PHẦN THỰC NGHIỆM
3.5Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của các dẫn xuất.
Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được tiến hành để đánh giá hoạt tính kháng sinh của các mẫu chiết được thực hiện trên các phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck (1991), và MCKane, L., & Kandel (1996).
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. - Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus. - Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum.
- Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae.
Chứng dương tính:
+ Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+) + Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-)
+ Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men
Thuốc tháng sinh được pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampicilin: 50 mM; Tetracylin: 10 mM; Nystatin: 0,04 mM.
Chứng âm tính:
Vi sinh vật kiểm định không trộn lẫn kháng sinh và chất thử
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Sabouraud Dextrose Broth (SDB)-Sigma cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)- Sigma.
Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
Tiến hành thí nghiệm:
Các chủng kiểm định được hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm.
Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37oC/24 giờ cho vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
Kết quả dương tính là nồng độ mà ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU< 5.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration) của chất có hoạt tính:
Các mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ban đầu được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần từ (5- 10) thang nồng độ để tính giá trị nồng độ tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
Mẫu thô có MIC ≤ 200µg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50µg/ml là có hoạt tính.
KẾT LUẬN
Thực hiện nội dung nghiên cứu phân lập và chuyển hoá ent-kauran diterpenoid từ cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) và khảo sát hoạt tính sinh học của các sản phẩm nhận được, luận văn đã thu được các kết quả như sau:
1. Đã phân lập được các ent-kauran diterpenoid 1 và hỗn hợp 7 + 8 làm các chất đầu cho chuyển hóa.
2. Các chất đầu này được chuyển hóa ở vị trí của các nối đôi và các nhóm chức hidroxy và cacbonyl để tạo thành các dẫn xuất mới. Đã thực hiện thành công phản ứng epoxi hóa ở nối đôi của các ent-kauran diterpenoid và mở vòng epoxit tạo thành nhờ thủy phân hoặc botriflorua eterat; đã thực hiện các phản ứng thủy phân, axetyl hóa và oxi hóa các ent-kauran diterpenoid thành các dẫn xuất dihydroxy, diaxetyl và dixeton tương ứng. Cấu trúc của các sản phẩm chuyển hóa đã được xác định bằng các phương pháp phổ.
3. Đã thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật với các sản phẩm nhận được. Sản phẩm oxi hóa ent-kauran diterpenoid cho kết quả ức chế tốt đối với một số vi khuẩn và nấm.