CHUONG II CONG NGHE NUOI CAY MO VA TE BAO THUC VAT - NHÂN GIÓNG IN VITRO
Những năm 70 của thế kỷ XX là thập niên của sự bùng nỗ công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là kỹ thuật nuôi cây mô và tế bào thực vật Đây là công cụ nghiên cứu của rất nhiều nhà khoa học Trong vòng 30 năm trở lại đây, kỹ thuật này đã làm nên một cuộc cách mạng lớn trong nhân giống thực vật và hiện nay người ta đang hướng tới mục tiêu áp dụng kỹ thuật này để sản xuất cây giống thương mại Kỹ thuật nuôi cây mô và tế bào thực vật đã trở thành một phương pháp nhân giống chuẩn và phổ biến đối với nhiều loại cây trồng như: cây công nghiệp, cây lâm nghiệp, cây cảnh, cây được liệu, cây ăn trái và rau xanh Những kiến thức về công nghệ nuôi cây mô và tế bào thực vật ngày càng được củng cô và có nhiều bước tiến rõ rệt Với phương pháp này người ta có thể nhân giống rất nhiều loài cây từ các vùng khí hậu khác nhau trên thế giới mà các phương pháp nhân giống truyền thông không thê thực hiện được
1 Giới thiệu sơ lược về công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật 1.1 Giới thiệu
Kỹ thuật nuôi cây mô và tế bào thực vật hay nhân giéng in vitro déu 1a
thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cay các bộ phận thực vật (tế bào đơn, mô,
cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh đưỡng thích hợp như muối
khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong điều kiện
vô trùng
Kỹ thuật nuôi cay mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng Trước kia người ta dùng phương pháp này để nghiên cứu các đặc tính cơ bản của tế bào như sự
phân chia, đặc tính di truyền và ảnh hưởng của các hóa chất đối với tế bào và mô
trong quá trình nuôi cấy Hiện nay, các nhà khoa học sử dụng hệ thống nuôi cây
mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vẫn đề có liên quan đến thực vật như sinh lý
hoc, sinh hoa hoc, di truyén học và cấu trúc thực vật Kỹ thuật nuôi cây mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của con nguoi
1.2 Lich sw phat triển của kỹ thuật nuôi cấy mo va té bao thực vật
Năm 1902, nhà thông thái Haberlandt lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mơ của sinh vật ra ngồi cơ thê nhưng ông đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên không thành công
Trang 2Năm 1934, White đã thành công trong việc phát hiện ra sự sống vô hạn của việc nuôi cấy tế bào rễ cà chua
Năm 1964, Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ việc nuôi cấy chồi ngọn Ơng đã thành cơng trong việc chuyển cây non của cây sen cạn từ môi trường nuôi cấy tôi thiểu Tuy nhiên, việc nhân giống cây vẫn chưa hoàn chỉnh Sau đó nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá ra những thành phần dinh dưỡng quan
trọng cần thiết cho sự phát triển của các tế bào được nuôi cấy
Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất có thể điều khiến sự nhân chỗi
Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến môi trường nuôi cây đánh dẫu một bước tiễn trong kỹ thuật nuôi cấy mô Môi trường của họ đã được dùng làm cơ sở cho việc nuôi cây nhiều loại cây và vẫn còn được sử dụng rộng rãi cho đến
nay
Năm 1960 — 1964, Morel cho rằng có thể nhân giống vô tính lan bằng
nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Từ kết quả đó, lan được xem là cây nuôi cây mô đầu tiên được thương mại hóa Từ đó đến nay, công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực
vật đã được phát triên với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác và được ứng dụng thương mại hóa
1.3 Tâm quan trọng của kỹ thuật nuôi cấy mô và tễ bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối
với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời đóng góp trực tiếp cho
thực tiễn sản xuất và đời sống 1.3.1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản
Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc bản chất của sự sống Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, có thể tiến hành so sánh đặc tính cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thẻ, từ đó rút ra mỗi tương quan giữa các bộ phận trong cây Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đó cho ra nhóm tế bào không chuyên hố gọi là mơ sẹo, từ mô sẹo có thể kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh Đây là ưu thế mà các nhà sinh lý, hoá sinh và di truyền học dễ dàng sử dụng trong công việc của mình
Trong một cơ thể rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thé và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể Phương pháp nuôi cấy mô có thê khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái được phân biệt một cách rõ rệt Điều này tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về các quy luật sinh trưởng, phát triển cùng mỗi quan hệ giữa chúng với bên ngoài Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đây sự phát triển của cây trồng theo
Trang 3hướng mong muốn Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, có thể tiến hành nghiên cứu mối quan hệ giữa ký sinh và ký chủ Như vậy, rõ ràng nhiều vẫn đề về bệnh lý sẽ được giải quyết một cách cơ bản Từ đó, tìm ra những cơ chế miễn dịch của thực vật, giúp cho việc phòng bệnh cho cây tốt hơn, đỡ tốn kém hơn 1.3.2 Về mặt thực tiên sản xuất
Phương pháp nuôi cây mô được sử dụng để bảo quản và nhân nhanh các giống cây quý, có giá trị kinh tế cao Hiện nay, phương pháp này ngày càng phổ biến trong công tác giống cây trồng Băng phương pháp nuôi cây mô, chỉ sau một thoi gian ngan có thể tạo được một sinh khối lớn có hoạt chất: sinh khối được tạo
ra vẫn giữ nguyên được thuộc tính, nghĩa là vẫn giữ được khả năng tô hợp các
chất thứ cấp như alkaloid, glycosid, các steroid dùng trong y học, chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sinh trưởng của vi khuẩn trong nông nghiệp
Hình 2.1 Nhân giống cây trông bằng phương pháp nuôi cấy mô 2 Các bước nhân giống in viro
2.1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy
Mẫu cây là mảnh mô thực vật được đặt vào trong môi trường nuôi cây Dé tién hanh nu6i cay in vitro thanh cong, khi la chon m6 cay can luu y dén tudi sinh lý của cơ quan được dùng làm mau cấy, vụ mùa lẫy mẫu, chất lượng của cây
lây mẫu, kích thước và vị trí lẫy mẫu đó Mẫu cấy sau khi chọn lựa được rửa sạch bằng xà phòng và khử trùng bề mặt bằng các chất khử trùng hóa học như calcium
hypochloride, sodium dichloroisocyanurate, chlorur thủy ngân 2.2 Tao thé nhan giong in vitro
Mau được nuôi cấy trên môi trường đinh dưỡng thích hợp để tạo thể nhân
gidng in vitro Cé 2 thé nhan gidng in vitro 1a thé chéi va thé cat dét Tao thé nhan giéng in vitro phy thudc vao dic diém nhan giéng ngoai ty nhién cua cay trồng Đối với những loài không có kha năng nhân giống, người ta thường nhân
giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo Trong môi trường nhân giống thường
bổ sung cytokinin, GA; va cdc chat hiru co khac
Trang 42.3 Nhân giống in vitro
Đây là giai đoạn quan trọng trong nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cây mô và tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệu nuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thường giống môi
trường tạo thê chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với
quá trình nhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình
tăng sinh diễn ra nhanh Cây nhân giống in ví/ro ở trạng thái trẻ hóa và được duy
trì trong thời gian dài Inocubate under culture condition
Transfer shoot clusters onto PGR-free medium
Transfer planlets
to greenhouse Transfer shoots onto pio nici induce medium
Hình 2.2 Các bước nhân giống in vitro 2.4 Tai sinh cay in vitro hoan chinh
Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ để chuẩn bị chuyển ra vườn ươm Cây con phải khỏe mạnh để nâng cao sức sống khi ra môi trường bình thường Các chất có tác dụng tạo choi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kích thích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy gần với điều kiện tự nhiên bên ngoài, một bước làm thích nghi trước khi tách ra khỏi điều kiện ứ: viro Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxm nội sinh, tỷ lệ CN, ánh sáng, sự trẻ hóa của mẫu, kiểu di truyền Người ta thường bỗổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vifro
2.5 Chuyển cây con in vifr0 ra vườn ơn
Cây con đã ra rễ được lay khoi ống nghiệm, rửa sạch agar và được đặt
trong chậu nơi có bóng râm, độ ẩm cao, cường độ chiếu sáng thấp, Sau khoảng
2 tuần, cây đã bắt đầu thích nghi với điều kiện bên ngoài, lúc này có thể tăng
cường độ chiếu sáng và hạ độ âm Đây là giai đoạn rất quan trọng trong quy trình
nhân giống vô tính vì cây con thường bị chết do sự khác biệt về điều kiện sống
giữa ín vitro và ex vitro Cây ín viro được nuôi cẫy trong điều kiện ôn định dinh
Trang 5dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ầm nên khi chuyên ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hắn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ
cao, độ âm thấp, cây con đễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo dẫn đến hiện
tượng chết Đề tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, độ âm cao Cây con thường được cấy trong luống ươm cây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ độ ẩm, trong những ngày đầu tiên cần phủ nylon để giảm sự thoát hơi nước ở lá (thường 7-10 ngày kế từ ngày cấy) Rễ được tạo ra trong quá trình nuôi cấy mô sẽ dần dần lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý ra rễ bằng cách ngâm rễ hay phun lên lá các hợp chất kích thích ra rễ ở nồng độ thấp đề rút ngắn thời gian ra rễ
3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật 3.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy
Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh truéng va phat trién in vitro:
3+ Kiểu di truyền
Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thông thường có khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh (trừ khi chúng còn non) Trong một số cây hai lá mầm thì Solanaceae,
Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae va Cruciferae 1a nhitng ho thyc vat dé
tái sinh nhất Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong môi trường tự nhiên thì chúng hầu như dễ tái sinh vứro Cũng có những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của cây Kalanchoe ƒfarinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định ín vivo nhưng có thê thực hiện trong điều kiện in viro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi trường nuôi cấy
% Tuôi của cây
Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta
thường dùng phôi và hạt làm vật liệu cấy mô Khi cây già đi, khả năng tái sinh
của chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện ứ vi/ro tùy vào điều
kiện ban đầu Đôi khi qua nhiều lần cây chuyền, mô phân sinh già từng bước
được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào Điều này được chứng minh trên những đối tượng như nho (Pimws vinjera), táo tay (Malus sylvestris), cây tuyết tùng (Crypfomeria japonica)
% Tuổi của mô và cơ quan
Những mô còn non và mềm thường đễ nuôi cấy hơn những mô cứng
nhưng cũng có nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cẫy từ cuống lá còn non tái
Trang 6sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm Khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như cây cai 4m (Lunaria annua), cay bao xuan (Primula obconica)
+ Tình trạng sinh lý
Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bao in vitro Thong thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái
sinh hơn trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai
đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đông khó nuôi cấy íw víro hơn chỗồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này
% Vị trí của mẫu cấy trên cây
Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và phat trién in vitro sau khi tach mau ở cây lanh sam (Pseudotsuga menziesii), 6ng nhan thay những chồi ban đầu được tách từ vị trí thấp trên cây phát triển trong môi trường íw viro tốt hơn, và chỗồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chổi nách Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phân đỉnh Điều đáng lưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ những phân khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng ín viro giống nhau
“% Kích thước mẫu cây
Các cầu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rời khỏi cây tự nó cung cấp chất dinh đưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất
dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dé tai sinh trén mdi trudng in vitro
hơn những cơ quan it chất dự trữ Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị
tốn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh + Vết thương
Sự tôn thương trên bề mặt mẫu cây đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn Ngoài ra, có thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương
“% Phuong phap cay
Trang 7những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng Phần gốc của mẫu cấy không cực có các chất dự trữ không có khả năng khuếch tán vào trong agar do nó không tiếp xúc với môi trường Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae, sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đó phương pháp cây không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy có cực
3.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy
Một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường
Thành phần này thay đổi tuỳ theo loài và bộ phận nuôi cấy Đối với cùng một
mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phần môi trường cũng thay đôi Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa của mẫu cấy Tuy nhiên, tất cả các môi trường nuôi cấy đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
+ Khoáng đa lượng: nhu cầu khống của mơ, tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tô đa lượng cần phải cung cấp là N, P, K, Ca, Mg và Fe
®# Khống vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật ứ: vứro là lĩnh vực còn ít được nghiên cứu Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cây mô mới ra đời, người ta không nghĩ đến việc bổ sung khống vi lượng vào mơi trường nuôi cấy Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hoá chất dùng để pha môi trường không tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tổ vi lượng cung cấp phân nào cho môi trường nuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho
tế bào là: Mn, Zn, Cu, B, Co, I, Mo
* Carbon va nguén nang lugng: trong nudi cay in vitro, nguén carbon giúp
mô và tế bào thực vật tông hợp nên các chất hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải từ quá trình quang hợp mà chính là nguồn carbon bổ sung vào môi trường dưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose Các nguồn carbonhydrate khác cũng được tiễn hành thử nghiệm như
lactose, galactose, rafinose, maltose va tinh bột nhưng các carbonhydrate này có
hiệu quả kém hơn so với glucose và sucrose Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tế bào nuôi cây Nồng độ sucrose ban đầu có thể ảnh hưởng đến một số tham số nuôi cây như tốc độ tăng trưởng và sản lượng hợp chất thứ cấp trong tế bào nuôi cấy
+ Vitamin: thông thường thực vật tông hợp các vitamin cần thiết cho sự tăng
trưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến
dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở
Trang 8thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (BI), acid nicotinic, pyridoxine (B6) va myo-inositol
% Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, gibberellin, cytokinin, abscisic acid va ethylen Miller là người đầu tiên nhận thay tỉ lệ auxin/cytokinin xac dinh dang
phân hoá cơ quan của tế bào thực vật nuôi cấy Cả auxin và cytokinin đều được bố sung vào môi trường nuôi cấy để kích thích sự phát sinh hình thái và tý lệ hormone sử dụng để kích thích sự tạo chéi hay tạo rễ không giống nhau
> Auxin tự nhiên là một hợp chất tương đối đơn giản: indol-3-acetic acid
(IAA) Các chất có cầu trúc gần giống IAA và có cùng vai trò với [AA trong vài
cơ quan đều được gọi là auxin (như IBA, NAA, 2,4-D, 2,4,5-T va phenoxyaxetic acid) Auxin phối hợp với cytokinin giúp sự tăng trưởng chồi non và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chỗi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng độ cao, auxIn cản trở sự phát triển của các phát thể chồi vừa được thành lập hay các chỗồi nách (các chéi 6 trạng thái tiềm sinh) Auxin ở nồng độ cao kích thích sự tạo sơ khởi rễ (phát thê non của rễ), nhưng cũng cản trở sự tăng trưởng của các sơ khởi này Trong sự tạo rễ, auxin cần phối hợp với các vitamine (như thiamine mà rễ không tong hop được), amino acid (như arginin), và nhất là các hợp chất ortho- diphenolic (như cafeic acid, chlorogenic acid)
> Cytokinin là một loại hormone thực vật kích thích tế bào phân chia Các
hợp chất này xuất phát từ purine adenin, một trong các base của DNA và RNA Hợp chất cytokinin đầu tiên được khám phá là kinetin, tiếp theo là zeatin — một hợp chất có trong phân lớn thực vật và vài vi khuẩn, cầu trúc gần giống kinetin nhưng hoạt tính cao hơn gấp 10 lần Sau zeatin, hơn 30 cytokinin khác nhau đã được cô lập Ngày nay, người ta gọi cytokinin để chỉ một nhóm hợp chất, thiên nhiên hay nhân tạo, có đặc tính sinh lý giỗng kinetin Nhiều chất tổng hợp có hoạt tính cytokinin, chúng đều là các aminopurin được thay thế ở vị trí thứ 6, thí du nhu BA Cytokinin kích thích sự phân chia tế bào với điều kiện có auxin Cytokinin tác động trên cả hai bước của sự phân chia tế bào: phân nhân và phân bào Trong nuôi cấy các mô nghèo cytokinin (mô lõi thuốc lá, vỏ rễ đậu), auxin
kích thích sự phân đôi nhiễm sắc thẻ, thậm chí tạo tế bào hai nhân, nhưng không
có sự phân vách; sự phần vách chỉ xảy ra khi co cytokinin ngoai sinh Cytokinin
giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein Trong thân và rễ,
cytokinin cản sự kéo dài nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào lá trưởng thành
Trong các nghiên cứu nuôi cẫy mô thực vật, tỷ lệ Auxin/Cytokinin (A/C)
Trang 9kháng giữa auxin (giúp tạo rễ) và cytokinin (giúp tạo chổi); sự cân bằng giữa hai kiêu hormone này là một trong những yếu tố kiêm soát sự phát trién Cl N OH CHa —CI Ò hi OH OCH;T( Oo (2,4-diclorophenoxy )acetic acid Napthalene acetic acid I1 „ 6 H.NH 2 i aw N N we N N | NO WX) N \ —s | | HOCH, 0 | Lt 7 HH N° ON ý % H HO * OH
Kinetin 6-benzyl adenin Thidiazuron
Hình 2.3 Công thức của một số chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Ngoài năm thành phần cơ bản trên, người ta còn bố sung một số chất hữu cơ có thành phần xác định (amino acid, EDTA, ) và một số chất có thành phần
không xác định như nước dừa, dịch chiết năm men, vào môi trường nuôi cấy % Các hợp chất hữu cơ không xác định: bổ sung nhiều chất trích hữu cơ khác nhau vào môi trường nuôi cấy thường mang lại kết quả thuận lợi cho sự tăng
trưởng của mô Các chất bô sung này là: protein hydrolysate, nước dừa, dich
chiết năm men, dịch chiết lúa mạch, chuối, nước cam, nước cà chua Tuy nhiên,
chỉ có nước dừa và protein hydrolysate được sử dụng rộng rãi
* Amino acid và các nguồn cung cấp nitrogen khác: mặc dù tế bào có khả năng tổng hợp tất cả các amino acid cần thiết nhưng sự bố sung các amino acid vào môi trường nuôi cấy là để kích thích sự tăng trưởng của tế bào Amino acid cung cấp cho tế bào thực vật nguồn amino acid sẵn sàng cho nhu câu của tế bào và nguồn nitơ này được tế bào hấp thu nhanh hơn so với nitơ vô cơ Các nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là hỗn hợp amino acid như casein hydrolysate, L- glutamine, L-asparine va adenine
* Than hoat tinh: viéc b6 sung than hoat tinh vao méi trudng nudi cay cé tac dụng khử độc Ảnh hưởng của than hoạt tính: hút các hợp chất cản, hút các chất điều hoà sinh trưởng và làm đen môi trường Người ta cho rằng tác dụng cản tăng trưởng của mô cấy trong môi trường có than hoạt tính là do nó hút các chất điều hoà sinh trưởng trong môi trường như: NAA, kinetin, BAP, IAA và 2IP Khả
Trang 10năng kích thích sự tăng trưởng của mô thực vật là do than hoạt tính kết hợp với các hợp chất phenol độc do mô tiết ra trong suốt thời gian nuôi cấy
+ Yếu tố làm đặc môi trường: agar là chất thường sử dụng để tạo môi trường đặc hay môi trường bán rắn trong nuôi cây mô thực vật Khi agar được trộn chung với nước thì tạo ra dang gel và tan ở nhiệt d6 60 - 100°C, đặc lại khi nhiệt độ xuống còn 45”C vì vậy agar ồn định trong tất cả các điều kiện nhiệt độ môi trường và không bị phân hủy bởi enzyme thực vật Hơn nữa, agar không phản ứng với các chất trong môi trường Độ cứng của agar quyết định bởi nồng độ
agar sử dụng và pH của môi trường
Có một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu để nuôi cây mô và tế bào thực vật như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5 (Gamborg và cộng sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng khoáng đa lượng cao và một số môi trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm lượng khoáng đa lượng thấp hơn
4 Nuôi cây mô tạo ra cây hồn chỉnh 4.1 Ni cấy nốt đơn thân
Phương pháp nuôi cây này sử dụng mẫu cây là chồi ngọn hoặc chôi bên có mang một đoạn thân ngăn Chồi này sẽ được kích thích cho tăng trưởng, ra rễ đề tạo thành cây nguyên vẹn
Chéi được thu từ chồi ngọn và ở các nách lá, sau đó cấy lên môi trường dinh đưỡng với các điều kiện thích hợp để tăng trưởng Chồi mới tăng trưởng sẽ mang nhiều lá và các chồi bên ở các nách lá tiếp tục được cây chuyền đến khi đạt
đủ số lượng chồi cần thiết thì chúng được cảm ứng ra rễ để trở thành cây con
hoàn chỉnh và được chuyền ra trồng trong đất
Tuy nhiên khi áp dụng phương pháp này có một số điểm cần lưu ý:
> Phương pháp này không thể áp dụng với những cây có lá xếp theo dạng hoa hồng (như cúc đồng tiền) và khi mẫu cấy có khả năng bị nhiễm cao Đối với
những cây này phải sử dụng phương pháp nuôi cấy chỗi đỉnh
> Để giảm khả năng bị nhiễm, nên chọn những chổi còn khép kín Nếu như
cây bị nhiễm từ bên trong thì tốt nhất là sử dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng
> Tốc độ nhân giống phụ thuộc vào số lượng chổi có sẵn Chồi tăng trưởng
tạo ra càng nhiều lá thì số lượng chỗồi bên càng nhiều dẫn đến sự tăng tốc độ nhân giống
> Các chồi được trẻ hóa, đặc biệt đối với cây thân gỗ, tăng trưởng hơn rất nhiều so với chỗi trưởng thành
> Sự tạo rễ trên các chồi đã trưởng thành khó thực hiện vì vậy cần phải trẻ
hóa chỗi dé có thê cảm ứng được sự ra rễ
Trang 11Phương pháp này đã được thực hiện thành công trên một số đối tượng như: cây măng tây, khoai tây, lê, hoa hồng, cà chua, dưa chuột, cà tím,
4.2 Nuôi cấy chôi bên
Về nguyên tắc, phương pháp này giống như phương pháp nuôi cấy nốt
đơn thân Điểm khác nhau là trong phương pháp nuôi cấy nốt đơn thân có sự kéo
dai chéi, thân và thường không cần đến cytokinin đề phát triển
Trong phương pháp nhân chi bên, chổi được cô lập trên môi trường dinh dưỡng và các chồi bên từ các nách lá phát triển dưới ảnh hưởng của cytokinin với nông độ cao Vai trò của cytokinin lúc này là hạn chế ưu tính ngọn để cho các chồi bên có thể phát triển Các chổi bên này được tiếp tục chuyên sang môi trường mới có b6 sung cytokinin thi cac choi bên mới lại tiếp tục được tạo ra Sau đó các chéi này được chuyển sang môi trường ra rễ và được đưa ra ngoài vườn ươm khi đã có rễ hoàn chỉnh
Thực tế, cả hai phương pháp này thường được áp dụng chung: đầu tiên, chéi tăng trưởng bình thường, sau đó bỗ sung cytokinin vào môi trường nuôi cẫy để cảm ứng sự hình thành các chổi bên
Phương pháp nhân giống bằng chồi bên được tiễn hành lần đầu tiên trên
cây cẩm chướng, dâu tây, cúc đồng tiền Hiện nay, phương pháp này được áp dụng cho nhiều loài thực vật và phố biến là ở một số lồi cây ăn trái
4.3 Ni cấy đỉnh sinh trưởng
Nhiễm virus là một trong những nguyên nhân gây ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật Đặc biệt, virus có thể chuyển sang các thế hệ kế tiếp trong quá trình thực vật sinh sản hữu tính và cả trong quá trình nhân giống vô tính ín vifro
Trong đỉnh sinh trưởng của thực vật có một sự cạnh tranh giữa sự sinh sản
của virus và sự phân chia tế bào của mô phân sinh để tạo ra các tế bào con Ở
vùng mô phân sinh, trong suốt quá trình phân chia của tế bào, khả năng sinh tổng hợp nucleic acid được tận dụng để phân chia tế bào sẽ gây bất lợi cho sự tăng sinh cua virus
Để có được nhiều đỉnh sinh trưởng sạch bệnh virus làm nguồn mẫu cho nuôi cấy in vífro, trước tiên phải tiễn hành tạo chỗi bất định, sau đó thu đỉnh sinh trưởng từ các chồi bất định này Nếu đỉnh sinh trưởng cô lập đang ở trạng thái hoạt động thì cơ hội loại trừ virus sẽ lớn hơn Nếu như đỉnh sinh trưởng được cô
lập có kích thước lớn thì cơ hội thu được cây sạch bệnh thấp
Phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng được áp đụng với những cây trồng
quan trọng như: khoai tây, thuốc lá, lily, Một số cây thân gỗ như anh dao, mam
Trang 12xôi, nho, cây đầu xuân, cũng được nuôi cây đỉnh sinh trưởng đê tạo cây sạch bệnh
4.4 Nuôi cấy bao phần và hạt phần
Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phấn là kỹ thuật tạo ra cây đơn bội kép (DH, double haploid) Phương pháp tạo cây đơn bội kép và chọn lọc là phương pháp chọn tạo giống có hiệu quả chọn lọc rất cao, đặc biệt nếu được
kết hợp với các phương pháp tạo ra các biến dị di truyền khác như lai hữu
tính hoặc gây đột biến nhân tạo Đây là kỹ thuật không phức tạp lắm, nhưng lại rất có hiệu quả trong chọn tạo giống cây trồng, nhất là đối với cây trồng
cho hạt như lúa Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn và hạt phan đã được phát triển
thành phương pháp chọn tạo giống đơn bội Sử dụng phương pháp này, các nhà chọn giống lúa đã rút ngăn rất nhiều thời gian và cũng giảm bớt các chỉ phí về lao động, không gian cần thiết để tạo ra các dòng thuân
5 Một số hệ thông nuôi cấy mới
5.1 Nuôi cấy lỏng có sục khí — Bioreactor
Hiện nay, hầu hết các hệ thống vi nhân giống được thực hiện trên những
hệ thống bình nuôi cấy khác nhau nhưng đều có điểm chung là mẫu cấy đều phát
triển trên môi trường đặc
Nuôi cấy trên môi trường đặc chủ yếu trên những thiết bị nuôi có kích
thước nhỏ nên môi trường nuôi cấy không đủ đáp ứng cho sự phát triển lâu dai
của mẫu cấy Hơn nữa, khi nuôi cấy trên môi trường đặc, môi trường bị lãng phí do cây không hấp thu hết các chất đỉnh đưỡng ở phần đáy của bình nuôi cấy
Các hệ thống nuôi cấy lỏng trên máy lắc ban đầu dựa trên mô hình nuôi cây vi sinh vật và tế bào động vật nhằm phục vụ trong nghiên cứu nuôi cây tế bào và thu nhận các hợp chất thứ cấp
Mẫu cấy trong môi trường lỏng có khả năng tăng trưởng nhanh hơn so với môi trường đặc Có thế do mẫu cay được tiếp xúc hồn tồn trong mơi trường nên hấp thu đều các chất dinh dưỡng từ môi trường
Ngày nay, hệ thống bioreactor với cầu trúc của các bình lên men nhưng các cánh khuấy bằng kim loại được thay bằng các ống silicon sục khí, có thê điều khiển được tốc độ đòng khí vào để hạn chế sự tương tác bất lợi của mẫu cấy, hạn chế sự tốn thương của mẫu Vì thế, hệ thống bioreactor được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích khác nhau như: nuôi cấy chồi và phôi thực vật, chổi hoa thu hải đường, củ khoai tây bi in vitro, hoa lily, một số cây thân gỗ và đặc biệt là nuôi cây thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học như nuôi cây rễ nhân sâm
Trang 13
Hình 2.4 Hệ thông nuôi cây bioreactor 5.2 Nuôi cấy quang tự dưỡng
Nuôi cấy quang tự dưỡng đã được giáo sư Kozai và các cộng sự đây mạnh
nghiên cứu trong thập niên 90 Từ đó đến nay có rất nhiều nghiên cứu thành công
trong việc ứng dụng phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng vào sản xuất giống cây trồng
Phương pháp vi nhân giỗng quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm hơn phương pháp truyền thống Nó thúc đây sự tăng trưởng của cây íw viiro, rút ngắn thời gian nuôi cấy và làm hạ giá thành cây in viro
Phương pháp mới này chú trọng đến các tác nhân vật lý của môi trường nuôi cấy (ion, sự khuyết tán khí hòa tan) và các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của cây cơn trong bình nuôi cấy (cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng, thành phần không khí, âm độ, nhiệt độ và tốc độ luân chuyển của không khí trong bình nuôi cấy, ) thay vì chỉ nghiên cứu thành phần hóa học của môi
trường nuôi cây như nông độ đường, muỗi khoáng, vitamin hay các chất điêu hòa
sinh trưởng thực vật mà các nhà nuôi cây mô vẫn thường quan tâm Trong vi
nhân giống quang tự đưỡng, đường không được sử dụng trong môi trường nuôi
cây Nói đúng hơn là không sử dụng các cơ chất hữu cơ bao gồm cả các chất điều hòa tăng trưởng thực vật, vitamin, amino acid, ngoại trừ các chất khoáng được cho vào môi trường Điều này dựa trên cơ sở trong tự nhiên tất cả các cây xanh
chứa điệp lục tố điều có khả năng tự quang hợp để tồn tại và phát triển Tất cả
các cơ quan dùng trong nuôi cẫy mô có diệp lục tố đều có khả năng quang hợp Chúng có thể nhận CO; trong không khí làm nguồn carbon trong quá trình quang hợp mà không cần đường và vitamin trong quá trình nuôi cấy
Phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tạo điều kiện tối đa cho cây trong bình nuôi cấy sử dụng khí CO; có sẵn trong không khí làm nguồn carbon chính cho quá trình tăng trưởng và phát triên của cây Sự loại bỏ đường trong
Trang 14môi trường nuôi cấy dẫn đến tỷ lệ nhiễm nam, khuẩn trong quá trình nuôi cấy giảm Điều này đem lại ý nghĩa rất lớn trong sản xuất vì chỉ phí công lao động sẽ giảm đáng kế song song với việc giảm nguyên vật liệu
Theo khái niệm về nuôi cấy mô quang tự dưỡng thì hộp chứa cây cây mô được xem như một nhà kính thu nhỏ Với phương pháp này sự tăng trưởng và phát triển của cây ín viíro phần lớn chịu ảnh hưởng của các tác nhân vật lý trong môi trường nuôi cây như ánh sáng, nhiệt độ, âm độ, nồng độ COs, sự trao đổi khí Nồng độ CO; và ánh sáng là hai yếu tố quan trong nhất trong nuôi cây mô quang tự dưỡng cùng với cơ quan có diệp lục tô Sự gia tăng khác biệt giữa nông độ CO; bên trong và bên ngồi hộp ni cây cùng với sự gia tăng cường độ ánh sáng làm cho hiệu suât quang hợp tăng
6 Ưu nhược điểm của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật
Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống:
> Có khả năng tái sinh cây con từ các vùng mô và cơ quan khác nhau của
cây như: trục thân, lóng thân, phiến lã, cuống lá, hoa, chéi phat hoa, hat
phan mà ngồi tự nhiên khơng thể thực hiện được
> Có thể sản xuất được số lượng lớn cây giống trong một thời gian ngăn, trên một diện tích nhỏ nhằm đáp ứng nhu cầu thương mại
> Cây con tạo ra đồng nhất về mặt đi truyền
Tạo cây sạch virus thông qua xử lý nhiệt hay nuôi cấy đỉnh sinh trưởng
VY Sản xuất quanh năm và chủ động kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng, độ âm,
> Bao quan nguồn giống cây ín viro với số lượng lớn nhưng lại chiếm điện tích rất nhỏ
> Tao cay co kha nang ra hoa, tạo quả sớm
> Tao dong toan cay cái (cây chà là) hoặc toàn cây đực (cây mang tây) theo
mong muốn
> Dé dàng tạo giống cây trông mới bằng phương pháp chuyển gene
Bên cạnh những ưu điểm nổi bật thuận lợi cho mục đích nhân giống như
đã được đề cập ở phần trên thì phương pháp vi nhân giỗng cũng có những nhược
điểm cần phải được khắc phục:
> Giá thành cây con được sản xuất từ kỹ thuật vi nhân giống còn khá cao > Tiến trình nhân giống phức tạp gồm nhiều giai đoạn liên quan và cần
khoảng thời gian dài trước khi có thể thích ứng trồng ngoài vườn ươm
> Su da dạng của dòng sản phẩm nhân giống rất hạn chế, nghĩa là cây con tạo ra thường ít đồng nhất về mặt kiểu hình
> Có thể xảy ra đột biến do tác dụng của các chất điều hòa sinh trưởng được bồ sung vào môi trường nuôi cấy