công nghệ sinh học thực vật

công nghệ sinh học thực vật

CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

GV: ThS BÙI VĂN THẾ VINH

CHƯƠNG III CÔNG NGHỆ PHÔI VÔ TÍNH

– HẠT NHÂN TẠO

PHÔI VÔ TÍNH

1 KHÁI NIỆM VỀ PHÔI VÔ TÍNH

Phôi vô tính, phôi soma, phôi sinh dưỡng hay phôi thể hệ đều là khái niệm để mô tả một cấu trúc lưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ,

mà dưới những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn chỉnh.

Các tế bào có khả năng phát sinh phôi

có các đặc tính cơ bản sau:

 Tế bào có kích thước nhỏ, đẳng kính.

 Tế bào chất đậm đặc, hạnh nhân lớn.

 Hoạt động biến dưỡng mạnh mẽ.

 Hàm lượng protein và RNA cao.

 Có một số lượng lớn ribosome, ty thể và hạt tinh bột.

2 MỘT SỐ KHÍA CẠNH GIẢ ĐỊNH VỀ

SỰ HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH

•Sự cảm ứng hình thành phôi vô tính phải làm kết thúc sự biểu hiện của một gene trong mô thực vật tại thời điểm đó và thay thế bằng chương trình biểu hiện của gene sinh phôi

•Theo Sharp và các đồng nghiệp (1980) sự tạo phôi soma có thể theo 2 con đường:

• Phôi phát sinh trực tiếp không qua giai đoạn tạo mô sẹo (con đường PEDC)

• Sự tạo phôi soma cần có giai đoạn tạo mô sẹo ban đầu (con đường IEDC)

• Hai danh từ tế bào tiền phôi PEDC (Preembryogenic determined cell) và tế bào phát sinh phôi IEDC (induced embryogenic determined cell) dùng để phân loại mô, nhưng thực chất là 1 quá trình tiếp nối nhau, kết thúc

sự phát triển là sự hệ thống những tế bào phôi (EC- Embryogenic cell).

• Nếu mô cấy có các PEDC thì chỉ cần một sự kích thích phân chia tế bào là đủ để hình thành phôi => hình thành phôi trực tiếp.

• Nếu mô cấy là những tế bào đã phân hóa không còn khả năng sinh phôi thì chúng phải trải qua nhiều lần phân chia tế bào liên tiếp dưới sự cảm ứng của auxin tạo mô sẹo => hình thành phôi gián tiếp

Mỗi tế bào phôi soma đều phát triển qua 3 giai đoạn trước khi trưởng thành: –Hình cầu

–Hình tim

–Hình thủy lôi

Hình cầu

Hình tim

Hình thủy

lôi

3 NGUỒN GỐC CỦA PHÔI VÔ TÍNH

Theo Kohlenbach (1978) các thể phôi soma xuất hiện trong nuôi cấy invitro từ 3 nguồn tế bào nhị bội:

•Tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành.

•Các tế bào sinh sản không phải hợp tử.

•Trục hạ diệp và tử diệp của phôi hợp tử và cây con không có thông qua sự phát triển mô sẹo nào.

4 ĐẶC ĐIỂM CỦA THỰC VẬT TÁI SINH TỪ CON ĐƯỜNG HÌNH THÀNH PHÔI VÔ TÍNH

Cây con được tạo thành vẫn duy trì đặc tính của cây mẹ và đồng nhất về mặt di truyền.

Phôi vô tính phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh nhanh, cây ra hoa kết trái nhanh hơn là biến đổi cá thể.

Cây tái sinh từ phôi vô tính có sức sống cao, dễ sống khi di chuyển

ra môi trường đất và sinh trưởng.

Quy trình nuôi cấy mô cây chuối

5 ỨNG DỤNG CỦA QUÁ TRÌNH TẠO PHÔI VÔ TÍNH

Số lượng lớn phôi vô tính là nguồn nguyên liệu đáng kể phục vụ cho ứng dụng thực tiễn quan trọng như : sản xuất hạt nhân tạo, cải thiện chất lượng cây trồng, bảo quản chất mầm, loại trừ virus, sản xuất các chất biến dưỡng in vitro và thành lập khuẩn căn in vitro.

5.1 Sự chọn lọc tế b ào

Sử dụng những hệ thống t ái sinh thực vật có khả năng tái tạo nên cây mới từ tế bào đơn nhằm tr ánh sự xuất hiện biến dị gene Đồng thời chọn lọc những đặc tính mà ta mong muốn.

V í dụ: ngô biến đổi gene kháng sâu đục rễ, năng suất cao, hiệu quả sử dụng phân N tốt Phong Lan kh áng thuốc diệt cỏ nhờ vi khuẩn Agrobacterium….

Nhân giống lan Hồ điệp bằng nuôi cấy mô

Quy tr ình chuyển gene nhờ vi khuẩn Agrobacterium

5.2 Sự tái sinh các thực vật chuyển gene:

•Biến nạp vào mẫu cấy và sau đó cho tái sinh thông qua tạo phôi vô tính trực tiếp hoặc gián tiếp.

•Biến nạp vào tế bào có khả năng sinh phôi và tái sinh bằng con đường sinh phôi gián tiếp.

•Biến nạp vào phôi vô tính và tái sinh thông qua con đường sinh phôi thứ cấp hoặc sinh phôi gián tiếp.

•Biến nạp vào phôi vô tính, tăng sinh thông qua con đường hình thành phôi thứ cấp và tái sinh qua con đường hình thành cơ quan.

5.3 Sự tạo các dòng đồng hợp tử và đa bội

• Sử dụng mẫu cấy đơn bội như hạt phấn, bào tử tạo phôi đơn bội và kỹ thuật nhân đôi bộ NST tạo phôi đồng hợp tử.

• Sử dụng mẫu cấy nội nhũ tạo phôi tam bội.

• Xử lí colchicine hoặc amiprophos-methyl tạo phôi

đa bội.

5.4 Sự loại trừ virus

• Phôi vô tính có 1 hệ mao mạch rất phát triển, hệ thống này không nối liền với hệ mạch dẫn của mô cấy nên tạo được các dòng cây sạch bệnh virus.

5.5 Sự thành lập khuẩn căn

• Đầu tiên được đưa ra do Redenbaugh và cộng sự vào năm 1987 Nghiên cứu cho thấy việc ủ nấm khuẩn căn ngoài vào môi trường thúc đẩy phát triển cây con nguồn gốc phôi vô tính.

HẠT NHÂN TẠO

Hạt nhân tạo cây Địa Lan

CÔNG NGHỆ HẠT NHÂN TẠO

 Được nghiên cứu nhằm tạo vỏ bao để cải thiện chất lượng phôi.

 Được giới thiệu đầu tiên năm 1977, nhưng đến năm 1986 Redenbaugh v à cộng sự mới tóm lại tất

cả c ác nhân tố cần thiết để tạo nên vỏ bọc hiệu quả nhất.

KHÁI NIỆM HẠT NHÂN TẠO

 Hạt tổng hợp hay hạt nhân tạo là thuật ngữ để chỉ

phôi vô tính hay những thể nhân giống khác được bọc bởi 1 lớp gel, giúp cho việc bảo quản trong thời gian dài và vận chuyển dễ dàng hơn

 Tạo nên những cá thể đồng nhất về mặt di truyền,

tính ổn định cũng như chất lượng cây trồng

KHÁI NIỆM HẠT NHÂN TẠO

 Công nghệ hạt nhân tạo quan trọng với những thực vật:

1. Không tạo được hạt

2. Hạt tạo thành với số lượng thấp

3. Khả năng sống sót rất thấp

4. Nhân giống khó khăn, chất mầm không thể bảo quản

CÁC NHÂN TỐ CẦN THIẾT TRONG

TỔNG HỢP HẠT NHÂN TẠO

CÁC NHÂN TỐ CẦN THIẾT TRONG

MẪU SỬ DỤNG LÀM HẠT NHÂN TẠO

Sự tạo PLB từ mô lá

VẬT LIỆU LÀM VỎ BỌC

 Có nhiều tác nhân tạo gel được sử dụng làm vỏ bọc cho phôi: agar, alginate, polyco2133, carboxyl methyl cellulose, carrageenan, gelrite, guargum, sodium pectate, tragacanth gum, dextran, xanthan gum…

 Sử dụng alginate nhiều vì: dính vừa phải, không gây độc cho phôi, đặc tính tương hợp sinh học, tạo gel nhanh, rẻ tiền, để lâu được, độ cứng gel vừa phải

NGUYÊN TẮC VÀ ĐIỀU KIỆN KHI TẠO VỎ BỌC BẰNG CHẤT NỀN SODIUM ALGINATE

Nguyên tắc trong quá trình tạo

vỏ bọc alginate là sodium alginate chứa phôi sẽ tạo thành từng hạt nhỏ, tròn, cứng khi được nhỏ vào dung dịch CaCl2nhờ tro đổi in Na+ và Ca2+ Vỏ bọc cứng nhiều hay ít phụ thuộc vào số lượng ion Na+ và

Ca2+ trao đổi

 Nhược điểm của sodium alginate: chất dinh dưỡng có thể mất đi khỏi vỏ bao, sự trao đổi khí kém -> sử dụng than hoạt tính tăng khả năng sống sót của phôi vô tính

BỔ SUNG

Do phôi vô tính thiếu lớp nội nhũ chứa chất dinh dưỡng bên ngoài phôi, do đó cần thêm:

Chất dinh dưỡng

Chất điều hòa sinh trưởng

Chất kháng sinh, chất trừ nấm, trừ sâu, vi sinh vật

-> Vào chất nền gel