Công nghệ sinh học thực phẩm BIỂU HIỆN các PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ để sản XUẤT CHẤT tạo NGỌT THƯƠNG mại mới

Công nghệ sinh học thực phẩm BIỂU HIỆN các PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ để sản XUẤT CHẤT tạo NGỌT THƯƠNG mại mới

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM KỸ THUẬT TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ HĨA HỌC THỰC PHẨM MƠN CƠNG NGHỆ SINH HỌC THỰC PHẨM Tác giả: Barry J Lamphear cộng sự, Plant Biotechnology Journal (2005) GVHD: ThS Nguyễn Minh Hải SVTH: Nguyễn Ngọc Phƣơng Anh 11116003 Nguyễn Thanh Trà My 11116040 Đặng Diệp Thảo 11116059 Lƣu Thị Thu Thủy 11116064 Võ Hƣờng Vi 11116080 TP Hồ Chí Minh, tháng năm 2014 [Type text] Page Công nghệ sinh học thực phẩm BIỂU HIỆN CÁC PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ ĐỂ SẢN XUẤT CHẤT TẠO NGỌT THƢƠNG MẠI MỚI Barry J Lamphear*, Donna K Barker, Christopher A Brooks, Donna E Delaney, Jeffrey R Lane, Katherine Beifuss, Robert Love, Kevin Thompson, Jocelyne Mayor, Rich Clough, Robin Harkey, Miranda Poage, Carol Drees, Michael E Horn, Stephen J Streatfield, Zivko Nikolov†, Susan L Woodard, Elizabeth E HoodĐ, Joseph M Jilkaả and John A Howard** ProdiGene, Inc , 101 Cổng Boulevard, Suite 100 , College Station , TX 77.845 , Hoa Kỳ Nhận ngày 22 tháng năm 2004, sửa đổi ngày 06 tháng năm 2004, chấp nhận ngày 09 tháng năm 2004 *Thư từ (fax 979 690 9527, e -mail blamphear@prodigene.com) †Địa tại: 303F Scoates Hall, Sinh học kỹ thuật nông nghiệp, Đại học Texas A & M, 2117 TAMU, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ §Đại tại: Đại học Tiểu bang Arkansas, Jonesboro, AR, Hoa Kỳ ¶Địa tịa: 2308 Ferguson St, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ **Địa tại: Stallion Ridge, College Station, TX 77.845, Hoa Kỳ Từ khóa: brazzein, natural sweetener (chất tự nhiên), sweet protein (protein ngọt), Zea mays Công nghệ sinh học thực phẩm MỤC LỤC Nội dung Trang TÓM TẮT GIỚI THIỆU KẾT QUẢ Biểu brazzein ngô Đặc tính protein brazzein biểu ngơ Phân tích cảm quan brazzein ngô Kiểm tra ứng dụng sản phẩm bột phôi bắp 11 THẢO LUẬN 12 PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 16 Cấu trúc plasmid 16 Chuẩn bị dịch chiết protein hịa tan từ hạt ngơ 17 Sự chuyển đổi ngô gián tiếp thông qua Agrobacterium 18 Định lƣợng brazzein tái tổ hợp ngô biến đổi gen 18 Phân tích trình tự đầu N amino đồng phân brazzien 19 Tinh chế brazzen tái tổ hợp loại từ ngô biến đổi gen để phân tích cảm quan 19 Kiểm tra cƣờng độ 20 Tách chiết hạt 21 Hiện tƣợng điện chuyển 21 LỜI CẢM ƠN 22 TÀI LIỆU BỔ SUNG 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO 23 Cơng nghệ sinh học thực phẩm TĨM TẮT Sự sẵn có thực phẩm hàm lượng đường thấp hương vị cao quan trọng cho hàng triệu cá nhân có ý thức lượng tiêu thụ carbohydrate với mục đích phịng trị bệnh tiểu đường ăn kiêng Brazzein protein tự nhiên có thực vật nhiệt đới Về mặt kinh tế, việc sản xuất kinh tế brazzein quy mô lớn không thực tế, hạn chế tính sẵn có brazzein cho sản phẩm thực phẩm Chúng tơi trình bày lợi ích hệ thống biểu ngô để sản xuất protein tự nhiên Người ta thu biểu cao brazzein với độ tích lũy lên đến 4% tổng lượng protein hịa tan hạt ngô Brazzein ngô tinh khiết sở hữu mức độ lên đến 1200 lần so với đường mía trọng lượng sở Ngoài ra, kiểm tra ứng dụng chứng minh bột mầm ngô chứa brazzein sử dụng trực tiếp ứng dụng thực phẩm, cung cấp vị cho sản phẩm Những kết chứng minh cường độ cao protein cho vào sản phẩm thực phẩm đem lại thuộc tính tạo hữu ích ngành cơng nghiệp thực phẩm GIỚI THIỆU Sự tồn protein có nguồn gốc tự nhiên có vị biết đến nhiều năm (xem xét Faus, 2000) Sự quan tâm đến protein tăng lên với nhu cầu ngày gia tăng cho chất làm “ít calo” sản phẩm thực phẩm “tự nhiên” “có lợi cho sức khỏe” để giải nhu cầu hàng triệu cá nhân có ý thức lượng tiêu thụ carbohydrate lý ăn kiêng bệnh tiểu đường Điều dẫn tới việc thương mại hóa chất loại protein này, thaumatin, chất tạo tăng hương vị (Witty Higginbotham, 1994; Faus, 2000) Thật không may, sản xuất thương mại thaumatin, tất protein khác, bị hạn chế nguồn tự nhiên cho tất protein loài thực vật nhiệt đới mà lồi thực vật khó trồng trọt Việc cố gắng lặp lặp lại để sản xuất protein tái tổ hợp hệ thống vi sinh vật thực vật biến đổi gen thất bại việc mang lại protein mức độ đủ lớn để thương mại hóa rộng rãi có tính khả thi kinh tế (Witty Higginbotham, 1994; Zemanek Wasserman, 1995; Faus, 2000) Brazzein protein xác định gần có Trang Cơng nghệ sinh học thực phẩm nguồn gốc từ thực vật châu Phi, Pentadiplandra brazzeana Baillon, có vị bên gấp 500 – 2000 lần so với đường mía (Ming Hellenkant, 1994) Quả chứa brazzein từ P brazzeana tiêu thụ khu vực địa vùng châu Phi nhiệt đới tính chất nó, nơi mà gắn liền với tên tiếng Pháp “l'oubli”, có nghĩa “lãng quên” (Hladick, 1989; Hladick, 1993) Điều đứa trẻ địa trở nên tập trung vào việc thu thập nhiều trái chín ngon lành chúng “quên” mẹ chúng tìm kiếm chúng Tuy nhiên, hạn chế phức tạp liên quan đến sản xuất quy mô lớn trồng địa làm cho sản xuất quy mô lớn brazzein từ nguồn tự nhiên không đem lại khả kinh tế Vì vậy, sản xuất thương mại rộng rãi brazzein yêu cầu việc chuyển giao biểu protein với hệ thống dị hợp phương tiện công nghệ DNA tái tổ hợp Sự phù hợp brazzein cho biểu tái tổ hợp chứng minh Escherichia coli, cho phép mô tả đặc điểm đặc tính sinh hóa protein (Assadi-Porter cộng sự, 2000a, b) Brazzein chuỗi polypeptide đơn 6,5 kDa với bốn cầu nối disulfua nội phân tử cho phép trì tính đặc trưng sau ủ 80ºC (Ming Hellenkant, 1994; Ming cộng sự, 1995.) Ba hình thức protein khác đầu cuối N amino acid Brazzein loại tương ứng với sản phẩm dịch mã 54 - amino acid dự đoán chứa glutamine đầu cuối N Hình thức xuất với vịng đời ngắn đầu cuối N glutamine phải trải qua chuyển đổi tự nhiên thành pyroglutamate, kết brazzein loại 1, mát đầu cuối N glutamine (hoặc pyroglutamate) tạo brazzein loại có 53 amino acid Chỉ có hai loại cuối phát chín Cường độ khác dạng, loại gấp hai lần so với loại (Izawa cộng sự, 1996) Chúng trình bày hệ dịng ngơ với hàm lượng cao protein brazzein biểu hạt giống Các phân đoạn hạt ngô biểu brazzein phương pháp xay xát khô tiêu chuẩn dẫn đến làm giàu brazzein bột mầm, biểu để phục vụ chất tạo ứng dụng sản phẩm Hơn nữa, brazzein tinh từ hạt giống đường mía đến 1200 lần trọng lượng sở Những kết hỗ trợ trồng ngô cách hiệu quả, hệ thống biểu kinh tế cho sản xuất thương mại protein ngọt, brazzein Trang Công nghệ sinh học thực phẩm KẾT QUẢ Biểu brazzein ngô Chiến lược phát triển dịng ngơ để sản xuất thương mại brazzein thiết kế với việc xem xét mục tiêu tạo protein mức biểu cao với cần thiết phải tạo sản phẩm biểu cấu trúc chức tương đương với protein từ nguồn tự nhiên Chỉ có dạng loại loại brazzein phát chín muồi P brazzeana (Ming Hellenkant, 1994), mục tiêu tạo dạng thông qua hệ thống biểu thực vật tái tổ hợp Tuy nhiên, chế sản sinh dạng thể sống liên quan đến việc chuyển đổi từ sản phẩm dịch mã brazzein loại làm trung gian (chứa glutamine đầu cuối N nó) cho loại loại Như vậy, biểu mRNA có chứa khung đọc mở brazzein loại lựa chọn gần giống với thiết kế tự nhiên để biểu có khả sản sinh chủ yếu protein brazzein loại thông qua việc chuyển đổi amino đầu cuối N glutamine thành pyroglutamate thể sống Ngoài ra, để chọn lọc biểu dạng loại brazzein, phương pháp di truyền phân tử giống hệt đầu cuối N glutamine (hoặc pyroglutamate) lựa chọn cách trực tiếp mã hóa hình thức cắt ngắn protein Vì vậy, khung đọc mở mã hóa hai brazzein loại hay loại tổng hợp hợp thành trình tự quy định khác thực vật để tạo thành tám cấu trúc biểu khác Các khung đọc mở mã hóa brazzein thiết kế thành vector[3] biểu (cấu trúc biểu hiện) có chứa promoter cố định (một promoter giống polyubiquitin[1] ngô; Hood cộng sự, 2003), promoter ưa phôi (globulin-1 ngô; Belanger Kriz, 1991) promoter ưa nội nhũ (22-kDa alpha-zein ngô, Tem AF090447) Chúng thử nghiệm kết hợp promoter, nhắm đến chuỗi RNA yếu tố để xác định thông số tốt để đạt mức độ biểu cao brazzein hạt ngô Sự kết hợp bao gồm promoter mô tả với vị trí nhắm đến thành tế bào tế bào chất Ngoài ra, để biểu nhắm đến thành tế bào, ưa phôi, vùng không phiên mã 5’ (UTRs) từ nguồn gốc virus thực vật (virus khắc acid thuốc lá) (TEV, Tem M15239) virus gây bệnh khảm còi Ubiquitin biết protein điều hịa nhỏ tìm thấy tất mô sinh vật nhân thực Polyubiquitin chuỗi ubiquitin gắn vào lysine đơn protein bề mặt Trang Công nghệ sinh học thực phẩm cọc ngô (MDMV, Tem AJ001691)] sử dụng Hình cho thấy khu vực bên vector[3] biểu điển hình, với đơn vị phiên mã tám cấu trúc sử dụng cho Agrobacterium – biến đổi gián tiếp ngơ Hình 1: Vector[3] chuyển đổi trồng (A) Bản đồ khu vực intraborder cấu trúc chuyển đổi bậc điển hình Vị trí phần tử trình tự sau định: loại promoter [phơi ưa thích virus khảm súp lơ 35S (CAMV35S)]; alpha-amylase lúa mạch::vùng mã hóa bazzein (BAASS :: Brazzein); khu vực đầu chép Pin II khoai tây; khung đọc mở gen kháng thuốc diệt cỏ tối ưu hóa ngơ (moPAT); đầu cuối CaMV (CAMV35St); trình tự mép trái phải Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid (LB RB); (B) đơn vị phiên mã thực vật (PTUs) sử dụng để tạo thực vật chuyển gen biểu brazzein loại loại Số cấu trúc thể bên trái đơn vị Loại promoter tiêu chí nhắm đến cho cấu trúc định Cấu trúc bao gồm yếu tố di truyền giống với thay đổi vị trí điểm hạn chế thiết kế Nguồn gốc vùng không phiên mã 5’ cho cấu trúc định BAASS, chuỗi tín hiệu alpha-amylase lúa mạch; MDMV, virus gây bệnh khảm cịi cọc ngơ; Pin II, gen chất ức chế protease II từ khoai tây; TEV, virus khắc acid thuốc Cấu trúc bậc giống cấu trúc bậc 6, ngoại trừ vị trí điểm hạn chế để thích nghi với tạo dịng phụ sau cho việc tạo cấu trúc Biến nạp lựa chọn để kháng thuốc diệt cỏ sau thụ phấn tự sử dụng dòng bố mẹ ưu tú cho hệ hạt giống T1 (thế hệ đầu tiên, sàng lọc sử dụng brazzein – hấp thụ miễn dịch sử dụng phương pháp ELISA[2] để đo lường tích tụ protein Kết năm hạt đơn T1 cao (đại diện cho năm trồng riêng biệt) cho dịng có nguồn gốc từ tám cấu trúc thể hình 2A Khơng có sai lệch so với kiểu hình bình thường tích hợp gen chuyển đổi Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay): phương pháp xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme, có nhiều dạng mà đặc điểm chung dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme [2] Trang Công nghệ sinh học thực phẩm quan sát trồng mang cấu trúc biểu Biểu protein brazzein quan sát thấy dịng có nguồn gốc từ tất cấu trúc Biểu phương pháp ELISA[2] phát tương quan với diện vùng phản ứng miễn dịch 6,5 kDa phân tích Western blot sử dụng huyết chống brazzein Kết chiết xuất điều chế từ hạt giống cấu trúc 1, (hình 2B) (Hình 3B) hiển thị Mức brazzein cao phát hạt giống từ dòng thiết kế để biểu dạng brazzein từ promoter ưa phôi nhắm đến tế bào thực vật (cấu trúc 2, 6) Hơn nữa, hai dạng brazzein tích lũy mức cao, khoảng 4% tổng lượng protein hịa tan (TSP) (Hình 2A; cấu trúc 2, 6), cho thấy khác biệt tinh tế đầu cuối N protein không giới hạn cho biểu protein brazzein hay ổn định ngơ Khi trình tự UTR 5’ từ hai loại virus thực vật (TEV MDMV) hợp UTRs 5’ cấu trúc 8, không làm tăng biểu protein quan sát thấy so sánh với cấu trúc Điều thú vị là, có biểu thấp (≤ 0,005% TSP) phát hạt giống từ dịng biểu brazzein nhắm đến tế bào chất (cấu trúc 4) Hình 2: Protein brazzein hạt ngô phân đoạn kết từ q trình xay xát khơ hạt giống (A) mức độ biểu protein brazzein hạt T1 cao từ năm trồng riêng lẻ hàng đầu tám vector[3] sử dụng để tạo kết chuyển gen độc lập cho biểu brazzein ngô Số liệu cho năm hạt giống biểu cao từ vector[3] 1-8 lấy từ kết chuyển gen 4, 15, 13, 9, 12, 19, 10 tương ứng TSP, tổng protein hòa tan (B) immunodetection (phát miễn dịch) brazzein chiết xuất từ hạt Chiết xuất từ hạt riêng lẻ tùy thuộc vào gel điện di natri [3] Trong nhân phân tử, vector phân tử DNA sử dụng phương tiện để mang vật liệu di truyền từ bên ngồi vào tế bào, nơi tái tạo biểu Bốn loại vector plasmid, vector vius, cosmids nhiễm sắc thể nhân tạo Trang Công nghệ sinh học thực phẩm dodecylsulphate-polyacrylamide (SDS-PAGE) 18% gel, chuyển giao cho polyvinylidene difluoride (PVDF) brazzein phát immunoblotting4 với kháng thể kháng brazzein mô tả “Phương pháp thí nghiệm” Giếng 1, kiểm sốt chiết xuất hạt giống ngô (20 μg); giếng 3, nấm men brazzein (100 50 pg, tương ứng); giếng -7, chiết xuất từ cấu trúc hạt giống (10 μg); giếng 8, chiết xuất từ cấu trúc hạt giống (20 μg) Lượng protein xác định cách xay nhuyễn hạt từ dòng chọn Mục “hạt” “mầm” đại diện cho lượng protein cấu tử nội nhũ phôi, mục “vỏ” thể lượng protein lớp hạt bắp Mục “sai số” thể độ lệch chuẩn từ giá trị trung bình thu thập từ mẫu Cấu trúc bậc sử dụng promoter ưa phôi để kích thích biểu protein brazzein loại hay loại protein brazzein dự đốn tích lũy đến mức cao phơi Để đánh giá khả tích lũy brazzein mô hạt giống, ngũ cốc nguyên hạt từ dòng bắt nguồn từ cấu trúc bậc tạo thành, hạt gộp phân đoạn sử dụng phương pháp nghiền khô để phân tách thành phần mầm hạt giống Brazzein xác định thành phần từ trình nghiền cấu trúc bậc hạt thể Hình 2C Brazzein tập trung gấp năm lần phần mầm đặc trưng phần trọng lượng khô so sánh với ngũ cốc nguyên hạt Kết tương tự tìm thấy phần hạt từ cấu trúc dịng bậc (dữ liệu khơng hiển thị) Như vậy, hiệu nghiền khô tiêu chuẩn làm giàu hàm lượng brazzein sử dụng hạt từ dịng mà biểu nhằm vào phơi Bảng 1: Phân tích trình tự amino acid đầu cuối N brazzein đƣợc tinh từ hạt ngô cấu trúc bậc bậc dòng Sequence origin (nguồn gốc trình tự) 10 amino acid đầu Brazzein loại qdkckkvyen† Cấu trúc brazzein bậc sqdkxkkvye Brazzein loại dkckkvyeny Cấu trúc brazzein bậc dkxkkvyeny [4] Immunobloting hay Western blot: kỹ thuật thẩm tách miễn dịch, kỹ thuật phân tích sử dụng rộng rãi sử dụng để phát protein cụ thể mẫu đồng mô từ chiết xuất Trang Công nghệ sinh học thực phẩm *Chỉ chu kì phân chia amino acid khơng thực †Có nghĩa trình tự mã hóa brazzein dự đốn mà không cần chuyển amino acid đầu cuối N glutamine thành pyroglutamate Đặc tính protein brazzein biểu ngơ Các dịng biểu brazzein cao sử dụng trình tự tín hiệu thực vật hợp để đầu cuối amino kết thúc brazzein trực tiếp biểu protein với thành tế bào thực vật Nói chung, trình tự tín hiệu lấy trình vận chuyển protein đến thành tế bào (Hood cộng sự, 1997) Vì vậy, để đánh giá xem liệu việc loại bỏ trình tự tín hiệu có thích hợp khơng xảy dịng ngơ chuyển gen, protein brazzein tinh chế từ cấu trúc dòng bậc Sắc ký lực miễn dịch sử dụng kháng kháng thể brazzein liên kết hóa trị với Sepharose sử dụng để tinh brazzein loại loại tương ứng từ cấu trúc dòng bậc Phần phân ước lượng mẫu lấy trình sắc ký phân tích gel điện di natri dodecylsulphate–polyacrylamide (SDS–PAGE) nhuộm với Coomassie Kết tách brazzein từ cấu trúc bậc hạt thể Hình Băng 6.5 kDa lớn phát nhuộm với Coomassie phân tách rửa độ pH thấp (Hình 3A, đường 7–9) phát kỹ thuật immunobloting[4] sử dụng kháng thể kháng brazzein (Hình 3B, đường 7–9), diện băng tương quan với việc phát brazzein phương pháp ELISA[2] (Hình 3C) Sắc ký lực miễn dịch chiết xuất từ hạt cấu trúc dòng bậc mang lại kết tương tự (con số bổ sung, xem phần sau) Protein brazzein ngơ tinh sạchcó nguồn gốc từ hai cấu trúc dòng bậc cho vào suy thoái Edman để có trình tự đầu cuối N amino acid (Bảng 1) Các trình tự đầu cuối N amino acid dạng brazzein tự nhiên loại hiển thị để tham khảo Acid amin không gán trình tự phân tích tương ứng với vị trí phần cysteine khung đọc mở rộng brazzein để tạo thành cầu disulfua nội phân tử protein brazzein (Kohmura cộng sự, 1996) Kết cho thấy brazzein cấu trúc dòng bậc xử lý xác để sản xuất đầu cuối N loại tự nhiên Tuy nhiên, brazzein tinh từ cấu trúc dịng bậc có thêm vào amino acid bổ sung phần kết thúc đầu cuối N, serine Amino acid tương ứng với amino acid cuối trình tự tín hiệu sử dụng cấu trúc bậc Trang Công nghệ sinh học thực phẩm sự, 2000b) Vì vậy, brazzein tái tổ hợp, có nằm phần bắp tinh từ hạt bắp nữa, giữ độ tự nhiên cao Kiểm tra ứng dụng sản phẩm bột phôi bắp Để kiểm tra phù hợp mầm ngô brazzein ứng dụng tiềm sản phẩm, bột mầm từ hạt thu nhận từ cấu trúc bậc dòng sử dụng vào thử nghiệm phù hợp sản phẩm Người ta lấy bột mầm làm thành công thức cho Sports Protein Bars (Những protein biến dị) Reduced Carbohydrate Muffins (bánh nướng xốp sử dụng carbohydrate khử) Người ta xem xét mẫu sản phẩm kiểm tra bảng vị giác độ loại vị tương ứng với sản phẩm mà đưa vào công thức sử dụng bột mầm từ ngô không chuyển gen đặc hiệu Thanh chứa brazzein mô tả sản phẩm chuẩn bị dùng cho mầm đặc hiệu mịn tính chất vị giống đường nhiêu Người ta mô tả cảm giác miệng “càng ấm trọn vẹn hơn” vật liệu đặc hiệu Kết tương tự mô tả cho Reduced Carbohydrate Muffins với sản phẩm brazzein mơ tả “càng trọn vẹn vị ngon” Trong đánh giá này, người ta ước tính bột brazzein có độ từ 25–30% độ đường mía trọng lượng sở, chứng minh độ brazzein bột mầm tồn điều kiện dùng để chuẩn bị cho hai sản phẩm tiềm THẢO LUẬN Thực vật ngày dùng nhà máy sinh học để sản xuất thương mại protein có giá trị (được xem xét lại Hood and Jilka, 1999; Streatfield and Howard, 2003; Horn cộng sự, 2004) Dược phẩm sinh học sử dùng việc phát triển vaccine dạng uống, enzyme dùng công nghiệp protein dược phẩm Việc sản xuất hệ thống biểu thực vật cung cấp nhiều thuận lợi hệ thống biểu khác: (i) thực vật chứa nhiều protein khác loại phong phú trải qua trình sau dịch mã phức tạp, (ii) việc sản xuất mở rộng cách nhanh chóng để sản xuất giá rẻ lượng lớn sản phẩm; (iii) thực vật mà không chứa mầm bệnh cho người, làm giảm đến mức tối thiểu lo ngại chất gây hại (iv) biểu protein Trang 12 Công nghệ sinh học thực phẩm hạt cung cấp vị trí tự nhiên để tồn trữ protein thời gian lâu dài Sự biểu protein chuyển gen trồng ăn có lợi ích đặc biệt cho q trình sản xuất vật liệu tiêu thụ cách trực tiếp, đặc tính khai thác cho mục đích phát triển vaccine uống (Streatfield and Howard, 2003) Ngô phương tiện đặc biệt thích hợp cho việc sản xuất thương mại protein tiêu thụ được, chỗ phát triển rộng rãi, hiệu đáng tin cậy, trồng phục vụ nguồn cho loại thực phẩm bản, hỗ trợ sở hạ tầng kinh doanh nông nghiệp để vận chuyển ngũ cốc, lưu trữ chế biến với hiệu cao Hơn nữa, việc sử dụng hệ thống biểu thực vật dẫn tới việc sản xuất thương mại nhiều protein (Hood cộng sự, 1999; Woodard cộng sự, 2003) Chúng báo cáo việc sử dụng hệ thống biểu ngô cho việc sản xuất kinh tế protein ngọt, brazzein , cho thị trường chất làm cường độ thấp cường độ cao Sự biểu cao protein brazzein hạt mầm ngô dẫn đến phần mầm với độ bên lên đến 40% giá trị đường mía tính theo trọng lượng Đây điều đặc biệt bật phần hạt giống sử dụng cho hệ phần mầm kiểm tra sở hữu mức độ biểu có khoảng 50 μg brazzein loại gram hạt Mức độ biểu brazzein hạt thu lên tới 4% TSP, tương đương với khoảng 400 μg brazzein gam hạt Điều cho thấy hạt giống từ dịng ngơ biểu cao sở hữu mầm có chứa độ lớn so với đường mía trọng lượng sở Hơn nữa, với khả tăng brazzein mức độ biểu thơng qua việc lai chéo liên tục dịng vào tế bào mầm ưu tú hệ đồng hợp tử hạt giống bố mẹ cho sản xuất, thật hợp lý để đề kế hoạch cho tiềm tồn hạt khơng phân đoạn để trội cường độ đường mía Chiến lược đạt biểu protein tái tổ hợp cao mà khơng có gen lặng thơng qua việc lựa chọn dịng trì biểu mức cao qua nhiều hệ kháng thuốc diệt cỏ sử dụng thành công (Hood cộng sự, 2003) Hơn nữa, Agrobacterium giới hạn số lượng gen chèn, thêm tính ổn định vào gen trạng thái đồng hợp tử (Muller cộng sự, 1987; Last Gray, 1990; Frary Hamilton, 2001; Choi cộng sự, 2003) Như vậy, với nhau, cách tiếp Trang 13 Công nghệ sinh học thực phẩm cận nên cho phép gia tăng việc biểu protein brazzein mức độ cao để hệ tiếp tục sinh sản Thực tế protein brazzein thể ngô sở hữu kiểu hình giống sản phẩm tự nhiên, điều quan trọng để sản xuất protein tái tổ hợp Trong trường hợp thaumatin, số phương pháp sử dụng hệ thống biểu khác tạo protein tái tổ hợp không mà không rõ lý (Edens cộng sự, 1982; Edens van der Wel , 1985; Lee cộng sự, 1988) Biểu bột mầm chứa brazzein sử dụng trực tiếp ứng dụng sản phẩm tiềm mà không làm giàu để cung cấp vị cải thiện hương vị sản phẩm cho thấy tiềm vật liệu chưa lọc chất làm cường độ thấp Sử dụng phần nhỏ mầm sản phẩm chất làm không cung cấp lựa chọn đường mía có hàm lượng calo thấp, cung cấp thuộc tính chất xơ cần thiết để thay lượng loại bỏ đường, sản sinh chất tạo tổng hợp chất độn Vì brazzein loại tinh từ hạt giống ngô biến đổi gen sở hữu cường độ 1200 lần so với đường mía trọng lượng sở, nguyên liệu làm giàu xu có khả phục vụ chất làm cường độ cao để tiếp tục mở rộng hàng loạt ứng dụng sản phẩm brazzein biểu ngô Sự ổn định cao protein brazzein đặc điểm hữu ích cho ngành cơng nghệ thực phẩm làm cho brazzein sản xuất từ ngơ thích hợp cho loạt ứng dụng thị trường, với hai ứng dụng thể Cũng brazzein từ ngô sử dụng để làm giàu syrup ngơ có hàm lượng đường fructose cao nhằm tạo cơng thức giúp tăng độ Những dịng ngơ biểu brazzein loại có tiềm lớn ứng dụng thương mại Đầu tiên, dòng chứa brazzein loại có mức độ biểu cao quan sát thấy ngô Thứ hai, brazzein loại biểu ngô sinh protein mang đầu cuối N amino acid dạng brazzein tự nhiên Thứ ba, cường độ vị cao brazzein loại biểu ngơ có bột mầm protein tinh Bột mầm protein tinh có cường độ vị xấp xỉ cường độ vị brazzein loại 3, sản xuất từ hệ thống vi khuẩn tái tổ hợp (AssadiPorteret al,2000b) Thêm vào đó, ngơ có thêm ưu điểm sản xuất protein có hiệu suất chi phí từ brazzein loại đóng gói sản phẩm tự nhiên ăn Trang 14 Công nghệ sinh học thực phẩm Trong báo cáo này, bột mầm từ dòng tạo biểu brazzein loại để kiểm tra việc ứng dụng Sự chuyển đổi đồng dòng biểu brazzein loại trước phát triển dịng loại 3, thời điểm ban đầu việc kiểm tra ứng dụng số lượng dịng loại khơng đủ Tuy nhiên brazzein loại có bột mầm chứng tỏ có vị cường độ cao nên hy vọng diện tương tự cho brazzein loại việc kiểm tra ứng dụng bột mầm Sự phát triển liên tục dịng ngơ nhiều hứa hẹn biểu brazzein loại cho phép việc thử nghiệm ứng dụng xa để đánh giá tiềm loại vật liệu Điều thú vị là, q trình chế biến khơng xác sản phẩm biểu brazzein loại sinh dạng khác brazzein mà khơng có glutamine với đầu cuối N, nghĩa không trải qua biến đổi thành pyroglutamate để tạo brazzein loại Mặc dù biến thể giữ lại vị ngọt, N-terminus đóng vai trị việc xác định vị (Assadi-Porter cộng sự, 200b), cường độ vị khơng cải thiện so với brazzein loại Những hình thức biến thể brazzein có cường độ vị cao thiết kế với vị bên gấp đôi vị brazzein loại (Assadi-Porter cộng sự, 2000b), việc sử dụng hệ thống ngô để biểu hình thức biến thể có khả tạo chí đủ loại ngơ có vị Tuy nhiên brazzein loại dạng tự nhiên protein có cường độ vị cao dịng ngơ có brazzein loại có lợi chấp nhận theo quy định tán thành sử dụng nguồn thay tự nhiên để tổng hợp chất Có nhiều báo cáo kỹ thuật biểu protein vào thực vật chuyển gen việc áp dụng kỹ thuật để sản xuất thương mại protein chưa có thực tế Tính khả thi kinh tế hệ thống thực vật tái tổ hợp sản xuất protein đòi hỏi biểu mức cao protein khác loại Witty (1990) tạo Solanum tuberosum sản xuất thaumatin tái tổ hợp với kiểu hình suất sản phẩm thấp Penarrubia cộng (1992) báo cáo biểu monellin, protein từ mọng đỏ thực vật phía tây nước Mỹ , Dioscoreophyllum cumminsii Diels, cà chua rau diếp chuyển gen có 23.9 µg monellin /khối lượng ướt thấp so với 400 µg/g hạt bắp Nhiều nỗ lực tiến hành để biểu mabinlin II, protein có vị có nguồn gốc từ trái Trang 15 Công nghệ sinh học thực phẩm Trung Quốc, Capparis masaikai Levl củ S.tuberosum chuyển gen(Xiong Sun, 1996), kết rõ ràng chưa báo cáo Ngay hạn chế biểu khắc phục giống này, tính khả thi rau diếp, cà chua khoai tây làm trồng thương mại sản xuất protein chưa có Do đó, biểu protein mức độ cao báo cáo hệ thống thực vật chứng minh khả thi với việc sản xuất thương mại protein tái tổ hợp, việc cho phép sản xuất thương mại cuối protein thực vật chuyển gen Việc thương mại hóa sản phẩm chứa brazzein tái tổ hợp yêu cầu chấp thuận theo quy định Những báo cáo gần việc xác định chất gây dị ứng cho tác nhân gây bệnh có liên quan đến protein thaumatin ( dòng PR-5 chất gây dị ứng thực vật) có nhấn mạnh cần thiết việc đánh giá tính gây dị ứng sản phẩm công nghệ sinh học cho việc cung cấp thực phẩm (Hoffman- Sommerguber, 2002) Điều thú vị là, tính tương đồng đáng kể thaumatin với chất gây dị ứng giống thaumitin, thaumatin nhận chấp thuận từ quan thông qua thử nghiệm kỹ lưỡng độc tính an tồn Việc so sánh brazzein với peptide sở liệu chất gây dị ứng Farrp cho thấy khơng có tương đồng đáng kể với chất gây dị ứng biết đến ( khơng ≥ 35% tính đồng so với chiều dài 53 amino acid brazzein loại 3) Ngoài ra, người dân địa châu Phi sử dụng nguồn tự nhiên brazzein làm thực phẩm có vị nhiều năm, điều cho thấy protein brazzein khơng có nguy hại với sức khỏe Tuy nhiên, tính ổn định tương đối cao protein brazzein (một hữu ích cho ứng dụng có xử lý nhiệt độ cao) cho thấy đánh giá chất gây dị ứng thực phẩm yếu tố quan trọng cho việc chấp thuận theo quy định brazzein PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM Cấu trúc plasmid Bắt đầu với thành lập chuỗi amino acid (Ming Hellenkant, 1994), chuỗi brazzein loại loại dịch mã ngược chương trình dịch mã ngược Wiscosin GCG chống lại codon xếp thành bảng cho gen biểu ngơ cách nhanh chóng Kết chuỗi AND quét có mặt Trang 16 Công nghệ sinh học thực phẩm trình tự khơng mong đợi tín hiệu olyadenylation, vị trí ghép liên ứng thứ thứ 3, chuỗi không ổn định mARN vị trí enzym giới hạn nhân khác Các chuỗi AND sửa đổi để loại bỏ vị trí cách chọn condon thay Kết chuỗi cấu trúc sau sử dụng chuỗi oligonucleotide bổ sung chồng chéo chuỗi phản ứng trùng hợp (PCR) để khuếch tán chuỗi tổng hợp hiệu Các vị trí giới hạn thuận lợi bố trí thành chuỗi kết tối ưu hóa 5’ 3’ để tạo điều kiện cho nhân Những chuỗi làm cho cận vơ tính thành hộp biểu ngơ vector[3] biến tính bao gồm chuỗi tiếp giáp bên trái phải khối nông sinh học plasmid Ti gen hạt bắp tối ưu lúc gen Streptomyces màu xanh lục (White cộng sự, 1992) biểu từ promoter 35S loại vi rút khảm cải hoa lơ (CaMV), gọi giới hạn tới thuốc diệt cỏ bialaphos, theo chiến lược báo cáo Hood cộng (2003) Tám cấu trúc khác sinh sản Đối với cấu trúc từ 1-3 5-8, hạt bắp codon hóa thành chuỗi tín hiệu lúa mạch alpha-amylase (BAASS;Rogers, 1985) hợp để cung cấp tín hiệu tế bào bí mật điểm N Các khung mã hóa chứa brazzein làm cho cận vơ tính thành vector[3] xi dịng promoter (vùng khởi động giống chuỗi protein điều hòa; Hood cộng 2003), promoter ưa phôi (vùng khởi động globulin-1 ngô; Benlanger Kriz, 1991) promoter ưa nội nhũ (hạt bắp cụm 22- gen alpha kDa , ngân hàng gen tăng thành số.) AF090447, nucleotit 1-867) Đối với cấu trúc 8, UTR 5’ TEV (ngân hàng gen tăng thành số M15239, nucleotit 2-143) MDMV (ngân hàng gen tăng thành số AJ001691, nucleotit 1-138) cấu trúc sử dụng chuỗi oligonuclotide bổ sung chồng chéo PCR để khuếch đại chuỗi tổng hợp hiệu trước để làm cho cận vơ tính 3’ trình tự vùng khởi động 5’ BAASS Cấu trúc quan trọng giống cấu trúc loại trừ thay vị trí giới hạn để điều tiết chất vơ tính theo sau tạo cấu trúc Hình bao gồm số cấu trúc biểu sinh sử dụng cho biến đổi hạt bắp nguyên khai Sự chuyển đổi ngô gián tiếp thông qua Agrobacterium Các cấu trúc biểu thực vật đưa vào ngô sử dụng phương pháp tiếp cận A.tumefaciens mô tả Streatfield cộng (2001) Trang 17 Công nghệ sinh học thực phẩm Bơng từ dịng hạt ngơ Hi loại II, sinh từ dòng hybrid lai tạo cách lai Hi II với dòng thuần, thu hoạch sử dụng để biến đổi Kết biến đổi gen dòng thực vật chọn lọc cho phát triển bialaphos µM (Phịng thí nghiệm cơng nghệ Phyto, Overland Park, KS) để bảo đảm sinh sản bền vững vật liệu gen xảy Một loạt từ 10-20 loại thực vật phát triển từ chuyển đổi độc lập Cây thụ phấn với giống lai ưu tú, hệ (T1) hạt giống khai thác phân tích protein tái tổ hợp biểu phương pháp ELISA[2] để định lượng protein brazzein Những dòng biến đổi gen biểu protein tái tổ hợp mức độ cao lai ngược với dịng ngơ thương mại Phấn hoa từ dòng biến đổi gen sử dụng cho việc thụ phấn dòng thương mại để lớn lên hạt giống biến đổi gen nhanh chóng Sự chuẩn bị dịch chiết protein hịa tan từ hạt ngơ Những hạt khơ nghiền thành bột cối chày phần 25-30 hạt khác nghiền máy xay cà phê Vật liệu nghiền thành bột sau lắc mạnh ống với bóng thép chịu lực chứa 500 ml nước muối đệm phosphate có chứa 0,05 % Tween ® 20 (PBST) hạt giống đơn 0,1 g mẫu hạt giống gộp Protein hòa tan thu hồi ly tâm mô đồng Nồng độ TSP chiết xuất thực vật xác định xét nghiệm cho liên kết protein - thuốc nhuộm (Bradford , 1976) Định lƣợng brazzein tái tổ hợp ngô biến đổi gen Một bánh sandwich-ELISA[2] sử dụng để định lượng mức độ brazzein chiết xuất thực vật phân đoạn sắc ký Trong thời gian ngắn, phủ kháng thể chống brazzein dung dịch đệm 0,05 M carbonate / bicarbonate pH 9,6 cách ủ nhiều °C Các lane sau bị chặn cách ủ với chặn đệm [PBST có chứa 3% albumin huyết bò (BSA) ( Sigma- Aldrich , St Louis, MO) ] 37 °C Chiết xuất protein hòa tan thêm vào lane ủ °C qua đêm Thỏ biotinylated chống brazzein kháng thể, pha loãng việc ngăn chặn đệm, thêm vào lane ủ 37 °C Streptavidin - alkaline phosphatase ( Jackson Immunoresearch phịng thí nghiệm, Tây Grove, PA) việc ngăn chặn đệm sau thêm vào lane ủ 37 °C Trang 18 Công nghệ sinh học thực phẩm Các ELISA[2] rửa bốn lần với PBST bước Cuối cùng, para - nitrophenylphosphate (Sigma) thêm vào lane , sau ủ 37 °C 30 phút, hấp thụ 405 nm ghi nhận Pha loãng loạt men tái tổ hợp có nguồn gốc từ loại tiêu chuẩn protein brazzein loại mẫu đối chứng ngô không chuyển gen đưa vào khảo nghiệm để tham khảo Phân tích trình tự amino dầu cuối N đồng phân brazzein Tất hạt ngô từ loại loại xay riêng tách chiết với dung dịch muối đệm phosphat (PBS) tỉ lệ v/w 4,5 : (PBS : mẫu) cách xoay mẫu 30 phút 4oC, phần bề mặt làm cách quay ly tâm 20 000 g 15 phút Kháng thể protein A Sepharose tinh khiết thỏ chống lại brazzein (5mg) kết hợp với mL cột Aminolink Plus (Pierce, Rockford, IL) theo hướng dẫn nhà sản xuất Dịch chiết chứa brazzein nhờ lực hấp dẫn hợp với cột antibrazzen (2 mL) tiền cân PBS Cột rửa PBS (8 mL), x PBS cô đặc (11 mL), protein liên kết tách rửa với đệm pH thấp (20 mM glycine, pH 2.5, 150 mM NaCl) thu nhận mL phân đoạn trực tiếp vào ống chứa M MOPS (3-(N-Mor-pholino)propanesulphonic acid), pH (81 µL) để trung hịa mẫu Phân đoạn chứa brazzein gộp chung cô đặc thông qua siêu ly tâm centricon-3 đơn vị lọc membrane (Billerica, MA) Mẫu brazzein (1 µg cho ngơ loại loại 3) điện di 10 – 20% SDS-PAGE gel, sau chuyển sang màng polyvinylidene difluoride (PVDF) Dải nhìn thấy cách nhuộm với GelCode Blue (Pierce), tách từ PVDF bị phân hủy tự động Edman theo phương pháp Matsudaira (1987) sử dụng dãy xếp tự động Hewlett-Packard G1000A Phịng thí nghiệm Hóa học Texas A&M Protein Tinh chế brazzen tái tổ hợp loại từ ngơ biến đổi gen để phân tích cảm quan Bột ngơ từ dịng lập trình để biểu brazzein loại tách chiết với đệm A (20 mM sodium acetate, pH 4.0), có chứa 30 mM NaCl với tỷ lệ : v/w, cách khuấy 4oC Phần bề mặt làm cách quay ly tâm, đun nóng đến 80oC 30 phút, sau làm lần thứ hai cách lọc qua lọc 0.2 μm Phần bề mặt tiếp tục phân đoạn sắc ký trao đổi cation cách tải trực tiếp vào SP-Sepharose Fast Flow (Pharmacia) cân Trang 19 Công nghệ sinh học thực phẩm đệm A Protein liên kết tách rửa với gradient tuyến tính đến 500 mM NaCl tạo lượng 15 cột, phân đoạn kiểm tra có chứa brazzein phương pháp ELISA[2] Phân đoạn chứa brazzein gộp lại cô đặc qua màng siêu lọc 3-kDa Sau bước đầu thường chứa > 95% brazzein, sau cho vào cột Superdex 30 307 mL (Amersham Biosciences, Upsala, Thụy Điển) cân đệm A có chứa 300 mM NaCl Brazzein tách rửa peak vị trí tương đương thể tích rửa giải (6.5 kDa) brazzein tinh chế từ nấm men Quy trình lặp lặp lại nhiều lần để tạo đủ nguyên liệu cho đánh giá cảm quan Brazzein tinh khiết cô đặc qua siêu lọc màng kDa, khử muối cột G-25(Amersham Biosciences) cân nước, sau lạnh đơng khơ Năm mươi phần trăm trọng lượng mẫu đơng khơ ước tính có chứa brazzein dựa giá trị ELISA[2] khối lượng mẫu, với lượng ẩm lại chiếm khoảng 20% trọng lượng mẫu Kiểm tra cƣờng độ Để đánh giá cường độ bột mầm ngô, giá trị tương đương đường mía xác định bảng điều khiển sử dụng mẫu chuẩn bị dạng dung dịch 5% bột ngơ hịa nước Mẫu bột mầm ngơ loại loại 3, có chứa protein brazzein 0.04% 0.02 % trọng lượng khô, so sánh với mẫu bột mầm ngô không chuyển gen kiểm chứng Các mẫu bột qua máy trộn tốc độ cao dịch chiết lọc trước nếm thử Để đánh giá cường độ ngọt, dịch nếm thử ghi điểm tương đối so với cường độ đường đường mía tiêu chuẩn mức 1.0%, 2.0%, 3.0%, 4.0% 5.0% nước Để đánh giá cường độ brazzein loại tinh chế từ ngô, mẫu dịch brazzein thử nghiệm chuẩn bị đệm nước citric/citrate Một mẫu protein brazzein đông khô loại 3, ước tính chứa brazzein 50% trọng lượng khơ, hịa tan mức 80 p.p.m 160 p.p.m để tạo nồng độ brazzein 40 p.p.m 80 p.p.m., tương ứng Nếm dãy thực để xác định nồng độ xấp xỉ 4% 8% đường mía Các dung dịch đường mía dao động 0,5% nồng độ từ 3% đến 9% bước, chuẩn bị đệm citric/citrate, sử dụng làm tiêu chuẩn tham chiếu cho điểm cường độ mẫu Kết định lượng cường độ ngào thể Bảng Trang 20 Công nghệ sinh học thực phẩm Đối với đánh giá bột mầm ngô brazzein thử nghiệm ứng dụng, sản phẩm xây dựng sử dụng bột mầm ngô đối chứng bột mầm ngô chứa brazzein loại từ dòng cấu trúc sau (i) Đối với thử nghiệm ứng dụng Sports Protein Bar, cô lập protein đậu nành (26 g) pha trộn với mầm ngô không béo (12.63 g), syrup Fructo-oligosaccharide (46.14 g), inulin (7.43 g), glycerol (1.86 g), dầu hướng dương (5.57 g) chất nhũ hóa (0,37 g) để sản xuất với hàm lượng protein cao Chuẩn bị tiến hành máy trộn dạng hành tinh; thành phần chất lỏng công thức đun nóng đến 60°C, trộn với bột khơ sau bao gói cắt trước nếm thử nghiệm (ii) Đối với thủ nghiệm ứng dụng Muffin giảm Carbohydrate, Polydextrose (19.35 g), mầm ngô không béo (20.43 g), whey protein (3.6 g), nước (13.5 g), toàn trứng (18 g), shortening (13.5 g), baking soda (1.35 g), muối (0.27 g), việt quất khô (6.64 g) lúa mì vụn (3.36 g) trộn nướng lò quay nhiệt độ 160°C 35 phút Sản phẩm đánh giá bảng đánh giá cảm quan cho hình thức bên ngồi, kết cấu, hương vị dư vị Đặc biệt ý đến ảnh hưởng vị hương vị kết hợp bột mầm brazzein vào công thức Tách chiết hạt Hạt đem xay xát để tách chiết thành phần cấu thành chứa hạt, chất miêu tả trước (Lamphear cộng sự, 2002) Hiện tƣợng điện chuyển SDS-PAGE thực 100-150V từ 90-150 phút sử dụng hệ thống điện NOVEX XCell II Dải protein hình dung cách nhuộm với Coomassie (chất nhuộm protein phân tích sinh hóa) sử dụng thuốc thử GelCode Blue (Pierce) hay kỹ thuật “immunoblotting[4] Với kỹ thuật immunoblotting[4], protein không nhiễm chuyển đến màng PVDF 30 – 35V 60 phút sử dụng hệ thống điện NOVEX XCell II Blots ủ nhiệt độ phòng dung dịch kín (dung dịch nước muối đệm từ 0.05 đến 20%, pH 8.0 5% sữa gầy) giờ, sau với kháng huyết anti-brazzein thỏ pha lỗng : 10000 dung dịch kín để qua đêm, ủ với liên hợp peroxidase lừa anti-thỏ (Jackson Immunoresearch Laboratories) pha loãng : 10000 dung dịch kín Dải Trang 21 Cơng nghệ sinh học thực phẩm immunoreactive phát sử dụng thuốc thử ECL (Amersham Biosciences, Upsala, Thụy Điển) theo khuyến nghị nhà sản xuất LỜI CẢM ƠN Chúng tơi cảm ơn Larry Dangott Phịng thí nghiệm Hóa học Protein Texas A&M University để phân tích chuỗi brazzein đồng dạng; Malcolm Gerngross phịng thí nghiệm chế biến thực phẩm Texas A&M GLP cho trình xay xát khơ mẫu hạt Mike Lindley Lintech cho hương vị cảm giác ứng dụng thử nghiệm brazzein mẫu Chúng cảm ơn James Eckles, Nektar, hỗ trợ dự án chung, phòng thí nghiệm Charles E Glatz để giúp đỡ với phát triển trình dùng để xử lý brazzein từ hạt giống ngơ Cơng trình hỗ trợ Bộ Nông Nghiệp Mỹ giai đoạn trợ SBIR # 99 - 33.610-9.435 # 00-33610-9435 để ProdiGene TÀI LIỆU BỔ SUNG Các tác giả cung cấp số bổ sung sau, tải từ http://www.blackwellpublishing.com/products/journals/suppmat/PBI/PBI105/PBI105s m.htm : Hình S1 cách ly protein brazzein từ ngô mang hạt giống xây dựng sắc ký immunoaffinity Trích chuẩn bị từ hạt cấu trúc loại 2, bị sắc ký immunoaffinity mô tả “thủ tục nghiệm” Phần ước phần phân đoạn phải chịu natri dodecylsulphate - polyacrylamide gel điện di (SDS-PAGE ) 18% gel Băng protein phát cách nhuộm với Coomassie màu xanh (A), chứa brazzein đo xét nghiệm miễn dịch enzymelinked (ELISA[2]) (B) Vị trí protein tiêu chuẩn trọng lượng phân tử ( × 10-3 ) hiển thị bên trái gel Ngõ , đệm phosphat mặn (PBS) chiết xuất hạt; ngõ 2, chảy qua (không ràng buộc) phần ; ngõ , PBS rửa ; ngõ , thứ ba PBS rửa ; đường 5-9 , phân tách rửa với đệm pH thấp Trang 22 Công nghệ sinh học thực phẩm TÀI LIỆU THAM KHẢO Assadi-Porter, F.M., Aceti, D.J., Cheng, H and Markley, J.L (2000a) Efficient production of recombinant brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein of plant origin Arch Biochem Biophys 376, 252–258 Assadi-Porter, F.M., Aceti, D.J and Markley, J.L (2000b) Sweetness determinant sites of brazzein, a small, heat-stable, sweet-tasting protein Arch Biochem Biophys 376, 259–265 Belanger, F.C and Kriz, A.L (1991) Molecular basis for allelic polymorphism of the maize Globulin-1 gene Genetics, 129, 863–872 Bradford, M.M (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein–dye binding Anal Biochem 72, 248–254 Choi, H.W., Lemaux, P.G and Cho, M.J (2003) Long-term stability of transgene expression driven by barley endosperm-specific hordein promoters in transgenic barley Plant Cell Report, 21, 1108–1120 Edens, L., Heslinga, L., Klok, R., Ledeboer, A.M., Maat, J., Toonen, M.Y., Visser, C.T and Varrips, T (1982) Cloning of cDNA encoding the sweet tasting plant protein thaumatin and its expression in Escherichia coli Gene, 18, 1–12 Edens, L and van der Wel, H (1985) Microbial synthesis of the sweet-tasting protein thaumatin Trends Biotechnol 3, 61–64 Faus, I (2000) Recent developments in the characterization and biotechnological production of sweet-tasting proteins Appl Microbiol Biotechnol 53, 145–151 Frary, A and Hamilton, C.M (2001) Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato Transgenic Res 10, 121–132 Hladick, C.M (1993) Fruits of the rainforest and taste perception as a result of evolutionary interactions In Tropical Forests, People and Food: Biocultural Trang 23 Công nghệ sinh học thực phẩm Interactions and Applications to Development (Hladik, C.M., Hladik, A., Linares, O.F., Pagezy, H., Semple, A and Hadley, M., eds), pp 73–82 Paris and Carnforth, Lancashire: UNESCO and The Parthenon Publishing Group Hoffman-Sommerguber, K (2002) Pathogenisis-related (PR)-proteins identified as allergens Biochem Soc Trans 30, 930–935 Hood, E.E., Bailey, M.R., Beifus, K., Magallanes-Lundback, M., Horn, M.E., Calloway, E., Drees, C., Delaney, D.E., Clough, R and Howard, J.A (2003) Criteria for high-level expression of a fungal laccase gene in transgenic maize Plant Biotechnol J 1, 129–140 Hood, E.E and Jilka, J.M (1999) Plant-based production of xenogenic proteins Curr Opin Biotechnol 4, 382–386 Hood, E.E., Kusnadi, A., Nikolov, Z and Howard, J.A (1999) Molecular farming of industrial proteins from transgenic maize Adv Exp Med Biol 464, 127– 147 Hood, E.E., Witcher, D., Maddock, S., Meyer, T., Baszczynski, C., Bailey, M., Flynn, P., Register, J., Marshall, L., Bond, D., Kulisek, E., Kusnadi, A., Evangelista, R., Nikolov, Z., Wooge, C., Mehigh, R., Hernan, R., Kappel, B., Ritland, D., ChungPing, L and Howard, J (1997) Commercial production of avidin from transgenic maize: characterization of transformant, production, processing, extraction and purification Mol Breed 3, 291–306 Horn, M.E., Woodard, S.L and Howard, J.A (2004) Plant molecular farming: systems and products Plant Cell Rep 22, 711–720 Izawa, H., Ota, M., Kohmura, M and Ariyoshi, Y (1996) Synthesis and characterization of the sweet protein brazzein Biopolymers, 39, 95–101 Kohmura, M., Ota, M., Izawa, H., Ming, D., Hellekant, G and Ariyoshi, Y (1996) Assignment of the disulfide bonds in the sweet protein brazzein Biopolymers, 38, 553–556 Trang 24 Công nghệ sinh học thực phẩm Lamphear, B.J., Streatfield, S.J., Jilka, J.M., Brooks, C.A., Barker, D.K., Turner, D.D., Delaney, D.D., Garcia, M., Wiggins, B., Woodard, S.L., Hood, E.E., Tizard, I.R., Lawhorn, B and Howard, J.A (2002) Delivery of subunit vaccines in maize seed J Control Release, 85, 169–180 Last, D.I and Gray, J.C (1990) Synthesis and accumulation of pea plastocyanin in transgenic tobacco plants Plant Mol Biol 14, 229–238 Lee, J.H., Weickmann, L.J., Koduri, R.K., Ghosh-Dastidar, P., Saito, K., Blair, L.C., Date, T., Lai, J.S., Hollenberg, S.M and Kenda, R.L (1988) Expression of synthetic thaumatin genes in yeast Biochemistry, 27, 5101–5107 Matsudaira, P (1987) Sequence from picomole quantities of proteins electroblotted onto polyvinylidene difluoride membranes J Biol Chem 262, 10 035– 10 038 Ming, D and Hellenkant, G (1994) Brazzein, a new high-potency thermostable sweet protein from Pentadiplandra brazzeana B FEBS Lett 355, 106–108 Ming, D., Markley, J.L and Hellekant, G (1995) Quantification of cysteinyl sulfhydryl residues in peptides and proteins by ESI-MS or MALDI-MS Pept Res 8, 113–114 Muller, A.J., Mendel, R.R., Schiemnann, J., Simoens, C and Inze, D (1987) High meiotic stability of a foreign gene introduced into tobacco by Agrobacteriummediated transformation Mol Gen Genet 207, 171–175 Penarrubia, L., Kim, R., Giovannoni, J., Kim, S.H and Fisher, R (1992) Production of the sweet protein monellin in transgenic plants Biotechnology, 10, 561– 564 Rogers, J.C (1985) Two barley alpha-amylase gene families are regulated differently in aleurone cells J Biol Chem 260, 3731–3738 Streatfield, S.J and Howard, J.A (2003) Plant-based vaccines Int J Parasitol 33, 479–493 Trang 25 Công nghệ sinh học thực phẩm Streatfield, S.J., Jilka, J.M., Hood, E.E., Turner, D.D., Bailey, M.R., Mayor, J.M., Woodard, S.L., Beifuss, K.K., Horn, M.E., Delaney, D.E., Tizard, I.R and Howard, J.A (2001) Plant-based vaccines: unique advantages Vaccine, 19, 2742– 2748 White, J., Chang, S.-Y., Bibb, M.J and Bibb, J.M (1992) A cassette containing the bar gene of Streptomyces hygroscopicus: selectable marker for plant transformation Nucleic Acids Res 18, 1062 Witty, M (1990) Preprothaumatin II is processed to biological activity in Solanum tuberosum Biotechnol Lett 12, 131–136 Witty, M and Higginbotham, J.D (1994) Thaumatin Boca Raton, FL: CRC Press Woodard, S.L., Mayor, J.M., Bailey, M.R., Barker, D.K., Love, R.T., Lane, J.R., Delaney, D.E., McComas-Wagner, J.M., Mallubhotla, H.D., Hood, E.E., Dangott, L.J., Tichy, S.E and Howard, J.A (2003) Maize (Zea mays)-derived bovine trypsin: characterization of the first large-scale, commercial protein product from transgenic plants Biotechnol Appl Biochem 38, 123–130 Xiong, L and Sun, S (1996) Molecular cloning and transgenic expression of the sweet protein mabinlin in potato tubers Plant Physiol 111, 57 Zemanek, E and Wasserman, B.P (1995) Issues and advances in the use of transgenic organisms for the production of thaumatin, the intensely sweet protein from Thaumatococcus daniellii Crit Rev Food Sci Nutr 35, 455–466 Trang 26 .. .Công nghệ sinh học thực phẩm BIỂU HIỆN CÁC PROTEIN NGỌT BRAZZEIN TRONG NGÔ ĐỂ SẢN XUẤT CHẤT TẠO NGỌT THƢƠNG MẠI MỚI Barry J Lamphear*, Donna K Barker, Christopher... trồng ngô cách hiệu quả, hệ thống biểu kinh tế cho sản xuất thương mại protein ngọt, brazzein Trang Công nghệ sinh học thực phẩm KẾT QUẢ Biểu brazzein ngơ Chiến lược phát triển dịng ngơ để sản xuất. .. Như vậy, với nhau, cách tiếp Trang 13 Công nghệ sinh học thực phẩm cận nên cho phép gia tăng việc biểu protein brazzein mức độ cao để hệ tiếp tục sinh sản Thực tế protein brazzein thể ngơ sở