SẢN PHẨM THỨ CẤP CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

LỜI NÓI ĐẦU Với đề tài tìm hiểu về: “Sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật” nhóm chúng tôi giúp người đọc có hình dung rõ hơn về các sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực

SẢN PHẨM THỨ CẤP CỦA NUÔI

CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

MỤC LỤC

LỜI MỞ ĐẦU

I NỘI DUNG

1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật……… 4

1.1 Quy trình nuôi cấy tế bào thực vật………4

1.2 Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật làm chất xúc tác sinh học……….4

1.3 Đặc điểm kỹ thuật………4

2 Giới thiệu về hợp chất thứ cấp……… 5

2.1 Các alkaloid ……….6

2.2 Các tinh dầu ………6

2.3 Các glycoside………6

3 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật……… 6

3.1 Ưu điểm………6

3.2 Điều kiện tế bào nuôi cấy tích lũy hợp chất thứ cấp…………7

4 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học hiện nay:……… 8

4.1 Taxol (cây thông đỏ Pacific)……… 9

4.2 Imperatorin (cây Angelica dahurica var)……… 9

4.3 Berberine (rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense)……… 10

4.4 Diosgenin (cây Dioscorea doryophora)………10

4.5 Cryptotanshinone (cây Salvia miltiorrhiza)………10

4.6 Shikonin (rễ cây Lithospermum erythrorhizon)………11

4.7 Anthocyanin (Trái anh đào, bắp cải tím,…)………11

II KẾT LUẬN

III TÀI LIỆU THAM KHẢO

LỜI NÓI ĐẦU

Với đề tài tìm hiểu về: “Sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật” nhóm chúng tôi giúp người đọc có hình dung rõ hơn về các sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật, cũng như các ứng dụng của hợp chất thứ cấp trong y dược

Đồng thời, hi vọng sẽ cung cấp những thông tin cần thiết giúp cho người đọc hiểu được phần nào: Tiềm năng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật trong chiết xuất các hợp chất thứ cấp trong công nghiệp

I NỘI DUNG

1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật

1.1 Quy trình nuôi cấy tế bào thực vật

Thực vật Mẫu nuôi Mô sẹo Sinh sản trong dịch nuôi Thu tế bào

So với VSV, nuôi tế bào Thực vật cho sinh sản chậm hơn Nếu nuôi VSV tính bằng phút, giờ, còn nuôi cấy tế bào thực vật tính bằng ngày, tháng Nuôi tế bào thực vật có thể lên men gián đoạn, lên men liên tục như VSV Tăng trưởng của tế bào thực vật và VSV gần giống nhau

1.2 Ưu điểm của nuôi cấy tế bào thực vật làm chất xúc tác sinh học

- Có thể cung cấp liên tục nhiều sản phẩm trong mọi điều kiện thời tiết

- Chất lượng sản phẩm được cải tiến và ổn định nhờ khả năng chọn được các dòng tế bào có phẩm chất tốt và các điều kiện được tối ưu hóa

- Nếu kiểm soát được điều kiện nuôi cấy, ta có thể tăng năng suất đặc hiệu do thực vật tạo ra

- Trong quá trình nuôi cấy, tế bào thực vật phát triển còn nhanh hơn cây giống ban đầu Mở ra triển vọng tăng năng suất cây trồng trong tương lai

1.3 Đặc điểm kỹ thuật

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học

Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhất trong lĩnh vực nghiên cứu này Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là

có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004) Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá

và hoa Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy

Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối để tạo thành các chất thứ cấp (Lee 2001)

a, Nuôi cấy tế bào huyền phù

Thường khởi đầu bằng cách đặt các khối callus dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy) Trong quá trình nuôi cấy, các

tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, các mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết

Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỷ lệ cao các tế bào đơn và tỷ lệ nhỏ các cụm tế bào Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994)

b, Nuôi cấy callus

Ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào

Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng

3 Giới thiệu về hợp chất thứ cấp

Sản phẩm của các phản ứng hóa học của thực vật với môi trường hoặc là

sự bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật và động vật thường được hình thành với một lượng nhỏ trong cây Chúng được biết đến như là các hợp chất thứ cấp và thường được dùng làm dược liệu hay phụ gia thực phẩm

có giá trị Những nghiên cứu về các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật đã phát triển từ cuối những năm 50 của thế kỷ 20 (Rao và cs 2002) Các chất trao đổi thứ cấp có thể xếp trong ba nhóm chính là alkaloid, tinh dầu và glycoside

2.1 Các alkaloid :

Có dạng tinh thể là các hợp chất chứa nitrogen, được sử dụng trong công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm:

- Codein, nicotine, caffeine và morphine Một số loài thực vật có chứa nhiều alkaloid như cây thuốc phiện, cà độc dược, thuốc lá, khoai tây Alkaloid có thể có trong toàn cây hay chỉ tập trung ở bộ phận nào đó, như

ở quả cây thuốc phiện, vỏ cây canh ki na, rễ cây và độc dược Các hoạt tính sinh học của nó có thể tác động lên hệ thần kinh, hệ cơ, mạch máu hay bộ máy hô hấp của con người

- Với liều lượng lớn alkaloid thường độc nhưng liều lượng nhỏ chúng thường làm dùng thuốc chữa bệnh

2.2 Các tinh dầu :

- Chứa hỗn hợp terpenoid, chúng không tan trong nước Được sử dụng như chất tạo mùi, chất thơm và dung môi

2.3 Các glycoside:

- Bao gồm các hợp chât phenol và flavonoid, saponin và các cyanogenic Glycoside Dùng làm thuốc nhuộm, chất tạo mùi thực phẩm và dược phẩm

3 Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật

Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hóa chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại

Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ

20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học

3.1 Ưu điểm

Có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau:

- Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng;

- Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng);

- Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau;

- Tự động hóa, điều khiển sự sinh trưởng của ba tế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp

Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy

3.2 Điều kiện tế bào nuôi cấy tích lũy hợp chất thứ cấp

- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

- Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao

- Bổ sung các tiền chất nuôi cấy

- Dùng các chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor)

Ngoài ra, còn có các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng…

Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu Các thông số vật lý

và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy

a, Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao:

Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs 1982) Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của

Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần

nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L

b, Cung cấp tiền chất (precursor feeding):

Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp

chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp

và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ

c, Bổ sung tiền chất nuôi cấy:

Bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin,

hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004)

d, Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation):

Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985)

5 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học hiện nay:

4.1 Taxol (cây thông đỏ Pacific)

Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ

Pacific (Taxus brevifolia) Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược

phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng và ung thư vú

Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cộng sự 1993) Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học

Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn FettNeto và cộng sự (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên

sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T cuspidata Srinivasan và cộng

sự (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T baccata Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế

bào huyền phù của cây T mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở

độ cao 2000 m so với mực nước biển Các dòng tế bào thu được từ callus

có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol

4.2 Imperatorin (cây Angelica dahurica var)

Tsay và cs (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào

huyền phù của cây Angelica dahurica var Formosana Đây là một loài

cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến

Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các

bệnh về da Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var formosana bằng

phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau

10 ngày nuôi cấy Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10 Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 µg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần

4.3 Berberine (rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây

Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense Berberine chloride

được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa

Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm (Yamada

và Sato (1981) C japonica) Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản)

đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất rất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa 1994)

4.4 Diosgenin (cây Dioscorea doryophora)

Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa callus vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3% Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô Sản xuất diosgenin từ cây

D doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp

4.5 Cryptotanshinone (cây Salvia miltiorrhiza)

Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus cây Salvia miltiorrhiza Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy callus S.miltiorrhiza đã được khảo sát Callus sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường

bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D Callus sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA Kết quả phân tích HPLC cho thấy callus chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô)

Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong callus tăng lên Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong callus nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs 2003) chi thuộc họ Solanaceae như: Duboisia, Scopolia, Atropa, Hyoscyamus và Datura những năm 1960 (Misawa, 1994) Tuy nhiên, hàm lượng của scopolamine và hyoscyamine trong tế bào nuôi cấy thường rất thấp Sau này, Tabata và cs (1971) đã bổ sung tropic acid vào dịch huyền phù nuôi cấy Scopolia japonica lên 15 lần