Bảng 2.3. Phương pháp kiểm nghiệm lạc nhân
TT Chỉ tiêu Phương pháp thử Yêu cầu
kỹ thuật Tài liệu tham chiếu
1 Độ ẩm TCVN 8548:2011 [6] ≤ 10 % QCVN 01 – 48: 2011/BNNPTNT[2] 2 Hàm lượng AFB1 Phương pháp nội bộ của Viện Kiểm nghiệm ATVSTP Quốc gia, thiết bị LC-MS/MS [4, 19] ≤ 8 µg/kg QCVN 8-1:2011/BYT [3] 3 Hàm lượng AF tổng số ≤ 15 µg/kg 2.3.2.1. Độ ẩm
Chuẩn bị mẫu: Cân khoảng 15g hạt lạc được cắt ngang hạt lạc thành những lát có độ dày < 2mm, cho vào bình tam giác có nút đậy kín. Cân chính xác khoảng 5,0000g mẫu vào trong chén cân có nắp rồi sấy khô đã biết trước khối lượng (m1),
xác định khối lượng chén cân và mẫu (m2). Cho mẫu đều lên bề mặt chén cân, mở nắp, sấy ở nhiệt độ 102oC-107oCtrong 5h. Sau đó dùng kẹp gắp chén cân chứa mẫu đậy nắp, làm nguội trong bình hút ẩm trong 30 phút. Cân và ghi khối lượng chính xác đến 0,001g. Tiếp tục sấy mẫu 45 phút, làm nguội cân lần 2 (m3). Sai lệch giữa hai lần cân không quá 0,001g.
Độ ẩm của lạc nhân (X) tính bằng % theo công thức:
𝑿 = 𝒎𝟐 − 𝒎𝟑
𝒎𝟐 − 𝒎𝟏× 𝟏𝟎𝟎
Trong đó:
m1 khối lượng của chén cân (g)
m2 khối lượng của chén cân và mẫu trước khi sấy (g) m3 khối lượng của chén cân và mẫu sau khi sấy (g) 2.3.2.2. Xác định hàm lượng aflatoxin trong lạc nhân
Mẫu lạc nhân được xác định hàm lượng aflatoxin (B1, B2, G1, G2) bằng sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS.
Nguyên lý: Mẫu được chiết bằng cloroform và làm sạch trên cột chiết pha rắn Si. Aflatoxin được tách và định lượng bằng hệ thống sắc ký lỏng khối phổ sử dụng cột pha đảo C18.
Chuẩn bị mẫu phân tích: Mẫu rắn được xay nhỏ, trộn đều: Cân chính xác khoảng 5-10g trên cân phân tích vào bình nón 250mL.
Chiết aflatoxin trong các sản phẩm nhiều chất béo: Thêm 100mL hỗn hợp methanol : nước (85:15) vào mẫu đã được chuẩn bị ở trên, lắc đều. Hỗn hợp được lắc 30 phút, tốc độ 140 vòng/phút trên máy lắc ngang. Sau đó được lọc qua giấy lọc. Lấy 40mL dịch lọc ở trên cho vào phễu chiết 500mL, thêm 40mL dung dịch NaCl 1%, sau đó thêm 25mL n-hexan vào và lắc đều để chiết loại chất béo. Để yên đến khi phân lớp rồi lấy lớp dưới vào phễu chiết khác, lớp phía trên loại bỏ. Lớp dưới được thêm 25mL cloroform vào và lắc đều để chiết aflatoxin, để lắng đến khi phân lớp. Lấy lớp dưới, lớp trên được chiết lặp lại lần 2 với 25mL cloroform. Dịch
của 2 lần chiết được gộp vào bình cất quay 100mL. Sau đó được cô quay bằng máy cô quay chân không ở 40ºC đến cạn, hòa cặn bằng khoảng 10mL dicloromethan
Làm sạch trên cột SPE-Si. Cột được hoạt hóa bằng 3mL n-hexan, 3mL dicloromethan. Mẫu được nạp qua cột với tốc độ 1 – 2mL/phút. Sau đó được rửa rạp với 3mL n-hexan, 3mL diclomethan. Chất phân tích được rửa giải ra bằng 6mL hỗn hợp cloroform – acetone (90:10) vào ống nghiệm thủy tinh.
Dịch rửa giải được thổi khô đến cạn và hòa cặn bằng 1mL methanol và được bơm vào hệ thống LC-MS/MS.
Mẫu kiểm tra (thu hồi, QC): Lặp tương tự các bước như trên nhưng có thêm 50µL-200µL chuẩn aflatoxin (150ng/mL) vào mẫu trước khi chiết mẫu để xác định độ thu hồi và loại bỏ sai số trong quá trình thực hiện thao tác.
Điều kiện chạy máy sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS):
- Cột sắc ký pha đảo InertSustain C18 (150mm x 4,6mm x 5µm) - Pha động: chạy theo chương trình gradient như sau:
Bảng 2.4. Chương trình gradient phân tích aflatoxin
Thời gian( phút) Tỷ lệ % MeOH Tỷlệ % Amoniacetat 10 mM
0,01 5 95 4 100 0 5 100 0 5,01 5 95 10 5 95 - Thể tích bơm mẫu: 10µL. - Tốc độ dòng pha động:0,6mL/phút
- Điều kiện khối phổ: Bảng sau mô tả điều kiện chạy đối với thiết bị MS ABI 5500 QQQ. Các điều kiện khối phổ có thể khác nhau đối với các thiết bị khối phổ khác nhau, cần thực hiện tối ưu điều kiện bằng chất chuẩn aflatoxin
Bảng 2.5. Điều kiện khối phổ thiết bị MS ABI 5500 Triple Quad
Nguồn ion hóa Electrospray (ESI)
Thế ion hóa 4000 KV
Chế độ Ion dương
Nhiệt độ nguồn 300 0C (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khí
Curtain gas: 25 psi Ion source gas 1: 30 psi Ion source gas 2: 10 psi
Năng lượng bắn phá CE = 30 eV Ion chọn lọc AFB1 : 313 →241, CE=41 →269 , CE=37 AFB2 : 315 →259 , CE=35 →287 , CE=43 AFG2 : 331 →245 , CE=39 →285 , CE=33 AFG1 : 329 →243 , CE=47 →215 , CE=41 Tính toán kết quả
Với mẫu dương tính, căn cứ vào sự tương quan giữa diện tích pic và nồng độ, căn cứ vào diện tích pic mẫu tính kết quả theo công thức sau.
X = V x K x Cm/m
Trong đó:V: Thể tích dịch chiết cuối cùng chạy máy HPLC (mL)
Cm: Nồng độ Aflatoxin trongdịch chiết mẫu tính theo chuẩn (ng/mL) m: Khối lượng của mẫu phân tích (g)
X: hàm lượng Aflatoxin trong mẫu phân tích (ng/g) K: Hệ số pha loãng (nếu có)
Chương III. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN