Nghiên cứu một số phản ứng trên nguyên tử nitơ của nuciferin và khảo sát độc tính tế bào của sản phẩm tạo thành

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện DS. Đặng Vũ Thanh Tùng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. HÀ NỘI – 2015

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện DS. Đặng Vũ Thanh Tùng Nơi thực hiện: Bộ môn Công nghiệp Dược Trường Đại học Dược Hà Nội. HÀ NỘI – 2015 LỜI CẢM ƠN Trước hết cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành nhất đến PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện, DS. Đặng Vũ Thanh Tùng những thầy đã trực tiếp hướng dẫn tôi, truyền đạt cho tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình làm khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Văn Hải, ThS. Nguyễn Văn Giang, ThS. Đào Nguyệt Sương Huyền, ThS. Phạm Thị Hiền cùng các thầy giáo, cô giáo, các anh chị kĩ thuật viên của Bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu cùng toàn thể các thầy cô giáo Trường đại học Dược Hà Nội đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập ở trường. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè, đặc biệt là các bạn cùng làm đề tài tốt nghiệp tại phòng Tổng hợp hóa dược - Bộ môn Công nghiệp Dược đã luôn là chỗ dựa vững chắc, là những nguồn động viên to lớn đối với tôi trong cuộc sống, trong học tập và trong công việc. Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên Đoàn Quốc Phương MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2 1.1. Cây Sen 2 1.1.1. Cây sen 2 1.1.2. Chiết xuất alkaloid trong lá sen 3 1.1.3. Phương pháp tách alkaloid dưới dạng tinh khiết 4 1.2. Hợp chất nuciferin. 4 1.2.1. Công thức, tính chất 4 1.2.2. Phương pháp chiết xuất, phân lập, tinh chế nuciferin từ dược liệu 5 1.2.3. Tác dụng dược lý. 5 1.3. Tổng quan về các phương pháp tạo N-oxid 7 1.3.1. Sử dụng tác nhân oxy hóa. 7 1.3.2. Sử dụng tác nhân alkyl halogenid tác dụng với hydroxylamine. 10 1.3.3. Sử dụng phản ứng loại Cope. 10 1.3.4. Phân tích lựa chọn phương pháp tạo N-oxid của nuciferin. 10 1.4. Các phương pháp N-demethyl hóa. 11 1.4.1. Khử hóa N-oxid 11 1.4.2. Sử dụng K 3 Fe(CN) 6 . 12 1.4.3. Sử dụng gốc phthalimide-N-oxyl 12 1.4.4. Sử dụng este cloroformat 13 1.5. Lựa chọn hướng nghiên cứu. 13 CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 2.1. Nguyên vật liệu 14 2.2. Thiết bị và dụng cụ 15 2.3. Nội dung nghiên cứu 16 2.3.1. Chiết nuciferin từ lá sen 16 2.3.2. Thực hiện oxy hóa nuciferin tạo nuciferin N-oxid. 16 2.3.3. Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl. 16 2.3.4. Khử nuciferin N-oxide bằng FeSO 4 .7H 2 O 16 2.3.5. Thử tác dụng sinh học 17 2.4. Phương pháp nghiên cứu 17 2.4.1. Bán tổng hợp dẫn chất của nuciferin 17 2.4.2. Xác định cấu trúc sản phẩm 17 2.4.3. Thử tác dụng sinh học 18 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20 3.1. Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen 20 3.1.1. Quy trình chiết nuciferin 20 3.1.2. Tinh chế nuciferin 20 3.2. Kết quả nghiên cứu các phản ứng trên nguyên tử N của nuciferin 21 3.2.1. Phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid 21 3.2.2. Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl. 24 3.2.3. Khử nuciferin N-oxide bằng FeSO 4 .7H 2 O 25 3.3. Kết quả xác định cấu trúc 26 3.3.1. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng oxy hóa (nuciferin N-oxid) 26 3.3.2. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng khử hóa (nuciferin) 28 3.3.3. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng demethyl hóa (nornuciferin) 29 3.4. Thử tác dụng sinh học 31 3.5. BÀN LUẬN 32 3.5.1. Về quá trình chiết xuất, phân lập và tinh chế nuciferin 32 3.5.2. Về các phản ứng bán tổng hợp. 33 3.6.3. Về phần xác định cấu trúc 35 3.6.4. Về phần thử hoạt tính sinh học 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT 1 H-NMR Phổ cộng hưng từ hạt nhân proton (Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) AcOEt Ethyl acetat AcOH Acid acetic ATCC American Type Culture Collection CTCT Công thức cấu tạo ESI-MS Phổ khối lượng phun m điện tử (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) Et 2 O Diethyl ether EtOH Ethanol Fe(II)TPPS Tetrasodium 5,10,15,20-tetra(4-sulfophenyl) porphyrinatoiron(II) g Gam h Giờ HIV Virus gây suy giảm miễn dịch  người (Human immunodeficiency virus) IC 50 Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử (Inhibition concentration at 50%) i-PrOH Isopropanol IR Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy) IUPAC Hiệp hội Hóa học Quốc tế thuần túy và ứng dụng (International Union of Pure and Applied Chemistry) m-CPBA acid m-cloroperbenzoic (m-chloroperbenzoic acid) MeCN Acetonitril MeOH Methanol MTO Methyltrioxorheni MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid NaOMe Natri methanolat NPB Natri perborate tetrahydrat NPC Natri percarbonat RANKL Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand R f Hệ số lưu giữ (retension factor) SKLM Sắc ký lớp mỏng TBHP tert-butyl hydroperoxid t-BuOH tert-butanol t o nc Nhiệt độ nóng chảy UHP Ure hydroperoxid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Một số alkaloid trong lá sen………………………………………… 3 Bảng 2.1. Các hóa chất, dung môi sử dụng trong quá trình thực nghiệm 14 Bảng 2.2. Các máy móc, dụng cụ sử dụng trong quá trình thực nghiệm………… 15 Bảng 3.1. Khảo sát nhiệt độ ảnh hưng đến thời gian phản ứng phản ứng bán tổng hợp nuciferin N-oxid ………………………… 21 Bảng 3.2. Khảo sát dung môi ảnh hưng đến thời gian phản ứng phản ứng bán tổng hợp nuciferin N-oxid…………………………………………… 22 Bảng 3.3. Khảo sát tỉ lệ mol H 2 O 2 :nuciferin ảnh hưng đến thời gian phản ứng bán tổng hợp nuciferin N-oxid …………………………… 22 Bảng 3.4. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nuciferin N-oxid ….………… 26 Bảng 3.5. Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin N- oxid ………………………………………………………………… 27 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân proton của nuciferin N-oxid ( 1 H-NMR, 500MHz, CDCl 3 )………………………………… 27 Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin 28 Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân proton của nuciferin ( 1 H-NMR, 500MHz CDCl 3 )………… …………………………… 28 Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân carbon 13 của nuciferin ( 13 C-NMR, 125MHz, CDCl 3 )………………………………. 29 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR, KBr) của nornuciferin……… 30 Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin… 30 Bảng 3.12. Kết quả phân tích phổ cộng hưng từ hạt nhân proton của nornuciferin ( 1 H-NMR, 500MHz, CDCl 3 )……………………………. 31 Bảng 3.13 Kết quả thử gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư MCF7 và LU.… 31 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cây sen (Nelumbo nucifera Gaertn.)…………………………………… 2 Hình 1.2. Công thức cấu tạo của nuciferin …………… ……………………… 4 Hình 1.3. Công thức cấu tạo nhân aporphin ……………………………………… 6 Hình 1.4. Sơ đồ phản ứng tạo codein N-oxid bằng cách sử dụng H 2 O 2 30% 8 Hình 1.5. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng m-CPBA……………… 8 Hình 1.6: Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPB………………… 8 Hình 1.7: Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng UHP………………… 9 Hình 1.8. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng NPC………………… 9 Hình 1.9. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng ozon………………… 9 Hình 1.10. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng alkyl halogenid……… 10 Hình 1.11. Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng phản ứng loại Cope……………… 10 Hình 1.12. Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid bằng H 2 O 2………………………………… 11 Hình 1.13. Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng FeSO 4 .7H 2 O 11 Hình 1.14. Sơ đồ khử hóa N-oxid bằng Fe(II)TPPS)…………………………… 12 Hình 1.15. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng CuCl… ……………………. 12 Hình 1.16. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng K 3 Fe(CN) 6 ……………… 12 Hình 1.17. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng gốc phthalimide-N-oxyl…… 13 Hình 1.18. Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng ester cloroformat………… 13 Hình 1.19. Sơ đồ định hướng tổng hợp dẫn chất N-demethyl hóa của nuciferin hướng chống ung thư……………………………………………………………… 13 Hình 3.1. Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid sử dụng H 2 O 2 30% 21 Hình 3.2. Sơ đồ đề xuất phản ứng oxy hóa nuciferin bằng H 2 O 2 30% 23 [...]... liệu nuciferin sẵn có và dễ tách chiết với hiệu suất cao, việc bán tổng hợp các dẫn chất của nuciferin đang là một hướng phát triển để tìm ra các hoạt chất mới có tác dụng chữa bệnh, đặc biệt là bệnh ung thư Đề tài Nghiên cứu một số phản ứng trên nguyên tử nitơ của nuciferin và khảo sát độc tính tế bào của sản phẩm tạo thành được thực hiện với các mục tiêu sau: 1 Tạo dẫn chất N-oxid, khử hóa N-oxid tạo. .. Quan sát bản mỏng dưởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin Rf=0,78 21 3.2 Kết quả nghiên cứu các phản ứng trên nguyên tử N của nuciferin 3.2.1 Phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid Sơ đồ phản ứng: - Hình 3.1 Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid sử dụng H2O2 30% Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,30 g, 1,02 mmol), dung môi (15 ml), H2O2 30%, bình cầu 1 cổ 50 ml, khuấy từ, và. .. Phản ứng được đưa lên nhiệt độ 50oC trong 5 ngày Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được sản phẩm N-oxid với hiệu suất 15% (xem Hình 1.10) [33] Hình 1.10 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng cách sử dụng alkyl halogenid 1.3.3 Sử dụng phản ứng loại Cope Hình 1.11 Sơ đồ phản ứng tạo N-oxid bằng phản ứng loại Cope Điều kiện phản ứng: Hòa tan 1,(2S)-oxiranyl-prop-2-en-(1R)-ol trong MeOH, thêm N-benzylhydroxylamin.HCl và. .. 7-hydroxydehydronuciferin và 7 cepharadion B và thử tác dụng đối với Anisakis simplex và Hymenolepis nana Nghiên cứu này cho thấy rằng các thành phần trên giết hoặc giảm sự chuyển động chủ động của H nana [21] - Tác dụng chống sốt rét và kháng nấm của một số alkaloid được chiết được từ lá sen đã được thử nghiệm Kết quả cho thấy trong số các alkaloid đã được thử nghiệm thì một vài alkaloid có tác dụng chống sốt... xét: Nhiệt độ cao làm giảm thời gian phản ứng  Khảo sát dung môi phản ứng ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid Các dung môi được khảo sát là MeOH, EtOH, i-prOH Sử dụng tác nhân H2O2 30% với thể tích 0,25 ml (2,45 mmol) Kết quả được thể hiện trên Bảng 3.2 Bảng 3.2 Khảo sát dung môi ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid STT Nguyên liệu (g) Nhiệt độ Thời gian... mỏng dưởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin N-oxid Rf = 0,21 Kết luận: Sau khi phân tích sản phẩm bằng phổ IR, phổ MS và phổ 1H-NMR chúng tôi chứng minh được sản phẩm là nuciferin N-oxid 3.2.2 Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl - Nguyên lý phản ứng: Hình 3.3 Sơ đồ khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl - Chuẩn bị phản ứng: Nuciferin N-oxid (0,1 g, 0,32... -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác 2.4.3.2 Các dòng tế bào Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú 19 2.4.3.3 Phương pháp thử độc tế bào Thử độ độc tế bào bằng phương pháp MTT... xương trong các tế bào đại thực bào tủy xương chuột Ngoài ra, nuciferin tăng sinh tế bào ức chế và apoptosis cảm ứng trong tế bào MDA-MB-231 ung thư vú ở người Hơn nữa, nuciferin có thể điều chỉnh phân phối chu kỳ tế bào và biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình apoptosis trong tế bào MDA-MB-231 và ức chế ung thư vú từ đó ức chế sự tiêu xương trong cơ thể Vì vậy, nuciferin có thể có tiềm năng... pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính Thử độc tế bào: Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml Bổ sung 200 l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào MCF-7; môi trường DMEM cho LU Giếng điều khiển có 200 l dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ ml Ủ ở 37oC / 5% CO2 Sau... lưu trong 24h Xử lý hỗn hợp phản ứng thu được normorphin với hiệu suất 43,5% (xem Hình 1.18) [10] Hình 1.18 Sơ đồ phản ứng N-demethyl hóa bằng este cloroformat 1.5 Lựa chọn hướng nghiên cứu - Với một số hoạt tính đã được nghiên cứu của các amin N-oxid như tác dụng chống ung thư [17], kháng khuẩn [34], ức chế cytochrome P450 [35] Vì vậy chúng tôi oxy hóa nuciferin tạo thành nuciferin N-oxid - Tổng hợp . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH KHÓA. 2015 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐOÀN QUỐC PHƯƠNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ PHẢN ỨNG TRÊN NGUYÊN TỬ NITƠ CỦA NUCIFERIN VÀ KHẢO SÁT ĐỘC TÍNH TẾ BÀO CỦA SẢN PHẨM TẠO THÀNH KHÓA. nitơ của nuciferin và khảo sát độc tính tế bào của sản phẩm tạo thành được thực hiện với các mục tiêu sau: 1. Tạo dẫn chất N-oxid, khử hóa N-oxid tạo N-demethyl nuciferin (nornuciferin). 2.