình hô hấp vẫn tiếp tục xảy ra và sinh hơi nước nhờ sự có mặt của ôxy, do đó ở điều kiện môi trường không khí thông thường chính quá trình hô hấp làm tăng nhiệt độ, độ ẩm của lạc và là điều kiện thuận lợi cho nấm mốc phát triển Do vậy đề tài lựu chọn các biện pháp bảo quản đóng túi: hút chân không, thay đổi môi trường khí bằng khí nitơ

Chương II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.1.1 Thiết bị, dụng cụ

- Bao bì: bao đay, túi PP

- Đóng gói với môi trường không khí, khí N2, máy đóng túi hút chân không

- Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ LC/MS/MS bao gồm: HPLC 20 AXL của Shimadzu và khối phổ ABI 5500 QQQ của Aplied Biosystem: Bộ phận bơm dung môi, bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt và detector MS

- Cột sắc ký InerSustain C18 (150mm×4,6mm, 5µm) và tiền cột

- Cột SPE – Si

- Cân phân tích Metter Toledo (thang đọc tới 0,1mg và 0,01mg)

- Cân kỹ thuật XT1200c chính xác 0,01g

- Máy cô quay chân không (Eyala)

- Bộ chiết pha rắn (Sulpelco)

- Bộ thổi khô (OA-Sys)

- Máy lắc ngang IKA MLBN001

- Máy rung siêu âm

- Dụng cụ thủy tinh: Phễu chiết 500mL, bình định mức 1000 mL, cốc có mỏ, ống đong 100mL, ống nghiệm thủy tinh có nắp 6mL, bình nón 250mL và 100mL, bình cô quay 100mL và 250mL, bình nút mài 500mL, vial loại 1,8mL có nắp đậy

- Phễu, giấy lọc, màng lọc cỡ 0,45µm

- Pipet 1, 2, 5, 10, 50mL; pipet pasteur, micropipet 20 -200µL, 100-1000µL

và đầu côn tương ứng

- Dung môi loại tinh khiết phân tích: chloroform (Merck)

- Hóa chất tinh khiết phân tích: natri clorua (Trung quốc)

- Nước cất 2 lần: loại tinh khiết phân tích

- Hỗn hợp cloroform:acetone (90:10): Dùng pipet 10mL hút chính xác 10mL acetone vào bình định mức 100mL và định mức tới vạch bằng cloroform

- Hỗn hợp methanol:nước (85:15): 850mL00 methanol vào bình định mức 1000mL, thêm nước vào đến vạch định mức, lắc đều

- Dung dịch muối NaCl 1%: Cân chính xác 10,00g muối natri clorua bằng cân kỹ thuật Thêm một ít nước cất vào để hòa tan trước, chuyển vào bình định mức 1000mL Thêm nước tới vạch, rung siêu âm bằng máy rung siêu âm cho hòa tan hoàn toàn

- Pha động của LC-MS/MS amoniacetat 10mM: Cân 0,77g amoniacetat, hòa tan trong nước cất và định mức thành 1000mL bằng nước cất Lọc qua màng lọc dung môi và rung loại khí

2.2 Đối tượng và nội dung nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lạc nhân đã được làm khô thu hoạch vào khoảng tháng 6 năm 2014 tại tỉnh Bắc Giang

- Bao bì sử dụng đóng gói: bao đay, bao PP

- Khí dùng trong đóng gói: Không khí thường, khí N2

2.2.2 Nội dung nghiên cứu

 Xác định độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin của lạc nhân trước khi bảo quản

- Lạc nhân thu mua tại Bắc Giang được chọn chất lượng đồng đều

- Mẫu lạc ban đầu qua chọn lựa được đem đi kiểm tra độ ẩm và hàm lượng aflatoxin trong lạc với số lượng 10 mẫu lạc nhân lấy ngẫu nhiên từ lô lạc thu về

- Kiểm tra độ ẩm và tình trạng nhiễm aflatoxin

- Mẫu lạc kiểm tra có nhiễm aflatoxin sẽ được loại khỏi thí nghiệm

 Định kỳ đánh giá sự thay đổi độ ẩm và mức độ nhiễm aflatoxin trong các mẫu lạc nhân sau bảo quản bằng các giải pháp

- Mẫu chứng 1 là mẫu lạc nhân ban đầu mua về chưa được lựa chọn, loại tạp

và loại lạc có chất lượng kém đựng trong bao đay

- Mẫu thí nghiệm 1 là mẫu đựng trong bao đay chứa lạc nhân đã được lựa chọn, loại tạp, loại những hạt có chất lượng kém (hạt mốc, hạt lép, hạt nảy mầm, hạt

vỡ, hạt biến màu)

- Mẫu kiểm soát đựng trong bao bì túi PP được đóng trong các điều kiện khác nhau: không khí thường, hút chân không, thay toàn bộ không khí bằng khí nitơ

- Cách thức đóng gói và lấy mẫu kiểm tra:

 Đối với bao đay mỗi loại lạc sẽ được đóng trong bao đay 25kg gập mép, khâu chéo so le; bảo quản mẫu ở điều kiện nhiệt độ thường trong tủ đựng mẫu; mỗi lần lấy mẫu sẽ mở chỗ đường khâu để lấy mẫu tại bên trên bao, ở giữa và đáy bao sau đó lại khâu lại để cho lần kiểm tra sau

 Đối với túi PP có kích thước 20cm×30cm, mỗi túi đóng trong túi 1kg, hàng tháng mỗi lần kiểm tra lấy 3 túi ngẫu nhiên/ 1 mẫu trong số các túi để kiểm tra

- Chỉ tiêu kiểm tra: độ ẩm và hàm lượng aflatoxin

- Thời gian kiểm tra: t0 – thời điểm ngay trước khi bảo quản; t1- bảo quản sau

1 tháng; t2 – bảo quản 2 tháng; t3 – bảo quản 3 tháng; t4 – bảo quản 4 tháng

- Kế hoạch đóng gói với các vật liệu bao gói và môi trường khí quyển của mỗi loại lạc thể hiện trong bảng sau:

Bảng 2.1 Đóng gói lạc với các vật liệu bao gói và môi trường khí quyển thay đổi

Mẫu lạc được mã hoá trong bảng dưới đây:

Bảng 2.2 Mã hóa mẫu lạc nhân trong các điều kiện bảo quản