Trong những năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật đã không ngừng phát triển và đem lại hiệu quả thiết thực trong công tác chọn tạo và nhân giống cây trồng. Những thành tựu trên đã góp phần to lớn vào việc thúc đẩy sự phát triển nền nông nghiệp công nghệ cao manh tính cạnh tranh trong thị trường quốc tế. Do đó để có cái nhìn hoàn thiện và toàn cảnh hơn về CNSH nuôi cấy mô tế bào thực vật nhóm đã chọn nó làm đề tài báo cáo.Nhằm mục đích tìm hiểu được vị trí và các phương pháp của nuôi cấy mô tế bào thực vật trong nước và ngoài nước.
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG BÀI TIỂU LUẬN : NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT GVHD: PHẠM MINH TUẤN SVTH: BÙI THỊ NGUYỆT NGUYỄN THỊ LÝ PHAN THỊ TRÚC PHƯƠNG TRẦN CHÂU HUỲNH HÀ NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG 2008100325 2008100257 2008100306 2008100245 2008100275 Tp HCM, tháng 12 năm 2012 MỤC LỤC A ĐẶC VẤN ĐỀ B NỘI DUNG 1.KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT 1.1 Sơ lược lịch sử phát triển .5 1.2 Những ưu nuôi cấy mô 1.3 Vai trò CNSH TV tương lai KHÁI NIỆM NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ .6 4.1 Nuôi cấy mô phân sinh 4.2 Nuôi cấy quan thực vật 4.3 Tế bào trần (Protoplast) 4.4 Nuôi cấy phôi .8 4.5 Thụ phấn in-vitro LĨNH VỰC ÁP DỤNG 5.1 Nhân giống vơ tính ni cấy phơi 5.1.1 Nhân giống vơ tính 5.1.2 Nuôi cấy phôi 5.1.3 Phơi hữu tính 5.1.4 Phơi vơ tính 10 5.1.5 Quy trình nhân giống vơ tính in vitro 11 5.2 Biến dị dịng soma ni cấy phơi 14 5.2.1 Khái niệm .14 5.2.2 Phân loại loại biến dị dòng soma .14 5.2.3 Các nguyên nhân gây biến dị dòng soma 15 5.2.4 Tác động yếu tố trình ni cấy 15 5.2.5 Cơ chế tạo biến dị dòng soma 16 5.2.6 Khả ứng dụng chọn lọc dòng tế bào soma .17 5.2.7 Chọn lọc biến dị soma 17 5.2.8 Xác định biến dị nuôi cấy mô 17 5.3 Kỹ thuật tạo đơn bội 17 5.3.1 Khái niệm chung đơn bội 17 5.3.2 Tình hình nghiên cứu đơn bội nước .18 5.3.3 Tạo đơn bội nuôi cấy bao phấn, hạt phấn 19 5.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy bao phấn hạt phấn 19 5.3.5 Chọn lọc đơn bội 20 5.3.6 Tạo đơn bội nuôi cấy noãn chưa thụ tinh .20 5.4 Lĩnh vực khác 23 5.4.1 Làm bệnh vius nuôi cấy mô phân sinh (meristem) 23 5.4.1.1 Tác hại virus .23 5.4.1.2 Nuôi cấy meristem làm virus cho trồng .24 5.4.1.3Các kỹ thuật làm virus in vitro 26 C KẾT LUẬN 32 D TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 A ĐẶC VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, nuôi cấy mô tế bào thực vật không ngừng phát triển đem lại hiệu thiết thực công tác chọn tạo nhân giống trồng Những thành tựu góp phần to lớn vào việc thúc đẩy phát triển nông nghiệp công nghệ cao manh tính cạnh tranh thị trường quốc tế Do để có nhìn hồn thiện tồn cảnh CNSH ni cấy mơ tế bào thực vật nhóm chọn làm đề tài báo cáo.Nhằm mục đích tìm hiểu vị trí phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật nước nước B NỘI DUNG KHÁI QUÁT VỀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT 1.1 Sơ lược lịch sử phát triển Cuối kỉ XIX người thử tách tế bào thực vật nuôi cấy mô thực vật đến năm 1930-1940 có kết ban đầu hoàn thiện dần đến nay.Sự phát triển CNSH TV chia thành giai đoạn: -Giai đoạn I (1902-1930):Thử nghiệm ban đầu -Giai đoạn II (1934-1954): Năm 1937,Gautheret nuôi thành công mô tế bào cà rốt -Giai đoạn III (1957-1992): Thực tách nuôi tế bào đơn -Giai đoạn IV: Ứng dụng thành tựu vào sản xuất với quy mô lớn diện rộng 1.2 Những ưu nuôi cấy mô - Vi nhân giống nuôi cấy mô - Chọn giống invitro dựa công nghệ tế bào - Khai thác hóa chất ni cấy tế bào đơn 1.3 Vai trò CNSH TV tương lai Sự bùng nổ dân số toàn cầu kỉ XX mang lại hậu bi thảm cho hành tinh Đây thách thức nhân loại kỉ XXI tăng sản lượng lương thực gấp đơi nơng nghiệp bền vững.CNSH TV đóng vai trò quan trọng việc giải vấn đề nêu Trong 50 năm qua, nhờ cách mạng xanh tiến CNSH TV, sản xuất lương thực tăng nhanh kịp đà bùng nổ dân số đảm bảo đủ nhu cầu lương thực,mặc dù cịn nạn đói Năm 2001,hơn 5,5 triệu nhà nơng canh tác khoảng 52,6 triệu trồng biến đổi gen (GMO) Ngồi nhiệm vụ trên, CNSH TV cịn phải gánh vác ngành sản xuất với mục tiêu: tăng sinh khối để sản xuất lượng thay nguồn dầu mỏ Phát triển hóa học xanh để mặt cung cấp sinh khối cho sản xuất hóa chất, mặt khác phải biến thực vật thành nhà máy hóa chất KHÁI NIỆM Là kỹ thuật cấy tế bào thực vật phân lập hay mảnh mô thực vật tách rời môi trường dinh dưỡng điều kiện vơ trùng NGUN TẮC Mơi trường gồm có chất bản: - Các chất vô đa lượng: N (NO3 NH4 ), P, K, S, Ca Mg - Các nguyên tố vi lượng: Fe,Mn,Zn,Br, Cu, Co Mo - Các vitamin: nhiều loại (nicotinic acid, biotin,…) mà quan trọng thiamine (vitamin B1) dạng thiamine – HCl - Nguồn carbon: sucrose glucose - Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật: Các auxin cytokin kích thích phân bào,kiểm sốt biệt hóa tế bào phát sinh hình thái Các auxin thường dùng: 2,4-D (2,4 Dichlorophenoxyacetic),IAA (indole 3-acetic acid),IBA (indole 3-butyric acid).Các cytokinin có Bap (6- benzylaminopurine), zea (zeatin), Ngồi cịn có GA (gibberllic acid) ABA (abscisic acid) Agar sử dụng cho môi trường đặc Hệ thống chiếu sáng hợp lí cần cho phát triển thực vật PHƯƠNG PHÁP NI CẤY 4.1 Ni cấy mơ phân sinh Mẫu cho ni cấy có nhiều loại, thường dùng đỉnh sinh trưởng (meristem) Công việc tiến hành theo trình tự: mẫu cấy khử trùng bề mặt rửa mẫu nhiều lần cho chất sát trùng môi trường nuôi tạo mô sẹo tạo cụm chồi nhân giống Meristem cắt, khử trùng đặt môi trường thạch hộp petri hay chai lọ vơ trùng Nếu mơi trường thích hợp mẫu cấy có tế bào sống phân chia tạo thành khối lên gọi mô sẹo Thời gian hình thành mơ sẹo thường sau 3-8 tuần cấy mẫu Việc hình thành mơ sẹo có tầm quan trọng then chốt q trình ni cấy mơ tế bào thực vật Ở giai đoạn sử dụng mô sẹo theo hướng khác nhau: Tạo cụm chồi: Nếu để tiếp chồi mọc lên thành cụm chồi phát triển thành Có thể tách chồi để chúng mọc rễ đưa trồng Tách nhiều phần nhất: Có thể tách mơ sẹo non thành nhiều dòng thứ cấp (subculture ) tiếp tục nhân khối tế bào tăng trưởng nhanh để phục vụ cho nhiều mục đích khác tạo tế bào trần ( protoplast) hay xử lý thành tế bào rời để nuôi tế bào đơn 4.2 Nuôi cấy quan thực vật Đặt mảnh meristem vào mơi trường khơng có kích thích tố sinh trưởng thực vật tự mọc lên cấu trúc tương tự chồi Nếu môi trường bổ sung cytokinin, mẫu mọc chồi nhánh nách sẹo tạo cụm chồi Các cụm chồi tách thành cụm thứ cấp cung cấp đủ dinh dưỡng chúng phát triển thành tách thêm nhân giống tiếp Nhân giống kiểu gọi vi nhân giống ứng dụng vào sản xuất Rễ nhân liên tục theo cách tương tự, khác bổ sung auxin vào môi trường 4.3 Tế bào trần (Protoplast) Nếu tế bào mô sẹo xử lý hai enzyme cellulose pectinase làm tiêu hủy tế bào nhận tế bào trần, mà chúng thường có dạng khối cầu Các tế bào trần, chí khác lồi, kết hợp tạo tế bào lai trình gọi dung hợp tế bào trần (proplast fusion) Tế bào trần tạo nhiều cách: từ dịch huyền phù tế bào; từ mô sẹo hay mô tươi nguyên trạng qua tác động pectinase cellulose Pectinase cắt mảnh mô rời tế bào riêng lẻ cellulose làm tan vách tế bào Các tế bào trần để môi trường dinh dưỡng sau 5-10 ngày tạo vách tế bào phân chia Ni mơi trường lỏng tế bào trần không phân chia 4.4 Nuôi cấy phôi Khi mơi trường ni giàu kích thích tố tăng trưởng ( auxin cytokinin) tế bào biệt hóa mơ sẹo hình thành Ngược lại, mơi trường giảm nồng độ chất điều hòa tăng trưởng có hình thành nhiều cấu trúc tái biệt hóa phơi soma, chồi hay rễ Dựa vào khả tái sinh này, điều khiển phát triển mô sẹo nhau: Tạo phôi soma mơi trường với nồng độ kích thích tố định Vi nhân giống: nồng độ auxin cytokinin thấp tạo cụm chồi tách cụm tách mẫu đem nhân giống tiếp Tạo thân cho cytokinin nhiều môi trường Tạo rễ auxin có nhiều mơi trường Một ví dụ minh họa rõ ứng dụng phương pháp việc nuôi rễ nhân sâm cấy mô Cây nhân Nuôi cấy nhân sâm sâm tạo chất sâm saponin chủ yếu rễ Dùng nuôi cấy mơ cho nhiều auxin kích thích tạo rễ thu nhiều saponin với thời gian nhanh nhiều so với tự nhiên 4.5 Thụ phấn in-vitro Thụ phấn in-vitro q trình tạo hợp tử khơng phụ thuộc thể mẹ Được sử dụng cho: thụ phấn nõan, thụ phấn bầu quả, thụ phấn giá noãn, thụ phấn núm nhụy Quy trình: thu nhập nỗn chưa thụ tinh cấy noãn thụ phấn thụ tinh cho tế bào trứng.Ở chúng tơi nói sơ lược thụ phấn in-vitro chi tiết sẻ trình bày nhân giống vơ tính ni cấy phơi LĨNH VỰC ÁP DỤNG 5.1 Nhân giống vơ tính ni cấy phơi 5.1.1 Nhân giống vơ tính Nhân giống vơ tính phương pháp nhân lên tạo thể dựa theo sinh sản vơ tính, nghĩa phương pháp tạo nhân lên tạo thể từ tế bào, mô, quan thể bố mẹ 5.1.2 Nuôi cấy phôi Phôi nhóm tế bào có khả phát triển tạo thành thể hoàn chỉnh pha phát triển trung gian hợp tử hay tế bào soma bào tử thể Có hai loại phơi: Phơi hữu tính phơi vơ tính 5.1.3 Phơi hữu tính ( Kĩ thuật cứu phơi ) Phơi hữu tính: hình thành phát triển từ tế bào sinh dục sau thụ tinh đôi xảy ra: hạt phấn thụ tinh với noãn thành lập hợp tử lưỡng bội, loạt phân cắt đẳng nhiễm xảy ra, hợp tử phát triển thành phôi ( bào tử thực vật mới) Sự lai loài thường tạo lai có ưu tổ hợp di truyền, lai thường tạo hột không sống lâu Sự nuôi cấy in vitro để phát triển phơi từ nỗn thụ tinh lai dùng theo phương pháp gọi cứu phôi lai (hay nói tắt cứu phơi) Thí dụ, lai hai loài Cỏ ba Trifolium ambiguum Trifolium repens thuộc họ Ðậu (Fabaceae) sử dụng để tạo nguồn giống cỏ cho đồng cỏ New Zealand Loài đậu cha mẹ tự thụ phấn; phơi bình thường phát triển từ hình cầu, hình tim đến hình trái ngư lơi trưởng thành Tuy nhiên, phơi từ lai hai lồi hai ngày đầu sau thụ phấn chúng tăng trưởng nhanh, sau chậm lại dừng lại giai đoạn hình tim phơi có khoảng 1.000 tế bào Q trình phát triển phơi bị ngưng lại gen gây hại hoạt động, chúng hoạt động khóa ngăn chận cung cấp chất dinh dưỡng đến để nuôi phôi Một số kỹ thuật cứu phôi sử dụng thành công Ghép phôi lai vào phơi nhũ bình thường lấy phơi Phơi cấy trực tiếp môi trường nhân tạo với chất dinh dưỡng cung cấp theo yêu cầu Kỷ thuật cứu phôi tạo cỏ Ba lai (Hình 16) 5.1.4 Phơi vơ tính( phơi sơma ) Phát sinh từ tế bào sinh dưỡng 2n bố mẹ, có cấu trúc phơi gọi phơi vơ tính ( phơi soma) Đều phát triển qua giai đoạn trước trưởng thành: Hình cầu, Hình tim, Hình thủy lơi 10 Một số ý nuôi cấy bao phấn hạt phấn:hạt phấn tách rời thường phát sinh phôi trực tiếp, môi trường nuôi cấy bao phấn hạt phấn thường bổ sung axitanim- chất điều tiết sinh trưởng 5.3.5 Chọn lọc đơn bội Có thể xác định đơn bội cách kiểm tra số lượng nhiễm sắc thể tế bào, đo gián tiếp hàm lượng ADN tế bào, trồng tái sinh so sánh với mẹ , hình thái kích thước khả sinh trưởng 5.3.6 Tạo đơn bội ni cấy nỗn chưa thụ tinh Khái niệm: Sự hình thành đơn bội từ noãn chưa thụ tinh gọi sinh sản đơn tính hay trinh nữ sinh Cây đơn bội từ ni cấy nỗn chưa thụ tinh hình thành kích thước tế bào trứng hay tế bào cực, tế bào đối cực, tế bào kèm noãn phát triển tái sinh tạo thể đơn bội 21 Một số nhân tố ảnh hưởng: Tách nỗn khó khăn dễ gây tổn thương, để tạo hiệu người ta tập trung yếu tố nghiên cứu kiểu gen mẹ , giai đoạn phát triển túi phôi, chế độ xử lý nhiệt độ, môi trường nuôi cấy Kiểu gen mẹ nhân tố quan trọng đơn bội từ noãn chưa thụ tinh Giai đoạn phát triển noãn giai đoạn túi phôi thành thục giai đoạn phù hợp có hiệu ni cấy nỗn Mơi trường nuôi cấy để cảm ứng sinh tinh cần phải bổ sung vào môi trường chất điều tiết sinh trưởng thực vật, nồng độ môi trường nuôi cấy lúa, ví dụ: lúa nồng độ thích hợp 3-6% 22 Điều kiện ni cấy thường ổn định nhiệt độ 25- 280C 5.4 Lĩnh vực khác 5.4.1 Làm bệnh vius nuôi cấy mô phân sinh (meristem) 5.4.1.1 Tác hại virus Trong giới lồi sinh vật giới lồi vi sinh vật vơ đa dạng phức tạp mà đến cịn nhiều lồi mà người chưa biết đến Người ta thường phân vi sinh vật thành hai loại vi sinh vật có tác dụng tốt cho người vi sinh vật có hại cho người Trong giới vi sinh vật virus loại nguy hiểm Đối với người loài động thực vật khác nhiễm bệnh virus khơng có loại thuốc chữa được, mà phụ thuộc vào khả đề kháng thể Vì vậy, để đề phịng chống lại tác hại virus người ta tạo loại vacxin thuốc kháng sinh nhằm tăng cường sức đề kháng cho thể 23 Phổ tác dụng virus lớn Nó khơng tác động đến người, động vật, chí vi sinh vật khác Trong nông học, quan tâm chủ yếu đến thực vật đối tượng chủ yếu sản xuất nơng nghiệp Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus thực vật mà người biết đến, có 80 loại truyền qua hạt giống Bệnh virus hại thực vật loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vơ tính (do tồn mơ sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng rệp, bọ phấn, nhện,v.v.), qua tiếp xúc giới (vết cắt, xây xát,v.v) Tác hại virus vô lớn Nó ảnh hưởng trực tiếp tới suất phẩm chất nông sản: -Virus gây bệnh khoai tây (PLRV) virus Y (PVY) làm giảm 95% suất -Virus X (PVX) làm giảm suất từ 5-75% tùy thuộc vào dòng virus mức độ nhiễm bệnh -Năng suất khoai lang giảm 40-65% với bị virus chân chim 5.4.1.2 Nuôi cấy meristem làm virus cho trồng Việc tạo giống bệnh biện pháp bắt buộc phải tiến hành cho tất nhân giống vơ tính biện pháp phục tráng giống cho giống bị thối hóa virus Công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật cơng cụ hữu hiệu Có hai cách để tạo virus nhờ công nghệ này: -Dùng phương pháp chẩn đoán bệnh virus để lọc mẫu nhiễm bệnh trước đưa vào nuôi cấy, sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân nhanh mẫu -Làm virus mẫu bị nhiễm, sau tạo mẫu tiếp tục sử dụng biện pháp nhân nhanh in vitro để nhân mẫu Nguyên lý làm virus qua nuôi cấy meristem Virus tồn tế bào sống Tuy nhiên, nghiên cứu cuả White (1934), Limasset Cornuet (1950), Morel Martin (1952) cho thấy: nồng độ virus tế bào bị bệnh phụ thuộc tốc độ phân chia tế bào khả sinh trưởng tế bào Tế bào phân chia mạnh nồng độ virus thấp, nghĩa tế bào gần đỉnh sinh trưởng chứa virus 24 Từ đây, ông đề xuất kỹ thuật: nuôi cấy meristem (mô phân sinh đỉnh) để tạo hoàn toàn virus từ nhiễm bệnh Cụ thể: White(1934) sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo để nghiên cứu phân bố virus rễ cà chua bị bệnh virus Aucuba gây khảm Kết cho thấy 2cm đầu rễ không phát virus Limasset Cornuet (1950) dùng phương pháp huyết định lượng, chứng minh tồn gradient nồng độ virus từ mô non đến mô già thuốc bị bệnh Nồng độ virus không mô già thuốc bị bệnh Nồng độ virus không mô phân sinh đỉnh bao thứ sau tan dần, đạt cực đại thứ năm giảm dần già phía Gỉa thuyết khơng tồn virus meristem Theo Mathews (1970), Wang et Hu (1980): meristem (mơ phân sinh đỉnh) khơng có virus đa lý sau: Virus vận chuyển chủ yếu nhờ hệ thông mô dẫn, hệ thống khơng có mơ phân sinh Trong phân chia, tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép chép thông tin di truyền virus Nồng độ auxin-cytokinin cao đỉnh sinh trưởng ngăn cản q trình chép virus Hệ thống vơ hiệu hóa virus vùng meristem mạnh vùng khác 25 5.4.1.3 Các kỹ thuật làm virus in vitro a) Nuôi cấy meristem Tách xác meristem có kích thước