Nghiên cứu một số phản ứng chuyển hóa với hợp chất ent-kauran diterpenoid phân lập

Nghiên cứu một số phản ứng chuyển hóa với hợp chất ent-kauran diterpenoid phân lập

MỞ ĐẦU

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, gió mùa nên có hệ thực vật rất phongphú và đa dạng với hơn 12.000 loài, bao gồm hơn 300 họ và 1.200 chi Nguồn thực vậtphong phú này đã cung cấp cho con người nhiều sản phẩm thiên nhiên có giá trị Cácsản phẩm thiên nhiên có hoạt tính sinh học có ứng dụng rất lớn trong nhiều lĩnh vựckhác nhau của cuộc sống, đặc biệt dùng làm thuốc chữa bệnh Các loại thuốc thảo mộcít gây tác dụng phụ và ít độc hại cho người sử dụng Chúng được dùng như tác nhânđiều trị trực tiếp, làm chất dò sinh hoá để làm sáng tỏ nguyên lí dược học hoặc làm chấtchuẩn để phát triển các loại thuốc mới Chính vì vậy việc nghiên cứu hoá học cũng nhưhoạt tính sinh học của các loài cây thuốc có ý nghĩa quan trọng cho việc sử dụng mộtcách hợp lý và có hiệu quản nhất nguồn tài nguyên thiên nhiên này.

Chi Croton là một chi lớn thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) và được quan tâmnghiên cứu trên thế giới Chính vì hoạt tính lý thú của các ent-kauran diterpenoid từcây khổ sâm Bắc Bộ Croton tonkinensis (Euphorbiaceae) mà luận văn này có các

3 Tiến hành thử hoạt tính sinh học với các sản phẩm chuyển hóa nhận được.

Chương 1TỔNG QUAN

1.1 Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep.)

1.1.1 Thực vật học [1, 2]

Cây khổ sâm Bắc Bộ có tên khoa học là Croton tonkinensis Gagnep thuộc họ

Thầu dầu (Euphorbiaceae).

Hình 1: Cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)

Khổ sâm Bắc Bộ là cây nhỏ, cao độ 0,7-1 m Lá mọc cách hay gần như mọc đối,có khi mọc thành vòng giả gồm 3-6 lá Lá hình mũi mác, mép nguyên dài 5-10 cm,rộng 1-3 cm Cả hai mặt lá đều có lông hình khiên óng ánh (kiểu lông ở lá cây nhót)nhưng mặt dưới nhiều hơn ở mặt trên Khi phơi khô mặt lá ở dưới có màu trắng bạc,mặt trên có màu nâu đen Cụm hoa mọc ở kẽ lá hay đầu cành, lưỡng tính hay đơn tính.

Hoa đực có 5 lá đài,12 nhị Hoa cái có 5 lá đài, 3 vòi nhị Quả gồm 3 mảnh vỏ màuhung đỏ.

1.1.2 Nơi sống và thu hái [1]

Cây khổ sâm Bắc Bộ mọc hoang và được trồng ở khắp nơi, trong các vườn giađình hoặc vườn thuốc, chủ yếu ở các tỉnh phía bắc Việt Nam Thường trồng bằng gieohạt hay trồng bằng cành vào mùa xuân Thu hái khi cây đang có hoa, đem phơi hoặcsấy khô, khi dùng đem sao vàng.

1.1.3 Hoạt tính và công dụng của cây khổ sâm Bắc bộ [1, 2]

Cây khổ sâm Bắc Bộ được dùng trong dân gian làm thuốc chữa mụn nhọt, lởngứa, viêm mũi, lỵ, đau bụng, viêm loét dạ dày, tá tràng, tiêu hoá kém Ngày dùng15-20 lá sao vàng, dạng thuốc sắc, dụng ngoài lấy nước sắc đặc để rửa Gần đây, câykhổ sâm Bắc Bộ được chú ý nhiều do lá cây dùng trong đơn thuốc chữa bệnh đau dạ

dày kết hợp với các vị thuốc khác (lá bồ công anh Lactuca indica và lá khôi Ardisiasylvestris) hoặc dùng riêng dưới dạng nước sắc

Nước sắc khổ sâm Bắc Bộ trong thực nghiệm có tác dụng kháng một số nấmngoài da Khổ sâm Bắc Bộ có tác dụng kháng sinh đối với trực khuẩn lỵ đồng thời cótác dụng kháng lỵ amip, làm cho đơn bào co thành kén Tác dụng đối với ký sinh trùngsốt rét: nước sắc của bài thuốc gồm Khổ sâm và vỏ Bưởi có tác dụng ức chế ký sinhtrùng sốt rét mạnh trên động vật thí nghiệm được gây nhiễm sốt rét, nhưng tái pháttrong thời gian 10 ngày theo dõi trên mô hình thực nghiệm chuột nhắt nhiễm

Plasmodium berghei và gà nhiễm Plasmodium gallinaceum.

1.1.4 Các ent-kauran diterpenoid của cây khổ sâm Bắc bộ

Năm 2000, Phan Tống Sơn và cộng sự đã công bố quốc tế một diterpen mới từlá cây khổ sâm Bằng các phương pháp phổ đã xác định cấu trúc của diterpen này là

ent-7β-hydroxy-15-oxo kaur-16-en-18-yl axetat (1) [5, 33] Chất này có hoạt tính

kháng kí sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum in vitro Nhóm tác giả trên tiếp tụcđánh giá hoạt tính của diterpen với ký sinh trùng sốt rét Plasmodium falciparum (với cả

chủng nhạy và chủng kháng cloroquin) tác dụng gây độc đối với một số tế bào ung thư(Hep-G2, RD, FI, VR), tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật kiểm định [7].

Trong nghiên cứu tiếp theo của Phan Minh Giang và cộng sự [19] bốn

ent-kaurane diterpen gồm hai chất đã biết, ent-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (2) vàent-18-acetoxy-7α-hydroxykaur-16-en-5-one (3) và hai chất mới, ent-1β-acetoxy-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (4) và ent-18-acetoxy-7α,14β-dihydroxykaur-16-en-15-one (5) đã được phân lập từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ Các ent-kauranoid này ức chế

nhân tố phiên mã NF-ĸB và sự sản xuất NO được hoạt hoá bằng LPS trong đại thựcbào RAW264.7 của chuột ở IC50 = 0,07 - 0,42 µg/ml

Tiếp đó, Phan Minh Giang và cộng sự đã công bố cấu trúc của 4 ent-kauran

diterpen mới, ent-1α,14α-diacetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one (7), diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-one (8), ent-18-acetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-one (9) và ent-(16S)-18-acetoxy-7β-hydroxy kauran-16-en-15-one (10) [20].

10

Năm 2005, có 6 ent-kauran diterpenoid mới được phân lập từ lá cây khổ sâm Bắc

Bộ đó là các chất ent-7β -acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (11), acetoxy-11α-hydroxykaur-16-en-15-one (12), ent-11α-acetoxykaur-16-en-18-oic acid(13), ent-15α,18-dihydroxykaur-16-ene (14), ent-11α,18-diacetoxy-7β -hydroxykaur-

ent-18-R1 R2 R3 R4

16-en-15-one (15), and ent-(16S)-1α,14a-diacetoxy-7β

-hydroxy-17-methoxykauran-15-one (16) [21].

Ba diterpenoid với cấu trúc ent-kaur-16-ene, en-11α-acetoxy-7β, 14α

dihydroxykaur-16-15-one (17), ent-18–hydroxykaur-16-ene (18) và ent-kaur-16-

en-15-oxo-18-oic acid (19) đã được phân lập từ phần chiết metanol lá khô cây khổ sâm

Bắc Bộ bằng phương pháp tách sắc ký cột lần lượt trên silica gel, ODS gel, và HPLCpha đảo [18].

HOOC AcO

17 18 191.2 Vài nét về terpen và diterpen [3, 25]

Khái niệm “terpen” được dùng để chỉ một lớp hợp chất thiên nhiên có cấu trúccó thể phân chia ra thành các đơn vị isopren Căn cứ vào số đơn vị isopren hợp thànhngười ta phân biệt các monoterpen C10, sesquiterpen C15, diterpen C20, sesterterpen C25,triterpen C30, tetraterpen C40 và polyterpen.

Bên cạnh thuật ngữ “terpen” người ta còn dùng khái niệm “terpenoit” để baohàm rộng rãi các sản phẩm thoái biến tự nhiên, thí dụ các ionon và các dẫn xuất tựnhiên cũng như tổng hợp của các terpen, thí dụ các terpen - ancol, -andehit, -xeton, -axit, - este, - epoxit, v.v… Tuy nhiên trong khi sử dụng thường không có sự phân chiaranh giới thật rõ rệt giữa các khái niệm “terpen” và “terpenoid” như vừa nêu Thuậtngữ terpen nhiều khi được dùng để bao hàm các terpen – hidrocacbon lẫn các dẫn xuấtcủa chúng

Các diterpenoid hợp thành một nhóm lớn các hợp chất C-20 được dẫn ra từgeranyl geraniol pyrophotphat Chúng chủ yếu xuất hiện trong các loài nấm hoặc trongthực vật và bao gồm các axít nhựa và các hocmon sinh trưởng thực vật nhómgibberellin.

Các diterpenoid có một số nét riêng đặc trưng Sự oxi hoá thường hay xảy rahơn ở các nhóm trong phân tử và ta thấy xuất hiện nhiều phản ứng tạo ete hoặc lacton.Các tương tác giữa các nhóm không liên kết trực tiếp với nhau thường làm cho khungcacbon bị biến dạng và dẫn tới nhiều chuyển vị lý thú.

Đa số các diterpen là hợp chất vòng Đối với các diterpen chủ yếu kiểu đóngvòng để hình thành các dẫn xuất của perhidronaphtalen và perhidrophenantren Có haikiểu đóng vòng :

Kiểu 1: Đóng vòng do sự proton hoá nối đôi của đơn vị isopropyliden xuất phát.

Kiểu thứ nhất thuộc về cùng dãy lập thể với steroid.

Kiểu 2: Nhóm pyrophotphat rời khỏi phân tử cho một cacbacation và khai mào

cho phản ứng đóng vòng.

Từ các tiền thân không vòng, thông qua các kiểu đóng vòng khác nhau mà dẫnđến các hệ thống khung vô cùng phong phú của các terpen cũng như diterpen Chẳnghạn ngày nay ta đã biết đến trên 170 khung cacbon của các diterpen, trong số đó có 7

khung (hình 1) chiếm khoảng 50% các diterpen được biết, khung labdan chiếm sốlượng lớn nhất.

Hình 2: Một số khung của các diterpen Các diterpen có hoạt tính sinh học vô cùng phong phú:

Điển hình là các hocmon sinh trưởng thực vật dãy gibberellin Người ta đã phân

lập và tinh chế được axít gibberellic từ nấm Gibberella fujikuroi tác dụng đặc trưng

cho sự phát triển bình thường của cây.

Các axít nhựa thuộc vào số các sản phẩm thiên nhiên xuất hiện với lượng lớn.Chúng có tác dụng cố kết các sợi gỗ, đặc biệt là các axít nhựa có nhóm phenolic cóhoạt tính kháng sinh nhẹ và bảo vệ cho gỗ khỏi bị vi sinh vật làm mục nát (axítpodocarpic và axít ferruginol) Nhựa copan hình thành khi một số cây nhiệt đới mụcnát có tác dụng bảo vệ cây.

Diterpen pleu-romutilin phân lập từ cây Pleurotus mutilus có hoạt tính kháng

khuẩn.

Ngoài ra nhiều hợp chất diterpenoid còn có tác dụng kìm hãm sự phát triển củakhối u (ví dụ quinon-methin), hoặc là những hợp chất có độc tính nguy hiểm (ví dụtaxin 1 ở cây thuỷ tùng).

Từ nhựa của Fabiana densa Remy var ramulosa Wedd đã tách được hai

diterpen mới: ent-beyer-15-en-18-O-succinat (20) và ent-beyer-15-en-18-O-oxalat(21) Hai hợp chất này có hoạt tính kháng vi trùng đối với Escherichia coli (ATCC

8739), Klebsiella pneumoniae, Salmonella aviatum (ATCC 2228), Pseudomonasaerug-inosa (ATCC 14207), Staphylococcus aureus (ATCC 6538P), Micrococeusflavus (ATCC 10290), Bacillus subtilis (ATCC 6633), Saccharomyces cerevisiae [16].

CH3R O H2C

Phần chiết CH2Cl2 của lá Croton zambesicus (Euphorbiaceae) gây độc tế bào đối

với dòng tế bào ung thư biểu mô tử cung Từ phần chiết này đã tách được một

trachyloban diterpen, ent-trachyloban-3β-ol (22) với hoạt tính độc tế bào dòng tế bào

Hela, IC50=7,3 µg/ml [14].

22

1.3 Khái quát về kauran và ent-kauran

Các kauran tồn tại ở hai dạng: dạng ent và phyllocladane Phần lớn kauran ởdạng ent, ít phổ biến hơn là phyllocladan có cầu metylen ở vị trí đối diện so với nhóm

metyl ở C-10

11 121316

11 121316

OPPenzym (A)

OPPenzym (A)

OPPenzym (A)

OPPenzym (A)

GGPP (-)-copalyldiphosphat

2 Enzym ent-kaurene synthase (B) xúc tác để (-)-copalyl PP (ent-copalyl

diphosphat) tiếp tục đóng vòng và phân bố lại.

HHGGPP i

HHGGPP i

( ) copalyl diphosphat( )

1.3.2 Các nghiên cứu chuyển hóa các ent-kauran diterpenoid

Năm 2007, Ronan Batista cùng các đồng sự đã tổng hợp thành công một

ent-kauran glycosid mới bằng phản ứng Koeings-Knorr từ axit kaurenoic và O-acetyl-glucopyranosyl bromid, theo sự thủy phân nhóm axetat [13].

2,3,4,6-tetra-Hình 3: Sơ đồ tổng hợp alcol kauran 25 và 26

Hình 4: Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất kauran 32a/b từ alcol kauran 25

Hình 5: Sơ đồ tổng hợp các dẫn xuất kauran 33-38 từ alcol kauran 26

Năm 2008, Silvia Marquina cùng với các cộng sự đã tiến hành hydroxyl hóa các

diterpen axit ent-kaur-16-en-19-oic và axit ent-beyer-15-en-19-oic bằng phương phápvi sinh sử dụng vi nấm Aspergillus niger [29].

Aspergillus niger

Hợp chất Eriocalyxin B (39) được phân lập từ loài Isodon (Rabdosia), sau đó

được các nhà hóa học Trung Quốc tiến hành chuyển hóa tạo thành 19 dẫn xuất mới củaEriocalyxin B có tác dụng gây độc trên tế bào ung thư [42].

39

Hình 6: Sơ đồ chuyển hóa Eriocalyxin B

(a): NaBH4, MeOH, 1:1; (b) NaBH4, MeOH, 1:3; (c) H2, Pd/C

46: R=CH2Br

47: R=CH2=CH2

Hình 7: Sơ đồ chuyển hóa Eriocalyxin B

(a): PCC, CH2Cl2; (b): tác nhân Jones, axeton; (c): Ac2O, BF3.Et2O, THF; (d): axylclorid, NaH, pyridin, THF; (e): Ac2O, DMAP, pyridin

Năm 2005, Liang Xu đã tiến hành bán tổng hợp ent-karan (55) theo hướng

epoxi hóa nối đôi của ent-kauran diterpenoid, thông qua 7 bước bao gồm các phản ứng:

aldol hóa, epoxi hóa, oxi hóa và quá trình Baeyer–Villiger thu được sản phẩm dioxanđạt hiệu suất 19% [39].

Ent-kauran (55) được phân tách từ phần chiết etanol của lá cây Isodon

55

Hình 9: Sơ đồ chuyển hóa ent-kauran 55

Năm 2002, Bruno cùng với các cộng sự đã tiến hành các chuyển hóa bán tổng

hợp từ linearol (68) thu được các dẫn xuất ent-kauran [15].

H2/Pd, COH

Hình 10: Sơ đồ chuyển hóa bán tổng hợp linearol tạo thành các ent-kauran

1.3.2 Hoạt tính sinh học của các ent-kauran diterpenoid tự nhiên và bán tổng hợp

Các ent-kauran tự nhiên có hoạt tính sinh học rất rõ rệt Một số ent-kauran

diterpenoid thể hiện tính kháng khuẩn như axit kaurenic, có khả năng ức chế vi khuẩnGram (+) Ví dụ như diterpen kauran axit (ent-16-kauren-19-oic axit) dùng để khửtrùng, chữa cảm lạnh và cúm [36]

Một số ent-kauran diterpenoid thể hiện hoạt tính gây độc tế bào như ent-kauranditerpenoid từ cây I eriocalyx var laxiflora Mười hợp chất này được thử độc tính trên

tế bào u ở người K562, T24 là laxiflorin E, laxiflorin C, eriocalyxin B thử trên dòngK562 (IC50 = 0,077; 0,569 và 0,373 µg/ml), còn hợp chất laxiflorin E và eriocalyxinthử trên dòng T24 (IC50 = 0,709 và 0,087 µg/ml) còn laxiflorin D và maocrystal đều có

hoạt tính chống lại cả hai dòng tế bào ung thư trên với giá trị IC50 nhỏ hơn 6,5 µg/ml[31].

Hợp chất 16β,17-dihydroxy-ent-kaurane-19-oic acid (75) được tách từ quả

Annona squamosa có hoạt tính chống sự sao chép HIV trong tế bào bạch cầu H9 với

giá trị ED50 = 0,8 µg/ml [35].

Hình 11: Các ent-kauran từ quả Annona squamosa

Năm 1999, các nhà khoa học Đức nghiên cứu loài Địa tiền Lepidolaenataylorii đã phân lập được bốn hợp chất 8,9-secokauran mới gây độc tế bào, 11 hợp chất

seco-kauran (88) và 6 hợp chất có cấu trúc của kauren-15-on Hợp chất secokauran (88) là hợp chất gây độc tế bào chính cùng với dẫn xuất dihydro và epoxy(89 và 90) ít độc hơn ở nồng độ thấp hơn [32].

10 911

88 89 90

Từ phần chiết etyl axetat của Isodon sculponeata đã tách được 4 ent-kauran

diterpenoid mới, các sculponeatin F-1 (91-94) và 6 hợp chất ent-kauran diterpenoid đã

biết (95-100) Hợp chất 93, 94, 96, 97, 100 có ảnh hưởng ức chế trực tiếp lên dòng tế

bào ung thư K562, IC50=3,2 µg/ml ÷ 8,2 µg/ml Hợp chất 91, 96 ức chế dòng tế bào

ung thư T24 với giá trị IC50 = 18,3 µg/ml và 15 µg/ml Không có hợp chất nào trong sốcác hợp chất trên gây độc đối với dòng tế bào A549 [26].

8910 11

18 1920

91 R1= H, R2= OH, R3= α-OH 9293 R1= H, R2= α-OH, R3= =O

95 R1= OH, R2= H, R3= α-Oac 94 R1= OH, R2= H, R3= =O

96 R1= H, R2= OH, R3= =O 99 R1= H, R2= H, R3= =O

97 R1= H, R2= OH, R3= α-OH 100 R1= H, R2= H, R3= α-OH

98 R1= OH, R2= H, R3= =O 101 R1= H, R2= β-OH, R3= =O

Hình 12: Các ent-kauran từ Isodon sculponeata

Các nhà khoa học Trung Quốc đã tách một ent-kauran diterpen, pseudoirroratin

A và một diterpen đã biết, pseurata A Hợp chất pseudoirroratin A gây độc tế bào đốivới dòng tế bào ung thư Lu1, SW626, LNCaP, KB, và HOS với giá trị IC50 = 0,26(0,75), 0,20 (0,57), 0,90 (2,59), 0,90 (2,59) và 0,5 (1,44) µg/ml (µM) [41].

pseudoirroratin A

Từ ngọn của cây Isodon adenantha ở Trung Quốc đã tách được 11 diterpenoid

mới, các adenanthin B-L (102-112), cùng 5 hợp chất khác, calcicolin B (113),adenanthin (114), weisiensin A (115), nervosanin (116) và forrestin C (117) Hợp chất103, 104, 115 có hoạt tính ức chế lên dòng tế bào K562 với IC50 là 3,3; 3,6 và 3,3µg/ml [27].

105 R1 = OH R2 = = O

Hình 13: Các ent-kauran từ Isodon adenantha

Các nhà khoa học bang Carolina đã tiến hành chuyển hóa bán tổng hợp từ

linearol thu được 26 dẫn xuất ent-kauran Các dẫn xuất này đã được nghiên cứu cho

hoạt tính chống HIV Kết quả là 5 hợp chất 118, 119, 120, 121 và 122 có hoạt tính

chống lại sự sao chép HIV trong tế bào bạch cầu H9 với giá trị EC50 = 0,1 - 3,11 µg/ml

và TI là 163 và 184 Hợp chất 118, 121 trong tương lai có thể phát triển như là tác nhân

chống ung thư [15].

Hình 14: Các ent-kauran bán tổng hợp từ linearol

Từ phần chiết etanol của lá Isodon xerophilus đã tách được 3 ent-kauran

diterpenoid (các xerophilusin L-N, 123-125) và ponicidin (128) Hợp chất 128 có khả

năng gây độc tế bào mạnh nhất lên hai dòng tế bào ung thư K562 và T24 với giá trịIC50 lần lượt là 0,09 và 0,32 µg/ml Hợp chất 125 gây ảnh hưởng ức chế yếu IC50 >15,6 µg/ml [28].

125 128

Hai diterpen axit spasmolytic, ent-kaur-16-en-19-oic acid (129) và en-19-oic acid (130) đã được tách ra từ thân của Viguiera hypargyrea có hoạt tính

ent-beyer-15-chống lại Staphylccoccus aureus, Enterococcus feacalis và Candida albicans Hợp

chất 130 ức chế ở nồng độ 63,54% và không phụ thuộc vào nồng độ, giá trị ED50 = 4,9

µg/ml Hợp chất 129 thể hiện ức chế ở 8,04%, liều dùng là 10 µg/ml [40].

Nghiên cứu hóa thực vật thân của Bruguiera gymnorrhiza tách được 3

ent-kauran diterpenoid mới, 13, 16α, 17-trihydroxy-ent-9(11)-kauren-19-oic acid (131), 16α, 17-dihydroxy-ent-9(11)-kaurene-19-al (132), 17-chloro-13, 16α -dihydroxy-ent-kauran-19-al (133) cùng 9 hợp chất ent-kaurane diterpen đã biết Hầu hết các hợp chất

được thử độc tế bào với dòng tế bào L-929, K562 và dòng tế bào ung thư cổ tử cung

Hela Các hợp chất 16αH-17,19-ent-kauranediol (134), al (135), 16-ent-kauren-19-ol (136) chống lại hai dòng tế bào ung thư K562 và L-929.Hợp chất 16-ent-kauren-19-ol (136) chọn lọc nhất cho hoạt tính này IC50 = 6,8 µg/ml[23].

13-hydroxy-16-ent-kauren-19-Các loài Rabdosia ở Trung Quốc được sử dụng trong y học cổ truyền như tác

nhân chống ung thư và chống viêm nhiễm Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứuthành phần hóa học của lá và thân cùng các hoạt tính sinh học đối với các loài

Rabdosia khác nhau, đặc biệt là Rabdosia rubescens (Hemsl.) Hara Các kauran

diterpen như oridonin (137) và ponicidin (138) là những chất độc tế bào chính trong

các loài Rabdosia [32].

137 138

Các hợp chất 139, 140, 144, 145 và 146 tách ra từ ngọn của Isodon

enanderianus gây độc tế bào mạnh lên dòng tế bào K562 với IC50 lần lượt là 0,67;

0,16; 0,59; 0,13; 0,87 µg/ml Các hợp chất 141 và 142 không gây độc tế bào đối với

dòng tế bào K562 [38].

11 12 1314

Hình 15: Các ent-kauran từ Isodon enanderianus

Năm ent-kauran diterpenoid mới, các ludongnin F-J (147-151) cùng với 10 hợp

chất đã biết, các guidongnin A-C (152-154), angustifolin (155), 6-epiangustifolin

(156), sculponeatin J (157) và gardenin D đã được tách ra từ lá của Isodon rubescensvar lushiensis Tất cả các hợp chất 147-159 đã được đánh giá ảnh hưởng ức chế lên tế

bào ung thư K562 Hợp chất 151-152, 155-158 gây ảnh hưởng ức chế mạnh với giá trị

IC50 lần lượt là 0,18; 0,30; 0,23; 0,87; 0,83; 0,25 µg/ml Trong khi các hợp chất còn lại

147-150, 153-154 không có hoạt tính (IC50 > 50 µg/ml) Điều này xác nhận rằng cấuhình cyclopentanon với một nhóm exomethylen là trung tâm hoạt động gây hoạt tính.

Hợp chất 151 gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư gan CA và dòng tế bào ung

thư cổ tử cung Hela với giá trị IC50 lần lượt là 0,09 và 0,70 µg/ml [24].

hh

acetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-one 32 (500 µg/ml) và ent-18-acetoxy-7β,

14α-dihydroxykaur-16-en-15-one 32 (125 µg/ml).

như metanol, rồi phân bố chọn lọc trong các dung môi thích hợp (n-hexan, diclometan)

để thu được các phần chiết.

2.1.2 Các phương pháp phân tích, phân lập các hợp chất

Để phân tích và phân tách các phần chiết của cây khổ sâm Bắc Bộ cũng nhưphân lập các chất đã sử dụng các phương pháp sắc ký như sắc ký lớp mỏng (TLC), sắcký cột thường (CC), sắc ký cột nhanh (FC) và các phương pháp kết tinh phân đoạn.

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60F254, dày 0,2 mm (Merck) Hiện màu các vệt bằng thuốc thử dung dịch vanilin/H2SO4

1%, Dragendoff-Munier và soi đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm

Sắc ký cột (CC) được thực hiện dưới trọng lực của dung môi dưới áp suất khíquyển Chất hấp phụ cho sắc ký cột là silica gel Merck các cỡ hạt, được nhồi theophương pháp nhồi ướt.

2.1.3 Các phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc của hợp chất phân lập được đã được khảo sát nhờ sự kết hợp cácphương pháp phổ: phổ khối lượng (EI-MS), phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từhạt nhân một chiều (1D NMR) là 1H NMR, 13C NMR, DEPT.

2.1.4 Điều chế các phần chiết từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

Bột khô lá cây khổ sâm Bắc Bộ được ngâm chiết 2 lần với metanol khan ở nhiệtđộ phòng Dịch chiết metanol được cất loại dung môi xuống còn 1/10 thể tích rồi phaloãng bằng nước cất theo một tỷ lệ thích hợp Dịch metanol-nước được chiết lần lượt

với dung môi không hoặc ít phân cực như n-hexan, diclometan Sau khi được làm khô,

cất loại dung môi các dịch chiết cho các phần chiết tương ứng n-hexan, diclometan (D).

Sơ đồ 1: Qui trình chiết lá cây khổ sâm Bắc BộBột lá cây khổ sâm Bắc Bộ

Phần bã

Dịch nước

Phần chiết n-hexan (H)

Phần chiếtMeOH

1 Chiết với metanol2.Gộp cô dung môi

1.Chiết với n-hexan

2 Làm khô dịch chiết bằng Na2SO4

3 Cất loại dung môi

1.Chiết với diclometan

2 Làm khô dịch chiết bằng Na2SO4

3 Cất loại dung môi

2.2 Qui trình phân lập các ent-kauran diterpenoid từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ

(Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae)

Để phân lập các ent-kauran diterpenoid, ta đi từ phần chiết D (xem 3.3.2).

15 gam phần chiết D được tẩm với 10 gam silica gel (Merck, 0,063-0,100mm)

thu được hỗn hợp bột tơi màu nâu sẫm Phân tách hỗn hợp này bằng sắc ký cột (CC)

với hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton thu được 8 phân đoạn từ D1 đến D8 Nhóm

phân đoạn D2 sau đó được phân tách lại bằng sắc ký cột thường (CC) trên chất hấp phụ

silica gel (Merck, 0,063–0,200mm) với hệ dung môi rửa giải là n-hexan-axeton, ta thu

được 3 nhóm phân đoạn D2.1, D2.2, D2.3 Nhóm phân đoạn D2.2 thấy có tinh thể hình

kim màu trắng kết tinh, lấy ra kết tinh lại trong axeton thu được một chất tinh khiết

CH1 (1) Nhóm phân đoạn D2.3 thu được một hỗn hợp hai tinh thể đồng kết tinh rấtkhó tách ký hiệu là hỗn hợp 2 chất CH2 (7) và CH3 (8).

1 7 8

Sơ đồ 2: Qui trình phân tách phần chiết diclometan (D)

CC, silica gel (0,063 – 0,100 mm), 80 pđ (150 ml/ pđ)

Rửa, n-hexan - axeton

Kết tinh lại, axeton

1 – 25

CC, silica gel (0,063 – 0,100 mm),35 pđ (15 ml/ pđ)

7 + 8