SẢN PHẨM THỨ CẤP CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT

Với đề tài tìm hiểu về: “Sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật” nhóm chúng tôi giúp người đọc có hình dung rõ hơn về các sản phẩm thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật, cũng như các ứng dụng của hợp chất thứ cấp trong y dược. Đồng thời, hi vọng sẽ cung cấp những thông tin cần thiết giúp cho người đọc hiểu được phần nào: Tiềm năng kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật trong chiết xuất các hợp chất thứ cấp trong công nghiệp

SẢN PHẨM THỨ CẤP CỦA NUÔI CẤY TẾ BÀO THỰC VẬT Nhóm 12 Nguyễn Thanh Vũ 2008100230 Trần Khánh Vy 2008100175 Nguyễn Vương vũ 2008100230 Phạm Quốc Chính 2008100051 Nguyễn Tuấn Thanh 2008100034 GVHD: Thầy Phạm Minh Tuấn TP.HCM, tháng 12 năm 2012 MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU I NỘI DUNG Kỹ thuật ni cấy tế bào thực vật………………………………… 1.1 Quy trình nuôi cấy tế bào thực vật……………………………4 1.2 Ưu điểm nuôi cấy tế bào thực vật làm chất xúc tác sinh học……………………………………………………………………….4 1.3 Đặc điểm kỹ thuật………………………………………………4 Giới thiệu hợp chất thứ cấp…………………………………… 2.1 Các alkaloid …………………………………………………….6 2.2 Các tinh dầu ……………………………………………………6 2.3 Các glycoside……………………………………………………6 Sự tích lũy hợp chất thứ cấp tế bào thực vật……………………………………………………………………… 3.1 Ưu điểm…………………………………………………………6 3.2 Điều kiện tế bào ni cấy tích lũy hợp chất thứ cấp…………7 Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất hoạt chất sinh học nay:………………………………………………… 4.1 Taxol (cây thông đỏ Pacific)………………………………… 4.2 Imperatorin (cây Angelica dahurica var)…………………… 4.3 Berberine (rễ Coptis japonica vỏ Phellondendron amurense)………………………………………… 10 4.4 Diosgenin (cây Dioscorea doryophora)………………………10 4.5 Cryptotanshinone (cây Salvia miltiorrhiza)…………………10 4.6 Shikonin (rễ Lithospermum erythrorhizon)……………11 4.7 Anthocyanin (Trái anh đào, bắp cải tím,…)…………………11 II KẾT LUẬN III TÀI LIỆU THAM KHẢO LỜI NĨI ĐẦU Với đề tài tìm hiểu về: “Sản phẩm thứ cấp nuôi cấy tế bào thực vật” nhóm chúng tơi giúp người đọc có hình dung rõ sản phẩm thứ cấp nuôi cấy tế bào thực vật, ứng dụng hợp chất thứ cấp y dược Đồng thời, hi vọng cung cấp thông tin cần thiết giúp cho người đọc hiểu phần nào: Tiềm kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật chiết xuất hợp chất thứ cấp công nghiệp I NỘI DUNG Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật 1.1 Quy trình ni cấy tế bào thực vật Thực vật Mẫu nuôi Mô sẹo Sinh sản dịch nuôi Thu tế bào So với VSV, nuôi tế bào Thực vật cho sinh sản chậm Nếu nuôi VSV tính phút, giờ, cịn ni cấy tế bào thực vật tính ngày, tháng Ni tế bào thực vật lên men gián đoạn, lên men liên tục VSV Tăng trưởng tế bào thực vật VSV gần giống 1.2 Ưu điểm nuôi cấy tế bào thực vật làm chất xúc tác sinh học - Có thể cung cấp liên tục nhiều sản phẩm điều kiện thời tiết - Chất lượng sản phẩm cải tiến ổn định nhờ khả chọn dịng tế bào có phẩm chất tốt điều kiện tối ưu hóa - Nếu kiểm sốt điều kiện ni cấy, ta tăng suất đặc hiệu thực vật tạo - Trong q trình ni cấy, tế bào thực vật phát triển nhanh giống ban đầu Mở triển vọng tăng suất trồng tương lai 1.3 Đặc điểm kỹ thuật Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm cải thiện hợp chất có giá trị y dược, gia vị, hương liệu màu nhuộm mà sản xuất chúng từ tế bào vi sinh vật tổng hợp đường hóa học Những năm gần đây, phát triển hợp chất thứ cấp quan trọng thương mại kết mong đợi lĩnh vực nghiên cứu Ưu mặt nguyên lý kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết tỷ lệ lớn lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004) Một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật phân hóa hình thái Nhiều hợp chất thứ cấp sản xuất suốt q trình phân hóa tế bào, chúng tìm thấy mơ có khả phân hóa cao rễ, hoa Do phân hóa hình thái trưởng thành không xuất nuôi cấy tế bào nên chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành q trình ni cấy Tuy nhiên, tế bào khơng phân hóa ni cấy huyền phù thường tạo thành khối vài trăm tế bào, tế bào khối có tiếp xúc với mơi trường khác với tế bào bên nên phân hóa xuất tới mức độ khối để tạo thành chất thứ cấp (Lee 2001) a, Nuôi cấy tế bào huyền phù Thường khởi đầu cách đặt khối callus dễ vỡ vụn môi trường lỏng chuyển động (lắc khuấy) Trong q trình ni cấy, tế bào tách khỏi mẫu chuyển động xoáy môi trường Sau thời gian ngắn dịch huyền phù có tế bào đơn, cụm tế bào với kích thước khác nhau, mẫu ni cấy thừa chưa phát triển tế bào chết Tuy nhiên, có dịch huyền phù hồn hảo, chứa tỷ lệ cao tế bào đơn tỷ lệ nhỏ cụm tế bào Mức độ tách rời tế bào nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính khối tế bào xốp điều chỉnh cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994) b, Nuôi cấy callus Ưu điểm thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhược điểm thể tích ni cấy bé nên khó phát triển quy mơ cơng nghiệp, mẫu ni cấy tiếp xúc mặt với nguồn dinh dưỡng, sản phẩm mẫu nuôi cấy tạo q trình trao đổi chất tích tụ xung quanh dẫn đến làm chậm sinh trưởng tế bào Vì thế, ni cấy tế bào huyền phù thích hợp cho việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật trì thao tác tương tự với hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm mơi trường lỏng Giới thiệu hợp chất thứ cấp Sản phẩm phản ứng hóa học thực vật với mơi trường bảo vệ hóa học chống lại vi sinh vật động vật thường hình thành với lượng nhỏ Chúng biết đến hợp chất thứ cấp thường dùng làm dược liệu hay phụ gia thực phẩm có giá trị Những nghiên cứu hợp chất thứ cấp có nguồn gốc thực vật phát triển từ cuối năm 50 kỷ 20 (Rao cs 2002) Các chất trao đổi thứ cấp xếp ba nhóm alkaloid, tinh dầu glycoside 2.1 Các alkaloid : Có dạng tinh thể hợp chất chứa nitrogen, sử dụng công nghiệp dược Họ alkaloid bao gồm: - Codein, nicotine, caffeine morphine Một số lồi thực vật có chứa nhiều alkaloid thuốc phiện, cà độc dược, thuốc lá, khoai tây Alkaloid có tồn hay tập trung phận đó, thuốc phiện, vỏ canh ki na, rễ độc dược Các hoạt tính sinh học tác động lên hệ thần kinh, hệ cơ, mạch máu hay máy hô hấp người - Với liều lượng lớn alkaloid thường độc liều lượng nhỏ chúng thường làm dùng thuốc chữa bệnh 2.2 Các tinh dầu : - Chứa hỗn hợp terpenoid, chúng không tan nước Được sử dụng chất tạo mùi, chất thơm dung môi 2.3 Các glycoside: - Bao gồm hợp chât phenol flavonoid, saponin cyanogenic Glycoside Dùng làm thuốc nhuộm, chất tạo mùi thực phẩm dược phẩm Sự tích lũy hợp chất thứ cấp tế bào thực vật Sự tiến vượt bậc công nghệ sinh học nuôi cấy mô tế bào thực vật giúp nhân giống trồng có giá trị tách chiết hóa chất quý mang lại nhiều ý nghĩa mặt thương mại Phương pháp mở rộng tăng khả thu hồi hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, thay từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp sản xuất hợp chất thứ cấp Kỹ thuật nuôi cấy tế bào khởi xướng từ cuối năm 60 kỷ 20 cơng cụ hữu ích để nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật Kỹ thuật phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất sản phẩm có hoạt tính sinh học 3.1 Ưu điểm Có thể cung cấp sản phẩm cách liên tục đáng tin cậy dựa lý sau: - Tổng hợp hợp chất thứ cấp có giá trị diễn điều khiển yếu tố mơi trường ni cấy, độc lập với khí hậu điều kiện đất trồng; - Phủ định ảnh hưởng sinh học đến sản phẩm hợp chất thứ cấp tự nhiên (vi sinh vật côn trùng); - Có thể chọn lọc giống trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau; - Tự động hóa, điều khiển sinh trưởng ba tế bào điều hịa q trình chuyển hóa, chi phí giảm lượng sản phẩm tăng lên Bên cạnh đó, kết nghiên cứu gần cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù thực vật sử dụng để sản xuất sản phẩm protein tái tổ hợp Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận tế bào có khả phát triển điều kiện nuôi cấy tối ưu giúp tăng khả tích lũy vài sản phẩm mức cao Để thu hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta sử dụng nhiều phương pháp khác nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp tế bào nuôi cấy 3.2 Điều kiện tế bào ni cấy tích lũy hợp chất thứ cấp - Tối ưu hóa điều kiện ni cấy - Chọn lựa dòng tế bào suất cao - Bổ sung tiền chất ni cấy - Dùng chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) Ngồi ra, cịn có thơng số hóa học vật lý thành phần pH mơi trường, chất điều hịa sinh trưởng, nhiệt độ ni cấy, thơng khí, lắc khuấy, ánh sáng… Một vài sản phẩm tích lũy tế bào mức cao so với trồng tự nhiên nuôi cấy điều kiện tối ưu Các thông số vật lý yếu tố dinh dưỡng mẻ gần yếu tố cho việc tối ưu hóa hiệu suất ni cấy a, Chọn lọc dịng tế bào cho suất cao: Chọn lọc tế bào dựa vào khả tổng hợp vài hợp chất có giá trị cao ni cấy Berlin Sasse cơng bố năm 1985, sau phương thức ứng dụng rộng rãi Chẳng hạn, dòng tế bào bát tiên sau 24 lần chọn lọc tích lũy gấp khoảng lần lượng anthocyanin sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto cs 1982) Yamada Sato (1981) chọn lọc dòng tế bào Coptis japonica có khả sinh trưởng gấp lần trước sau tuần nuôi cấy lượng berberin đạt tới 1,2 g/L b, Cung cấp tiền chất (precursor feeding): Bổ sung tiền chất trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy tăng lượng sản phẩm mong muốn số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp làm tăng lượng sản phẩm cuối Phương pháp hữu ích dùng tiền chất có giá thành rẻ c, Bổ sung tiền chất nuôi cấy: Bổ sung phenylalanine nuôi cấy tế bào huyền phù Salvia officinalis kích thích tạo rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid nuôi cấy tế bào Vanilla planifolia tăng tích lũy valnillin, bổ sung leucine dẫn đến việc tăng monoterpen dễ bay nuôi cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004) d, Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation): Thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp tự nhiên máy bảo vệ chống lại yếu tố gây bệnh Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành hợp chất thứ cấp Sử dụng elicitor máy bảo vệ cây, tức kích kháng bảo vệ thực vật, phương thức để thu sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cách hiệu Sử dụng elicitor sinh học phi sinh học (được phân loại dựa nguồn gốc chúng) để kích thích hình thành hợp chất thứ cấp q trình ni cấy tế bào, giúp rút ngắn thời gian đạt hiệu suất cao (DiCosmo Tallevi, 1985) Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật sản xuất hoạt chất sinh học nay: 4.1 Taxol (cây thông đỏ Pacific) Ngay từ năm 1971, Wani cộng tìm diterpene amide có khả chống ung thư gọi “taxol” chiết từ thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia) Đến năm 1983, taxol Cục quản lý Dược phẩm Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng ung thư vú Ngoài ra, taxol có tác dụng bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi dạng u bướu xem chất nhóm hóa trị liệu ung thư (Cragg cộng 1993) Tuy nhiên, sử dụng taxol điều trị bị hạn chế tách chiết lượng từ vỏ thông đỏ tự nhiên Lớp vỏ mỏng chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khơ Ở 100 năm tuổi trung bình thu kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng ứng với liều tồn đợt điều trị ung thư Do đó, cần có nguồn khác để thay đáp ứng nhu cầu sử dụng ngày tăng y học Hiện nay, việc sản xuất taxol nuôi cấy tế bào loài Taxus trở thành ứng dụng rộng rãi nuôi cấy tế bào thực vật tạo giá trị thương mại to lớn FettNeto cộng (1994) nghiên cứu ảnh hưởng chất dinh dưỡng số yếu tố khác lên tích lũy taxol nuôi cấy tế bào T cuspidata Srinivasan cộng (1995) nghiên cứu trình sản xuất taxol nuôi cấy tế bào T baccata Lee cs (1995) nghiên cứu sản xuất taxol nuôi cấy tế bào huyền phù T mairei, loài tìm thấy Đài Loan độ cao 2000 m so với mực nước biển Các dòng tế bào thu từ callus có nguồn gốc thân lá, dòng sau bổ sung tiền chất vào mơi trường ni cấy, sau tuần lít dịch huyền phù tế bào có khoảng 200 mg taxol 4.2 Imperatorin (cây Angelica dahurica var) Tsay cs (1994) nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù Angelica dahurica var Formosana Đây loài địa lâu năm Đài Loan, sử dụng để chữa chứng đau đầu bệnh vảy nến Imperatorin xem thành phần hoạt động điều trị bệnh da Nếu sản xuất Angelica dahurica var formosana phương pháp nhân giống truyền thống thời gian dài đáp ứng nhu cầu Vì vậy, phương pháp ni cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin chọn lựa sử dụng Nghiên cứu cho thấy chu kỳ sinh trưởng tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại khoảng 10 14 ngày Benzylamino purine nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L kích thích tổng hợp imperatorin, tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate nitrate (2:1) tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM làm tăng lượng impertatorin Glucose nguồn carbon tốt saccharose fructose hiệu sản xuất imperatorin Vai trò elicitor khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate mơi trường tăng tích lũy imperatorin, định nồng độ thời gian sinh trưởng tế bào Bổ sung vanadyl sulphate nồng độ 30 mg/L vào môi trường cho hiệu tốt sau 10 ngày nuôi cấy Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào mơi trường, q trình tổng hợp imperatorin tăng mạnh ngày nuôi cấy thứ 10 Hàm lượng imperatorin sản xuất phương thức đạt 460 µg khối lượng tươi cao đối chứng 140 lần 4.3 Berberine (rễ Coptis japonica vỏ Phellondendron amurense) Berberine isoquinoline alkaloid có hệ rễ Coptis japonica vỏ Phellondendron amurense Berberine chloride sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa Để thu nguyên liệu thô từ rễ Coptis phải 5-6 năm (Yamada Sato (1981) C japonica) Sau đó, cơng ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) cải thiện suất cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu suất nhiều tới 1,66 g/L (Misawa 1994) 4.4 Diosgenin (cây Dioscorea doryophora) Yeh cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin nuôi cấy tế bào huyền phù Dioscorea doryophora Phương pháp sử dụng cách thay trình tổng hợp steroid Nuôi cấy tế bào huyền phù thiết lập cách đưa callus vào mơi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin 3% Lượng diosgenin thu trường hợp đạt tới 3,2% khối lượng khô Sản xuất diosgenin từ D doryophora nuôi cấy tế bào huyền phù ứng dụng quy mô công nghiệp 4.5 Cryptotanshinone (cây Salvia miltiorrhiza) Miyasaka cs (1989) nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy callus Salvia miltiorrhiza Salvia chi quan trọng họ Lamiaceae vài loài Salvia mọc hoang dại khắp giới dùng làm thuốc dân gian Hiệu BA việc hình thành cryptotanshinone ni cấy callus S.miltiorrhiza khảo sát Callus sơ cấp tạo từ nuôi cấy mảnh tối môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D Callus sau phát triển nhanh mơi trường có 1,0 mg/L 2,4-D 0,5 mg/L BA Kết phân tích HPLC cho thấy callus chứa lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô) Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết lượng cryptotanshinone callus tăng lên Nồng độ cao cryptotanshione thu callus nuôi cấy mơi trường có 0,2 10 mg/L BA ngày 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu cs 2003) chi thuộc họ Solanaceae như: Duboisia, Scopolia, Atropa, Hyoscyamus Datura năm 1960 (Misawa, 1994) Tuy nhiên, hàm lượng scopolamine hyoscyamine tế bào nuôi cấy thường thấp Sau này, Tabata cs (1971) bổ sung tropic acid vào dịch huyền phù nuôi cấy Scopolia japonica lên 15 lần 4.6 Shikonin (rễ Lithospermum erythrorhizon) Shikonin, loại sắc tố đỏ có khả diệt khuẩn, có rễ Lithospermum erythrorhizon Tuy nhiên, người ta tạo dòng tế bào rễ Lithospermum có khả tích lũy đến 15% shikonin hồn chỉnh cơng nghệ ni cấy tế bào sản xuất shikonin Công nghệ cho phép chu kỳ nuôi cấy thu hoạch tới kg hoạt chất giúp giảm nhiều giá thành shikonin 4.7 Anthocyanin (Trái anh đào, bắp cải tím,…) Anthocyanin hợp chất bioflavonoid Sắc tố cung cấp qua màu sắc loại thực vật trái Tác dụng chống ung thư, chống oxi hóa, chống tia tử ngoại, chống viêm Phương pháp chiết anthocyanin từ dâu tằm nước SO2 Kết thu với nước SO2 nồng độ 1100ppm nhiệt độ 60 C cho hàm lượng anthomycin tương đối cao 11 II KẾT LUẬN Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất hợp chất thứ cấp tạo bước tiến xa khoa học thực vật Việc phát triển sử dụng công cụ di truyền hiểu biết ngày sâu sắc chất tế bào phương thức điều hịa q trình chuyển hóa trao đổi chất thứ cấp sở cho việc sản xuất chúng quy mô thương mại Do nhu cầu sử dụng sản phẩm tự nhiên y-dược ngày tăng sản lượng chúng trồng tự nhiên lại thấp thúc đẩy phát triển không ngừng công nghệ nuôi cấy tế bào quy mô lớn Tuy nhiên, đường sinh tổng hợp hợp chất thứ cấp mong muốn thực vật nuôi cấy tế bào quy mơ lớn phức tạp Vì vậy, thông tin mức độ tế bào phân tử q trình chuyển hóa cần thiết cho phát triển sản xuất công nghiệp Nhiều nghiên cứu thực điều kiện khác để giải thích tượng xuất trình sản xuất chất trao đổi thứ cấp từ tế bào thực vật nuôi cấy in vitro Các kết cho thấy hệ thống ni cấy tế bào thực vật có tiềm lớn cho việc khai thác thương mại chất trao đổi thứ cấp 12 III TÀI LIỆU THAM KHẢO Sách “Nhập môn công nghệ sinh học” – NXB Giáo dục – Phạm Thành Hổ Sách “Công công nghệ tế bào” – NXB Đại học Quốc Gia TPHCM – Nguyễn Thị Thủy Tiên Wickremesinhe ERM, Arteca RN (1993) Taxus callus cultures: Intiation, growth optimization, characterization and taxol production Plant Cell Tissue and Organ Culture 35: 181-193 Bảng số liệu: Các hợp chất thứ cấp sản xuất từ nuôi cấy mô tế bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004) 13 ... thuật nuôi cấy tế bào thực vật chiết xuất hợp chất thứ cấp công nghiệp I NỘI DUNG Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật 1.1 Quy trình ni cấy tế bào thực vật Thực vật Mẫu nuôi Mô sẹo Sinh sản dịch nuôi. .. ? ?Sản phẩm thứ cấp nuôi cấy tế bào thực vật? ?? nhóm chúng tơi giúp người đọc có hình dung rõ sản phẩm thứ cấp nuôi cấy tế bào thực vật, ứng dụng hợp chất thứ cấp y dược Đồng thời, hi vọng cung cấp. .. Sinh sản dịch nuôi Thu tế bào So với VSV, nuôi tế bào Thực vật cho sinh sản chậm Nếu nuôi VSV tính phút, giờ, cịn ni cấy tế bào thực vật tính ngày, tháng Ni tế bào thực vật lên men gián đoạn,