NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Nuôi cấy mô thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Bằng các kỹ thuật nuôi cấy người ta đã nhân giống in vitro thành công nhiều loài cây trồng có giá trị.Ở nước ta lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhưng mới chỉ được nghiên cứu ở các viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viện Lúa đông bằng sông Cửu Long…và một số chương trình từ dự án quốc gia và quốc tế và thành công trong việc chuyển một số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô, cải bắp…Nhìn sang các nước khác chúng ta thấy công nghệ sinh học của Việt Nam còn đi một khoảng cách khá xa so với Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ…

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM Khoa Công nghệ sinh học Kỹ thuật môi trường - - TIỂU LUẬN Đề tài: Nuôi cấy mô thực vật MỤC LỤC 1.Đặt vấn đề 2.Sơ lược lịch sử hình thành phát triển - 3.Khái niệm 4.Ứng dụng - 5.Thành tựu-Thực tiễn nuôi cấy mô Việt Nam - 6.Cơ sở khoa học nuôi cấy mô thực vật - 7.Hướng phát sinh hình thái nuôi cấy 10 8.Quy trình nuôi cấy mô thực vật 12 9.Các yếu tố ảnh hưởng đến trình nuôi cấy mô thực vật -13 9.1.Môi trường vật lý 14 9.2.Vật liệu nuôi cấy 15 9.3.Môi trường nuôi cấy 16 9.4.Điều kiện vô trùng 23 10.Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật 24 11.Các kỹ thuật dùng nuôi cấy mô thực vật 27 11.1.Thụ phấn in vitro -27 11.2.Dung hợp tế bào trần 27 11.3.Tạo dòng biến dị soma 28 11.4.Tạo dòng đơn bội 30 11.5.Chuyển gen -31 12.Cây trồng chuyển gen (GMO) 34 13.Dụng cụ, hệ thống thiết bị nuôi cấy mô thực vật -37 13.1.Hệ thống Bioreactor -38 13.2.Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS) -40 14.Những thận lợi khó khăn nuôi cấy mô thực vật Việt Nam -43 15.Kết luận - Ý nghĩa khoa học 44 16 Tài liệu tham thảo 45 Đặt vấn đề Nuôi cấy mô thực vật lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công bật công nghệ sinh học thực vật Bằng kỹ thuật nuôi cấy người ta nhân giống in vitro thành công nhiều loài trồng có giá trị So sánh ưu nhược điểm phương pháp nhân giống vô tính: Ưu điểm: Nhược điểm: - Hệ số nhân giống thấp - Cây không đảm bảo Tách cây, chiết cành, giâm cành, ghép bệnh virus - Đơn giản, dễ làm - Phụ thuộc vào mùa vụ - Chi phí thấp - Tốn công lao động, đất đai - Sử dụng phổ biến thời gian - Một số trồng không áp dụng cành - Cây giống dễ bị thoái hoá qua số hệ - Hệ số nhân giống nhanh - Cho cá thể tương đối - Chi phí cao so với phương đồng mặt di truyền pháp nhân giống vô tính khác nên - Có thể nhân giống trồng giá thành không cạnh tranh Nuôi mô vật cấy quy mô công nghiệp (kể - Không phải loại thực đối tượng khó nhân vi nhân giống phương pháp thông thường) - Một số loài trồng dễ bị - Chủ động kế hoạch sản xuất biến dị nhân giống in vitro - Tạo virus - Hiện tượng thủy tinh thể, bạch - Các sau nhân in vitro có tạng xu hướng trẻ hóa Hình: Cây dừa cho suất cao thuốc kháng virus CMV Bằng cách người ta tạo giống trồng ấy? 2.Sơ lược lịch sử hình thành phát triển Trên giới: Nuôi cấy mô thực vật nhà khoa học tiến hành vào cuối kỷ XIX Quá trình phát triển tạm chia thành giai đoạn: - Giai đoạn 1902 – 1933: Khởi xướng thử nghiệm - Giai đoạn 1934 – 1965: + Nghiên cứu sinh lý phát sinh hình thái + Phát hoocmon sinh trưởng + Xây dựng môi trường bản: MS, N6, B5 - Giai đoạn 1965 - đến nay: + Nghiên cứu di truyền +Ứng dụng thành tựu vào sản xuất Bảng: Những mốc lịch sử phát triển nuôi cấy mô thực vật Haberlandt lần thí nghiệm nuôi cấy mô mầm 1902 không thành công Haberlandt G., Sitzungsber Akad Wiss Wien, Math.Naturwiss Kl., 111: 69-92 1904 1934 Hannig tiến hành thí nghiệm nuôi cấy phôi loài họ cải Crucifers Hannig B., Bot Zeitung, 62: 45-80 Kogl lần xác định vai trò IAA, hoocmon thực vật có khả kích thích tăng trưởng phân chia tế bào Kogl F Et al., Z Physiol Chem., 228: 90-103 Gautheret, Nobecourt White lần nuôi cấy mô sẹo thành công thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) cà rốt 1939 thuốc Gautheret R J., C R Acad Sci (Paris), 208: 118 -120; Nobecourt P., C R Soc Biol (Paris), 130: 1270-1271; White P R., Am J Bot., 26: 59-64 Gautheret lần theo dõi hình thành chất trao đổi thứ cấp 1942 nuôi cấy mô sẹo thực vật Gautheret R J Bull Soc Chim Biol 41: 13 1944 1946 1950 1951 Skoog lần nghiên cứu hình thành chồi phụ từ nuôi cấy mô thuốc in vitro Skoog F., Am J Bot., 31: 19-24 Sự tạo từ đỉnh chồi Lupinus Tropaeolum Ball E., Am J Bot., 33: 301-318 Lần nuôi cấy thành công mầm nước dừa Morel G C R Acad Sci., 230: 2318-2320 Nitsch lần nghiên cứu nuôi cấy noãn tách rời in vitro Nitsch J P., Am J Bot., 38: 566-577 Morel Martin lần tạo Dahlia virus nuôi 1952 cấy đỉnh sinh trưởng Morel G and Martin C., C R Hebd Seances Acad Sci (Paris), 235: 1324-1325 1952 Morel Martin lần thực vi ghép in vitro thành công Morel G and Martin C., C R Acad Sci (Paris), 235: 1324-1325 Tulecke lần thành công nuôi cấy bao phấn tạo mô sẹo 1953 đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba Tulecke W R , Science, 117: 599 600 Tulecke lần thành công nuôi cấy bao phấn tạo mô sẹo 1953 đơn bội từ hạt phấn Ginkgo biloba Tulecke W R , Science, 117: 599 600 Skoog Miller khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ chất auxin : 1957 cytokinin môi trường phát sinh quan (rễ chồi) Skoog F and Miller C O., In vitro Symp Soc Exp Biol., No 11: 118131 1959 1960 Reinert Steward lần tạo phôi vô tính từ nuôi cấy mô cà rốt Cocking lần sử dụng enzym phân giải thành tế bào để tạo số lượng lớn tế bào trần Cocking E C., Nature, 187: 927-929 Murashige Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực 1962 vật- môi trường MS Murashige T and Skoog F., Physiol Plant., 15: 473-497 Guha Maheshwari lần thành công tạo đơn 1964 bội từ nuôi cấy bao phấn cà rốt Guha S and Maheshwari S C., Nature, 204: 497 and Nature, 212: 97-98 (1966) Carlson cs tạo từ lai xa tế bào trần nhờ dung hợp 1972 tế bào trần loài thuốc Nicotiana glauca N langsdorfii Carlson P S et al., P N A S (USA), 69: 2292-2294 1977 Chilton cs chuyển thành công T-DNA vào thực vật Chilton M D et al., Cell, 11: 263-271 Tabata cs nuôi tế bào thực vật quy mô công nghiệp phục vụ sản 1978 xuất shikonin (chọn lọc dòng tế bào cho sản lượng sản phẩm thứ cấp cao hơn) Tabata M et al., Frontiers of Plant Tissue Culture 1978, Univ Calgary Press, Calgary,: 213-222 Marton cs xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần 1979 đồng nuôi cấy tế bào Agrobacterium Marton L et al., Nature, 277: 129-131 1982 Zimmerman sử dụng kỹ thuật xung điện dung hợp tế bào trần Zimmermann U., Biochim Biophys Acta, 694: 227-277 Công ty Mitsui Petrochemicals lần sản xuất chất trao đổi 1983 thứ cấp quy mô công nghiệp nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp Mitsui Petrochemicals Chuyển gen vào tế bào trần mầm hai mầm 1985 phương pháp điện thẩm Fromm M E., P N A S (USA), 82: 58245828 1986 1988 Crossway cs chuyển gen vào tế bào trần thuốc vi tiêm AND trực tiếp Crossway A et al., Mol Gen Genet., 202: 179-185 Klein cs tái sinh chuyển gen ổn định thông qua phương pháp bắn gen Klein T M et al., P N A S (USA), 85: 4305-4309 Ở Việt Nam: - Công nghệ nuôi cấy mô thực vật du nhập vào nước ta từ năm 1960, thực phát triển từ năm 1980 - Sau 1975, phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật xây dựng viện Sinh vật học, viện Khoa học Việt Nam tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu 3.Khái niệm: Nuôi cấ y mô thư ̣c vâṭ (plant tissue culture): trì và nuôi dưỡng tế bào, mô, quan, hay hoàn chỉnh của thư ̣c vật điề u kiện in vitro Tất dạng nuôi cấy mô tiến hành qua hai bước : - Các phần thực vật quan thực vật tách khỏi phần lại, tách rời tế bào, mô hay quan - Các phần tách khác nói phải đặt môi trường thích hợp để bọc lộ hết khả đáp ứng Nguyên liệu (mẫu nuôi cấy) dùng nuôi cấy mô như: rễ, lá, thân, hoa, hạt phấn, túi phấn, noãn, tế bào thực vật 4.Ứng dụng: - Nhân giống - Chọn tạo giống trồng - Khác: Nhân nhanh, phục tráng giống, sản xuất chất thứ cấp, làm virut, trì bảo quản nguồn gen quý, nghiên cứu di truyền đột biến… Hình: Nhân giống lan Hồ Điệp Viện Lúa Đồng sông Cửu Long 5.Thành tựu-Thực tiễn nuôi cấy mô Việt Nam: - Ở nước ta lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô thực vật lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen trồng Nhưng nghiên cứu viện, phòng thí nghiệm, mà chưa sản xuất quy mô lớn, đại trà viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viện Lúa đông sông Cửu Long…và số chương trình từ dự án quốc gia quốc tế thành công việc chuyển số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào số lúa, ngô, cải bắp…Nhìn sang nước khác thấy công nghệ sinh học Việt Nam khoảng cách xa so với Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ… - Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô có bước đột phá mới: Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý khỏi nguy tuyệt chủng đặc biệt loài lan Hài hồng - loài lan hài có hương thơm giới…Việt Nam trở thành nước sản xuất phong lan lớn khu vực (20/02/2007) - Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn giống Bạch Đàn Europhylla Việt Nam bảo tồn thành công nguồn gene loại gỗ quý như: Vù hương - Loại gỗ chiết tinh dầu dùng dược, mỹ phẩm, Đăng lấy gỗ, trầm hương, Chè vang - loại chè khó trồng Lai tạo thành công giống lúa chịu hạn DR1, nhân nhanh nhiều loại hoa lan, mía , khoai tây virut… - Trung tâm Ứng dụng chuyển giao tiến công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc nhân giống thành công Lô hội - loài dược liệu quý địa phương - Ngày 16/5/2009, Lâm trường Tiền Phong, tỉnh Thừa Thiên-Huế, cho biết tỉnh vừa đầu tư xây dựng đưa vào hoạt động nhà nuôi cấy mô, có công suất triệu cây/năm để phát triển trồng rừng - Viện Sinh học Nông nghiệp Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội 50 sở chuyên môn nuôi cấy mô tế bào, bước đầu sở đạt kết tốt: nuôi cấy loài Phong lan, dứa Cayen, khoai tây giống siêu bệnh… Hầu hết phòng nuôi cấy mô có sản phẩm đầu liên tục ổn định… - Dự án “Xây dựng sở ứng dụng, sản xuất giống sản phẩm trồng chất lượng cao” khởi công năm 2003, với hệ thống nhà kính với trang thiết bị hiên đại rộng hàng ngàn mét vuông Dự án Trung tâm kĩ thuật rau thuộc sở Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn Hà Nội đăng kí cấp thành phố 6.Cơ sở khoa học nuôi cấy mô thực vật: Tính toàn năng: Là khả hình thành hoàn chỉnh tế bào, mô hay quan gặp điều kiện thuận lợi, tế bào có chứa gen mang toàn thông tin di truyền giống mẹ Sự phân hóa-phản phân hóa tế bào: + Phân hóa: từ tế bào ban đầu biến đổi thành tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho mô, quan khác + Phản phân hóa: tế bào phân hóa thành tế bào chuyên biệt quay dạng tế bào phôi sinh ban đầu gặp điều kiện thuận lợi Hướng phát sinh hình thái nuôi cấy: Gồm phương thức bản: - Hình thái rễ, rễ hình thành chồi - Hình thành chồi, sau hình thành rễ từ chồi - Hình thành mô sẹo, sau sản sinh chồi rễ, cấu trúc liên tiếp thành trục thấp ví dụ cà rốt - Hình thành thể dinh dưỡng khác thân củ, thân vẩy hình thành hình cầu, ví dụ tạo củ lily, lay ơn, protocorm hoa lan - Hình thành chồi hoa phận quan sinh sản, nuôi cấy tế bào trụ phôi phong lan tế bào nuôi cấy phân hóa thành hạt phấn noãn Hình: Sơ đồ phân hóa mẫu mô trực tiếp tạo chồi hoàn chỉnh (thông qua phương thức tăng khả phát sinh chồi nách) 10 Bảng: Phân ly tính trạng F2 dị hợp n n n N 2 4 16 27 64 16 81 256 … … … 12 4.096 531.441 16.777.216 … … … Trong đó: n: số gen có chứa alen khác hai nhiễm sắc thể đồng dạng F1 n : số giao tử khác hệ gen (genome); số kiểu gen đồng hợp nhận F2; số kiểu gen đồng hợp nhận phương pháp tạo từ hạt phấn F2 n : Số kiểu gen khác nhận F2 n : Tổng số kiểu gen nhận F2 theo lý thuyết Theo sơ đồ, phương pháp tạo từ hạt phấn nhận bốn kiểu gen (genotype) đồng hợp khác nhau, xác suất xuất kiểu gen (AABB) 1/4 Nếu so với phương pháp chọn lọc thông thường xác suất xuất kiểu gen AABB 1/16 Vì vậy, phương pháp tạo từ hạt phấn dòng lai F1 không rút ngắn thời gian tạo giống mà đơn giản hóa trình chọn giống 11.5.Chuyển gen: Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích hình thành chất độc có chất phenolic Chất có tác dụng làm lành vết thương, dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có vai trò chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Tiplasmid kích thích cho cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái bờ phải) để gắn 31 vào gen thực vật Trong T-ADN có chứa vùng gen quan trọng quy định hình thành khối u Phân tích u cho thấy u có hình thành số vật chất như: nopaline, octoine gọi chung opine Các chất không tồn bình thường khác Chuyển gen trực tiếp: - Phương pháp chuyển gen qua ống phấn Nguyên tắc lợi dụng ống phấn để chuyển vector mang gen tế bào sinh dục đực( tinh tử) để kết hợp với tế bào trứng tạo hợp tử mang gen ngoại lai chuyển vào Chuyển gen qua ống phấn thực sau trình thụ tinh xảy noãn, tế bào sinh dục chưa kịp phân chia - Phương pháp sử dụng súng bắn gen Nguyên tắc tạo luồng khí để đẩy viên đạn có kích thước nhỏ mang gen mong muốn( viên đạn thường làm Au volfram) Chúng có V= 1300m/s xuyên qua lớp tế bào, mô để xâm nhập vào gen thực vật - Phương pháp biến nạp qua protoplast Sau tách, protoplast xử lý nhẹ siêu âm có diện DNA ngoại lai Sóng siêu âm làm Protoplast bị thủng số chỗ, giúp DNA vào tế bào thể - Phương pháp điện di Vật liệu chuyển gen thường đỉnh sinh trưởng, phôi hạt hay phôi soma (2mm) hòa với hỗn hợp agarose - đệm (cực dương) Dùng dòng điện có cường độ 0.5 milliampe – 1.0 milliampe đẩy DNA ngoại lai khỏi hỗn hợp agarose – ADN đệm (cực âm), gen xâm nhập vào gen thực vật - Phương pháp vi tiêm Sử dụng vi tiêm nhỏ, kính hiển vi vi thao tác chuyển vector mang gen vào protoplas tế bào đơn (chưa hình thành vỏ cứng) - Phương pháp hóa học Khi có mặt (Polyethylen glycol) PEG màng TB trần bị thay đổi TB trần thu nhận gen ngoại lai 32 Hình: Thiết kế vector mang gen dòng Agrobacterium tumefaciens nhân dòng vector nhờ vi khuẩn E.coli Hình: Quy trình chuyển gen vào thực vật nhờ vi khuẩn A.tumefaciens súng bắn gen 33 Hình: Nguyên lý hoạt động súng bắn gen phương pháp vi tiêm 12.Cây trồng chuyển gen (GMO) Hình: Sơ đồ điện tích trồng biến đổi gen giới 34 Các hướng nghiên cứu - Chuyển gen kháng nấm gây bệnh - Chuyển gen cải tiến protein hạt - Chuyển gen kháng vi khuẩn gây bệnh - Chuyển gen sản xuất protein - Chuyển gen kháng virus gây bệnh - Chuyển gen mang tính bất thụ đực - Chuyển gen kháng côn trùng phá hoại - Chuyển gen sản xuất acid béo thiết yếu - Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ - Làm đất ô nhiễm - Làm thức ăn chăn nuôi Bảng trồng quan trọng phát triển Sản phẩm Đặc điểm Cải dầu Chống chịu chất diệt cỏ, hàm lượng laurate, oleic acid cao Ngô Chống chịu chất diệt cỏ, kháng côn trùng Bông Chống chịu chất diệt cỏ, kháng côn trùng Khoai tây Kháng côn trùng, kháng virus Đậu tương Chống chịu chất diệt cỏ, hàm lượng oleic acid cao Bí Kháng virus Cà chua Chín chậm Lúa Chống chất diệt cỏ, sản xuất vitamin A Đu đủ Kháng virus Bảng loại trồng phát triển Sản phẩm Đặc điểm Táo Chín chậm kháng sâu bệnh Chuối Kháng virus, giun tròn, nấm chín chậm Dứa Khấng sâu bọ, virus chín chậm Khoai lang Kháng virus Dừa Tăng hàm lượng lauric acid 35 Hình: Đu đủ chuyển gen kháng virus giống lúa vàng giàu vitamin A Hình: “ Siêu cà chua” đẩy lùi ung thư thuốc làm nhiên liệu Hình: Ngô mang gen Bt (chống sâu hại) hoa cúc đa dạng màu 36 Tình hình sản xuất thực vật chuyển gen giới: - Từ năm 1996 đến năm 2003, diện tích trồng biến đổi gen tăng 40 lần ( từ 1,7 triệu ha/1996 lên 67,7 triệu ha/2003) Trong đó, diện tích nước phát triển chiếm 1/3 diện tích trồng biến đổi gen giới - Năm 2003, hai trồng giữ vị trí hàng đầu đậu tương kháng thuốc diệt cỏ ( 41,4 triệu ha) ngô Bt với diện tích 9,1 triệu - Ở Việt Nam, có biến đổi gen tồn lúa, ngô, Từ năm 2002 chuyển hướng sang cải tạo lấy củ (khoai, sắn) Đi xa có công trình kháng sâu, đu đủ kháng bệnh đốm vòng, chuyển gen tổng hợp carotene vào lúa hay công trình lúa kháng sâu Nguy tiềm ẩn thực vật chuyển gen: - Môi trường: Hủy hoại môi trường, đe dọa giới sinh vật, giảm hiệu thuốc trừ sâu, huyển gen sai mục đích… - Sức khỏe người: Nguy gây dị ứng, hậu tiềm tàng… - Kinh tế: Tốn nhiều thời gian 13.Dụng cụ, hệ thống thiết bị nuôi cấy mô thực vật: Hiện nay, phòng thí nghiệm giới người ta sử dụng bình nuôi cấy loại sau: bình tam giác, hộp nhựa, bình serum, túi nilon, đĩa petri, ống nghiệm… Hình: Cây hoa Lily nuôi cấy hộp nhựa khoai tây nuôi cấy bình serum 37 Hình: Cây hoa chuông sinh trưởng phát triển tốt túi nylon so sánh với đối chứng bình tam giác Hình: Hệ thống nuôi cấy huyền phù tế bào chai lăn, lỏng lắc, Cellroll 13.1.Hệ thống Bioreactor: - Takayama Miasawa người nghiên cứu sử dụng bioreactor vào nhân giống trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly (Takayama Akita, 1988), hoa lan hồ điệp (Yong et al, 2000; Datta et al, 1999), cỏ với công suất 2000 chồi/bình bioreactor 500 lít (Takayama Akita, 1994) - Công nghệ cho phép nhân nhanh vô hạn giống trồng nhờ thiết bị bioreactor hoàn toàn tự động hóa Ví dụ bioreactor vibro-mixer (rung trộn) trang bị ống silicone sục khí tự có khả sản xuất 100000 phôi vô 38 tính trạng nguyên lít dung dịch huyền phù dung dịch đặt giấy lọc phát triển tuần (Preil cộng sự, 1988) - Tuy nhiên, công nghệ đòi hỏi thiết bị đại đắt tiền, vận hành phức tạp đặc biệt khâu chống ô nhiễm cho huyền phù nuôi cấy Hình: Hệ thống bioreactor nuôi cấy rễ tơ nhân sâm Hàn Quốc phòng thí nghiệp công nghiệp • Thuận lợi hệ thống bioreactor so với nuôi cấy bình: - Thể tích nuôi cấy tăng, thường lít, sản xuất nhiều phôi, chồi - Được thiết kế với chế khuấy hay thổi khí để đồng dịch nuôi cấy - Khi nuôi cấy liên tục, môi trường nuôi cấy môi trường vật lý kiểm soát thích hợp cho sinh trưởng VD: pH oxygen… • Bioreactor dùng để vi nhân giống thực vật quy mô thương mại theo hướng: - Tạo chồi (chuối, dứa, hoa lan ) - Tạo củ invitro (khoai tây, lily ) - Tạo phôi soma (cà phê, cao su ) 39 Hình: Một số dạng Biorector Biorector tự động 13.2.Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (Temporary Immersion System, TIS): Cấu tạo có phận chủ yếu sau: - Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để hút môi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy ngược lại - Hệ thống cài đặt thời gian dùng để điều khiển chu kỳ ngập - Hệ thống ống dẫn van điều khiển - Các màng lọc - Bình nuôi cấy thường nhựa polycarbonate hay thủy tinh Phân loại: Hệ thống RITA, hệ thống bình đôi BIT hệ thống Plantima Hệ thống RITA Hệ thống RITA công trình Teisson Alvard vào năm 1995 Một bình chứa L gồm có hai phần, phần chứa mẫu cấy phần chứa môi trường 40 Hình: Nguyên lý hoạt đông hệ thống RITA Pha 1: mô không ngập môi trường, Pha 2: tượng ngập hoạt hóa, van mở cho khí qua màng lọc đẩy môi trường lỏng lên ngập mô cấy, Pha 3: trao đổi khí hệ thống RITA, Pha 4: chu kỳ kết thúc, van đóng lại môi trường lỏng rút xuống ngăn bên Hệ thống bình sinh đôi BIT Hệ thống bình sinh đôi BIT (Hình 2) thiết kế Escalona cộng (1998) dự định nhân giống số lượng lớn qua đường phát sinh phôi soma Hai bình thủy tinh hay plastic có kích thước từ 250 mL - 10 L nối hệ thống ống dẫn, điều khiển tạo áp suất vượt mức để đưa môi trường vào bình chứa mẫu ngược lại Hình: Nguyên lý hoạt đông hệ thống bình sinh đôi BIT Hệ thống Plantima 41 Hệ thống thiết kế tổng thể tương tự hệ thống RITA nhiên có thay đổi cải tiến số chi tiết hệ thống bơm vị trí màng lọc Hình: Các thành phần hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập Hình: Hệ thống TIS việc nhân giống kiểng Spathiphyllum sensation cho kết khả quan sau tháng nuôi cấy Ưu điểm hệ thống TIS so với nuôi cấy thông thường: - Hệ số nhân nhanh chồi cao so với hệ thống bioreactor - Tỷ lệ sống sót cao, sinh trưởng khỏe mạnh trình ươn vườn - Gia tăng hấp thu chất dinh dưỡng 42 - Kiểm soát phát sinh hình thái tốt hơn, hạn chế tối đa tượng thủy tinh thể - Giảm hoạt tính chất độc ngoại bào hay chất ức chế sinh trưởng - Hệ thống TIS tiết kiệm công lao động không gian phòng nuôi cấy giảm chi phí sản xuất Khuyết điểm: thiết bị phức tạp, giá thành cao … Hình: Các nghiên cứu viên làm việc phòng cấy mô phòng nuôi cấy mô thực vật 14.Những thận lợi khó khăn nuôi cấy mô thực vật Việt Nam: Thuận lợi - Đảng nhà nước tạo nhiều điều kiện giúp đỡ - Đội ngũ nghiên cứu ngày nâng cao số lượng chất lượng - Có điều kiện làm việc học hỏi với tổ chức nghiên cứu, đào tạo nước ngoài: Úc, Thái Lan, Singapore, Đức… Khó khăn - Các đề tài/dự án nghiên cứu khoa học công nghệ xây dựng đưa vào triển khai Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn quản lý - Chưa có đơn đặt hàng yêu cầu quan quản lý Bộ/ Ngành địa phương doanh nghiệp - Đào tạo sau đại học 43 15.Kết luận - Ý nghĩa khoa học: Với lợi tạo lượng giống lớn, đồng đều, bệnh… nhân giống trồng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật mở hướng cho sản xuất nông nghiệp hàng hóa Nhân giống in vitro hướng phát triển cần phải quan tâm, đầu tư phát triển thêm Nhiệm vụ nhà nuôi cấy mô tế bào thực vật tiếp tục xây dựng hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro với trồng mang lại hiệu kinh tế cao, đáp ứng nhu cầu thị trường Mặc dù có nhiều tranh cãi tiềm nguy thực vật biến đổi gen Song, trước lợi ích đó, có quyền hy vọng phát triển chúng tương lai góp phần giải vấn đề lương thực thực phẩm quan tâm toàn nhân loại phảilựa chọn phương pháp bảo quản nguôn gen Bảo quản invitro 7% Bảo quản hạt phấn 3% Bảo quản chỗ 10% Bảo quản lúa Bảo quản hạt 80% Hình: Biểu đồ bảo quản nguồn gen lúa 44 16.Tài liệu tham thảo Trần Văn Minh (1994), Nuôi cấy mô tế bào thực vật, Phân viện Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Thành, (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật - Nghiên cứu ứng dụng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Văn Uyển, (1993), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Street (1974), Plant tissue and cell culture, Bormonogrvol, Black well scient, London Gamborg O L, G C Phillips (1997), “Plant Cell, Tissue and Organ culture-bG Fundamental Methods cell spinger”, Lab Manual Litvay J D et al (2002), Plant cell and tissue culture media, Duchefa Biochemie, Hofmanweg 71 2031 BH Haarlem, The Netherlands, p 44 Trindate, H Ferreina, J G Pais, M S Aloni, R (1990), The role of Cytokinin and auxin in rapid multiplication of shoots of Eucalyptus globolus grown in vitro, Aust For 53(4), pp 221-223 45 [...]... của thực vật nuôi cấy in vitro Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố: - Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường - Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy. .. đoạn tạo mô sẹo A Mô sẹo cây tỏi sau 2 tuần nuôi cấy B Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy C Tạo chồi từ mô sẹo D Cây tái sinh từ mô sẹo E Củ tỏi thu được từ cây con nuôi cấy mô thông qua tạo mô sẹo Mô sẹo: - Là các tế bào vách mỏng, không chuyên hóa, được tạo thành do sự phản phân hóa của tế bào nuôi cấy, trải qua thời kỳ phân chia tế bào hình thành một khối tế bào sinh trưởng vô tổ chức - Sự hình thành mô sẹo... pháp nuôi cấy mô thực vật: Hình: Một số phương pháp dùng trong nuôi cấy mô thực vật A Mô sẹo từ Catharanthus roseus (B )Nuôi cấy dịch tế bào từ Coryphanta spp (C) Nốt sần C roseus (D) Đầu rễ từ C roseus (E)Tái sinh cây từ C roseus callus (F) 24 Protoplasts từ Coffea arabica (G) Vi nhân giống của Agave tequilana (H) Phôi vô tính của cây Coffea canephora (I) Nuôi cấy rễ cây Psacalium decompositum - Nuôi cấy. .. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật: 13 9.1.Môi trường vật lý: + Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của các mô nuôi cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy Với đa số các loài cây, thời gian... 1988) 9.2 .Vật liệu nuôi cấy: Ảnh hưởng của mẫu cấy bao gồm tuổi sinh lý của cây (mô, cơ quan), kiểu di truyền, tình trạng sinh lý, vị trí của mẫu trên cây, vết thương, phương pháp cấy Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân giống in vitro Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công Thực tế cho... cấy thành công Thực tế cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tượng tầng…sau đó là... còn có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993) Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá cao, từ 10-20% thể tích môi trường Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô và tế bào động vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạn... và tái sinh thành cây hoàn chỉnh - Các phương pháp khác: nuôi cấy cứu phôi sau lai xa, thụ tinh giả… Hình: Quy trình nuôi cấy tế bào trần và nuôi cấy huyền phù tế bào 26 11.Các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật: 11.1.Thụ phấn in vitro: Thụ phấn in vitro là quá trình thụ phấn trong ống nghiệm tạo hợp tử không phụ thuộc vào cơ thể mẹ, được thực hiện bằng các phương pháp: ghép vòi nhụy, thụ phấn... mẫu nuôi cấy hoặc môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy sẽ bị chết, các thí nghiệm ở giai đoạn sau sẽ bị ngừng lại Do đó, trong toàn bộ quá trình nuôi cấy in vitro cần đảm bảo điều kiện vô trùng tuyệt đối Muốn đảm bảo điều kiện vô trùng cần có phương pháp khử trùng mẫu thích hợp, phương tiện khử trùng hiện đại, buồng và bàn nuôi cấy vô 23 trùng Chọn đúng phương pháp khử trùng sẽ cho tỷ lệ sống cao, môi... trưởng của mẫu cấy in vitro - Bước 2: Nuôi cấy khởi động Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ…) - Bước 3: Nhân nhanh Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh