Cấu trúc của các dẫn chất tổng hợp được được xác định bằng các phương pháp phổ: Phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân tử (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR).
- Phổ hồng ngoại (IR)
Được ghi tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, trên máy Perkin Elmer với kỹ thuật viên nén KBr
trong vùng 4000-400cm-1. Mẫu rắn được phân tán trong KBr đã sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200 rồi ép dưới dạng viên nén dưới áp lực cao có hút chân không để loại bỏ hơi ẩm.
- Phổ khối lượng phân tử (MS):
Được ghi theo phương pháp ESI tại Phòng Phân tích cấu trúc phân tử - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và khoa Hóa học – Trường Đại học Quốc gia Hà Nội trên máy LC/MSD Trap - SL và máy LC/MS/MS-Xevo TQ.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H - NMR):
Được ghi tại Phòng Phân tích phổ - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và khoa Hóa học – Trường Đại học Quốc gia Hà Nội trên máy Brucker AV-500MHz, sử dụng dung môi là CDCl3 với chất chuẩn nội là tetramethylsilan.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 (13C-NMR)
Được ghi tại khoa Hóa học – Trường Đại học Quốc gia Hà Nội trên máy Brucker AV-500MHz, sử dụng dung môi là CDCl3 với chất chuẩn nội là tetramethylsilan.
2.4.3. Thử tác dụng sinh học
Thử tác dụng chống ung thư: chống ung thư phổi và chống ung thư vú. Thử độ độc tế bào bằng phương pháp MTT nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
2.4.3.1. Thiết bị nghiên cứu
Tủ ấm CO2 (INNOVA CO-170); Tủ cấy sinh học an toàn cấp II; Máy li tâm (Universal 320R); Kính hiển vi ngược (Zeizz); Tủ lạnh sâu -250C,-800C; Buồng đếm tế bào (Fisher, Hoa kỳ); Máy quang phổ (Genios Tecan); Bình nitơ lỏng bảo quản tế bào và các dụng cụ thí nghiệm thông thường khác.
2.4.3.2. Các dòng tế bào
Các dòng tế bào ung thư ở người được cung cấp bởi ATCC gồm: LU (Human lung carcinoma) - ung thư phổi và MCF-7 (Human breast carcinoma) - ung thư vú.
2.4.3.3. Phương pháp thử độc tế bào
Thử độ độc tế bào bằng phương pháp MTT nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro.
Các dòng tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp có bổ sung thêm 10% huyết thanh phôi bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện tiêu chuẩn (5% CO2; 37oC; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc vào đặc tính của từng dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau. Tế bào phát triển ở pha log sẽ được sử dụng để thử độc tính.
Thử độc tế bào: Mẫu thử được pha loãng theo dãy nồng độ là 128 g/ml; 32 g/ml; 8 g/ml; 2 g/ml; 0,5 g/ml. Bổ sung 200 l dung dịch tế bào ở pha log nồng độ 3 x 104 tế bào/ml vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào MCF-7; môi trường DMEM cho LU. Giếng điều khiển có 200 l dung dịch tế bào 3x104 tế bào/ml. Ủ ở 37oC / 5% CO2. Sau 3 ngày thêm 50 l MTT (1mg/ml pha trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh) và ủ tiếp ở 37oC /4 giờ; loại bỏ môi trường, thêm 100 l DMSO lắc đều đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios TECAN.
Phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào (Growth inhibition) % kìm hãm = OD điều khiển – OD mẫu
OD điều khiển × 100%
Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả số liệu phần trăm kìm hãm sự phát triển của tế bào bằng phần mềm máy tính table curve.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Chiết, phân lập và tinh chế nuciferin từ lá sen
3.1.1. Quy trình chiết nuciferin
- Nguyên liệu: 10,0 kg lá sen được xay nhỏ thành bột. Chia làm 2 mẻ.
- Quy trình: Bột lá sen được làm ẩm bằng nước vôi trong (ủ trong 24h để thấm đều dược liệu), sau đó chiết nóng bằng dầu hỏa: 1 kg bột lá sen với 6 lít dầu hỏa ở nhiệt độ khoảng 100oC trong 2h. Dịch chiết dầu hỏa được lắc với 0,5 lít acid H2SO4 0,3%. Sau đó gạn lấy lớp dầu đổ lại vào chiết tiếp bã lá sen vừa rồi trong 1,5h. sau đó lại gạn lấy lớp dầu và chiết bằng 0,5 lít acid H2SO4 0,3%. Như vậy cứ 1 kg lá sen sẽ sử dụng 6 lít dầu hỏa và 1 lít H2SO4 0,3% (chiết 2 lần). Gộp dịch acid thu được, kiềm hóa dịch acid bằng dung dịch Na2CO3 bão hòa cho đến pH=10, lọc thu được tủa alkaloid toàn phần, sấy khô ở 70oC.
- Kết quả: Khối lượng alkaloid toàn phần thu được từ 5,0 kg lá sen là 31,0 g (0,62%).
3.1.2. Tinh chế nuciferin
- Sử dụng phương pháp kết tinh lại trong aceton.
- Cứ 10g alkaloid toàn phần hòa tan nóng hoàn toàn vào 250 ml aceton. Tẩy màu bằng than hoạt (đun nóng, khuấy trong vong 10 phút), để lạnh cho kết tinh sau 24h thu được 4,3 g nuciferin.
- Kết quả
Khối lượng nuciferin thu được khi chiết 10,0 kg lá sen: mnuciferin=25,0 g. Đo tonc: 165-166oC.
Cảm quan: chất rắn màu trắng ánh xanh.
SKLM (triển khai bản mỏng bằng hệ dung môi CHCl3 : MeOH = 9 : 1): Quan sát bản mỏng dưởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin. Rf=0,78.
3.2. Kết quả nghiên cứu các phản ứng trên nguyên tử N của nuciferin
3.2.1. Phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid
- Sơ đồ phản ứng:
Hình 3.1. Sơ đồ phản ứng tạo nuciferin N-oxid sử dụng H2O2 30%
Chuẩn bị phản ứng: Cho nuciferin (0,30 g, 1,02 mmol), dung môi (15 ml), H2O2 30%, bình cầu 1 cổ 50 ml, khuấy từ, và sinh hàn hồi lưu.
Tiến hành phản ứng: Cho vào bình cầu 1 cổ (50 ml) 15 ml dung môi thêm vào 0,3 g nuciferin. Thêm thể tích H2O2 thích hợp. Đun phản ứng ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thích hợp. Theo dõi phản ứng bằng SKLM.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Dịch được chiết bằng CHCl3. Chiết 3 lần lấy lớp dịch CHCl3. Sau đó rửa lại bằng nước cất đến pH=7. Dịch làm khan bằng Na2SO4 và cất dưới áp suất giảm đến kiệt dung môi.
- Các khảo sát chúng tôi đã thực hiện:
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản đến hiệu suất phản ứng tạo nuciferin
N-oxid.
Chúng tôi khảo sát ở nhiệt độ 25oC, 50oC, 65oC. Sử dụng dung môi MeOH, tác nhân H2O2 30% với thể tích 0,25 ml (2,45 mmol). Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid STT Nguyên liệu (g) Nhiệt độ (oC) Dung môi Thời gian (h) Hiệu suất (%) 1 0,3 25 MeOH 12 63,2 2 0,3 50 MeOH 6 79 3 0,3 65 MeOH 4 88,5
Nhận xét: Nhiệt độ cao làm giảm thời gian phản ứng.
Khảo sát dung môi phản ứng ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp nuciferin
N-oxid
Các dung môi được khảo sát là MeOH, EtOH, i-prOH. Sử dụng tác nhân H2O2 30% với thể tích 0,25 ml (2,45 mmol). Kết quả được thể hiện trên Bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khảo sát dung môi ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid
STT Nguyên liệu (g)
Dung môi Nhiệt độ (oC)
Thời gian (h)
Hiệu suất (%)
1 0,3 MeOH Hồi lưu 4 88,5
2 0,3 EtOH Hồi lưu 3,5 90,1
3 0,3 i-PrOH Hồi lưu 2,5 91,7
Nhận xét: với dung môi i-PrOH giảm thời gian phản ứng
Khảo sát tỉ lệ mol H2O2:nuciferin ảnh hưởng đến thời gian phản ứng.
Chúng tôi sử dụng nuciferin (0,30 g, 1,02 mmol), tác nhân H2O2 30% với thể tích 0,25 ml (2,45 mmol); 3 ml (7,35 mmol); 7 ml (17,15 mmol). Nhiệt độ hồi lưu. Chúng tôi sử dụng dung môi i-PrOH do trong khảo sát sử dụng dung môi (Bảng 3.2) chúng tôi thấysử dụng i-PrOH cho thời gian phản ứng ngắn nhất và hiệu suất cao nhất. Kết quả khảo sát được thể hiện trên Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Khảo sát tỉ lệ mol H2O2:nuciferin ảnh hưởng đến thời gian phản ứng tổng hợp nuciferin N-oxid STT Nguyên liệu (g) Tỉ lệ mol H2O2:nuciferin Dung môi Thời gian (h) Hiệu suất (%) 1 0,3 2,45 i-PrOH 2,5 91,7 2 0,3 7,35 i-PrOH 2,25 91,7 3 0,3 17,15 i-PrOH 2 91,7
- Đề xuất quy trình:
Chuẩn bị phản ứng: nuciferin (0,3 g; 1,02 ml), i-PrOH (15 ml), H2O2 30% (0,25 ml; 2,45 mmol) vào bình cầu 1 cổ 50 ml, khuấy từ, và sinh hàn hồi lưu.
Tiến hành phản ứng: Cân 0,3 g nuciferin hòa tan trong 15 ml i-PrOH trong bình cầu 1 cổ 50 ml. Thêm 0,25 ml H2O2 30%. Đun phản ứng ổn định phản ứng nhiệt ở độ 82oC. Đun phản ứng ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian 2,5h. Theo dõi phản ứng bằng SKLM.
Xử lý hỗn hợp phản ứng: Dịch được chiết bằng CHCl3. Chiết 3 lần lấy lớp dịch CHCl3. Sau đó rửa lại bằng nước cất đến pH=7. Dịch làm khan bằng Na2SO4 và cất dưới áp suất giảm đến kiệt dung môi.
- Kết quả:
Cảm quan: chất lỏng màu xanh.
Khối lượng: m=0,29 g (hiệu suất 91,7%).
SKLM (triển khai với hệ dung môi CHCl3:MeOH=9:1) Quan sát bản mỏng dưởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin N-oxid. Rf = 0,21.
Kết luận: Sau khi phân tích sản phẩm bằng phổ IR, phổ MS và phổ 1H-NMR chúng tôi chứng minh được sản phẩm là nuciferin N-oxid.
3.2.2. Khử hóa nuciferin N-oxid bằng kẽm trong HCl.
- Nguyên lý phản ứng:
- Chuẩn bị phản ứng: Nuciferin N-oxid (0,1 g, 0,32 mmol) , MeOH (5 ml), Zn bột (0,05 g; 0,76 mmol), HCl 5,6M (0,5 ml), bình cầu 1 cổ 50ml, bếp có khuấy từ. - Tiến hành phản ứng: Hòa tan 0,1 g nuciferin N-oxid trong 5 ml MeOH vào bình cầu 50 ml, acid hóa bằng 1 ml HCl 5,6M. Thêm Zn bột, khuấy trong 24h.
- Xử lý hỗn hợp phản ứng: thêm Na2CO3 bảo hòa khuấy trong 20 phút. Chiết hỗn hợp thu đươc với CHCl3. Cất quay đến cắn. Hoà tan cắn trong 100ml aceton nóng, tẩy màu bằng than hoạt. Bốc hơi bớt dung môi. Để kết tinh lạnh ở 0oC thu được tủa. Lọc lấy tủa, đem sấy ở 70oC. Cân sản phẩm.
- Kết quả:
Cảm quan: chất rắn màu trắng.
Khối lượng: m=0.09 g (hiệu suất 95%). Đo tonc: 164-165oC.
SKLM (triển khai với hệ dung môi CHCl3:MeOH=9:1): Quan sát bản mỏng dưởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nuciferin Rf = 0,78.
Kết luận: Sau khi phân tích sản phẩm bằng phổ MS, phổ 1H-NMR, phổ 13C- NMR chúng tôi chứng minh được sản phẩm là nuciferin.
3.2.3. Khử nuciferin N-oxide bằng FeSO4.7H2O
- Sơ đồ phản ứng:
- Chuẩn bị phản ứng: nuciferin N-oxid (0,1 g; 0,32 mmol) thêm MeOH (5 ml), bình cầu 1 cổ 50 ml, khuấy từ. FeSO4.7H2O (0,1 g; 0,35mmol).
- Tiến hành phản ứng: Hòa tan 0,1 g nuciferin N-oxid trong 5 ml MeOH vào bình cầu 50 ml, thêm FeSO4.7H2O vào bình cầu ở nhiệt độ 0oC. Sau đó hỗn hợp được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 12h. Theo dõi phản ứng bằng SKLM.
- Xử lý hỗn hợp sau phản ứng: Hỗn hợp được acid hóa đến pH=1 bằng HCl 1N. Loại tạp hữu cơ bằng chiết dịch thu được bằng CHCl3. Pha nước được trung hòa bằng Na2CO3 đến pH=8. Sau đó chiết bằng CHCl3. Dịch CHCl3 được rửa nước đến pH=7, làm khan bằng Na2SO4. Cất quay đến cắn. Sử dụng 5 ml CHCl3 hòa tan. Sử dụng sắc ký điều chế tách sản phẩm từ dịch CHCl3.
- Sắc ký điều chế tách sản phẩm được tiến hành như sau: Chấm dung dịch sau xử lý phản ứng chứa 2 hoặc 3 vết lên những bản mỏng có kích thước 20 x 20 cm được tráng chất hấp phụ là silica gel G (Merck), đã hoạt hóa ở 110o C trong 1 giờ ( một bản mỏng cho một phản ứng với 0,1 g nguyên liệu). Hệ dung môi khai triển là CHCl3 : MeOH=9 : 1. Bản mỏng để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó soi dưới “đèn soi UV sắc kí CN6” đánh dấu vùng chứa sản phẩm. Cạo lấy silica gel chứa chất cần tách, phản hấp phụ bằng MeOH và lọc lấy dịch. Bốc hơi hết dung môi thu được sản phẩm cần tổng hợp.
- Kết quả:
Dịch trước sắc ký điều chế: thử độ tinh khiết bằng SKLM (triển khai hệ dung môi CHCl3:MeOH=9:1) , dịch mẫu là chất (dịch thử là dịch xử lý của phản ứng trước sắc ký điều chế), soi dưới đèn tử ngoại thu được 2 vết.
- Vết 1 là nuciferin N-oxid, Rf= 0,21. - Vết 2 là nornuciferin, Rf= 0,29. Sau sắc ký điều chế:
- Thu được 0,01g chất nornuciferin, hiệu suất 10,5%.
- Kiểm nghiệm bằng SKLM (triển khai hệ dung môi CHCl3:MeOH=9:1) Quan sát bản mỏng dưởi đèn tử ngoại thấy trên bản mỏng có một vết duy nhất là nornuciferin Rf= 0,29.
Kết luận: Sau khi phân tích sản phẩm bằng phổ IR, phổ MS, phổ 1H-NMR chúng tôi chứng minh được sản phẩm là nornuciferin.
3.3. Kết quả xác định cấu trúc
Cấu trúc của sản phẩm bán tổng hợp được khẳng định bởi các phương pháp phổ: IR, MS và NMR.
3.3.1. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng oxy hóa (nuciferin N-oxid)
Bảng 3.4 dẫn ra kết quả phân tích phổ hồng ngoại (phụ lục 1), Bảng 3.5 dẫn ra kết quả phân tích phổ khối lượng (phụ lục 2), Bảng 3.6 dẫn ra kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (phụ lục 3,4,5) của nuciferin N-oxid đã tổng hợp từ nuciferin.
Bảng 3.4.Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) của nuciferin N-oxid
Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-1) =C-H (thơm) 3043 -C-H (no) 2965 C=C (thơm) 1634, 1578, 1527, 1457 C-O-C 1219 C-N+ 1104
Bảng 3.5.Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin N- oxid
Nuciferin N-oxid
Khối lượng phân tử (đvC) Khối lượng chính xác (đvC) m/z 311,37 311,15 312,20 [M+H]+)
Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của nuciferin N-oxid (1H-NMR, 500MHz, CDCl3) Nuciferin N-oxid Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm), dạng tín hiệu, vị trí hydro Dạng proton 3,11 (2H, br. s, H-4) Ar-CH2- 3,41 (2H, br. s, H-7) Ar-CH2- 3,70 (1H, m, H-5β) N+-CH2- 3,65 (3H, s, H-3’) N-CH3 3,83 (3H, s, H-2’) O-CH3 3,85 (3H, s, H-1’) O-CH3 4,20 (1H, m, H-5α) N+-CH2- 4,40 (1H, m, H-6a) N+-CH- 6,64 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,27 (3H, m, H-8, H-9, H-10) =CH thơm 8,27 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-11) =CH thơm
3.3.2. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng khử hóa (nuciferin)
Bảng 3.7 dẫn ra kết quả phân tích phổ khối lượng (phụ lục 6 ), Bảng 3.8 dẫn ra kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (phụ lục 7,8,9), Bảng 3.9 dẫn ra kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 của nuciferin (phụ lục 10,11) đã tổng hợp từ phản ứng khử hóa nuciferin N-oxid bằng Zn/HCl.
Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ khối lượng (ESI-MS, MeOH) của nuciferin
Nuciferin
Khối lượng phân tử (đvC) Khối lượng chính xác (đvC) m/z 295,38 295,16 296,23 ([M+H]+)
Bảng 3.8.Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton của nuciferin (1H-NMR, 500MHz, CDCl3)
Nuciferin
Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm), dạng
tín hiệu, vị trí hydro Dạng proton
2,42 (1H, m, H-4β) Ar-CH2 2,45 (3H, s, H-3’) N-CH3 2,56 (2H, 2 d, J = 13,5 Hz, H-6a, H-7β) Ar-CH2- 2,95 (2H, m, H-5) N-CH2- 3,10 (2H, m, H-7α, H-4α) Ar-CH2- và N-CH- 3,58 (3H, s, H-2’) O-CH3 3,80 (3H, s, H-1’) O-CH3 6,55 (1H, s, H-3) =CH thơm 7,13-7,24 (3H, m, H-8, H-9, H-10) =CH thơm 8,28 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-11) =CH thơm
Ghi chú: s - singlet, br. s - singlet tù, d - doublet, m - multiplet, Ar - nhân thơm.
Bảng 3.9Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 của nuciferin (13C-NMR, 125MHz, CDCl3) Nuciferin Độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm), vị trí carbon 145,16 (C-1) 60,24 (C-1’) 126,9 (C-1a) 128,05 (C-1b) 151,99 (C-2) 55,87 (C-2’) 111,29 (C-3) 128,75 (C-3a) 44,04 (C-3’) 29,28 (C-4) 53,32 (C-5) 62,37 (C-6a) 35,17 (C-7) 136,51 (C-7a) 128,34 (C-8) 127,32 (C-9) 127,00 (C-10) 127,87 (C-11) 132,17 (C-11a)
3.3.3. Xác định cấu trúc sản phẩm phản ứng demethyl hóa (nornuciferin)
Bảng 3.10 dẫn ra kết quả phân tích phổ hồng ngoại (phụ lục 12), Bảng 3.11
tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (phụ lục 14,15,16) của nornuciferin đã tổng hợp từ khử nuciferin N-oxide bằng FeSO4.7H2O
Bảng 3.10 Kết quả phân tích phổ hồng ngoại của nornuciferin (IR, KBr)
Nornuciferin Nhóm chức Đỉnh hấp thụ đặc trưng (ῡ, cm-1) N-H 3461 =C-H (thơm) 3090