NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Nuôi cấy mô thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật. Bằng các kỹ thuật nuôi cấy người ta đã nhân giống in vitro thành công nhiều loài cây trồng có giá trị.Ở nước ta lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng. Nhưng mới chỉ được nghiên cứu ở các viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viện Lúa đông bằng sông Cửu Long…và một số chương trình từ dự án quốc gia và quốc tế và thành công trong việc chuyển một số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô, cải bắp…Nhìn sang các nước khác chúng ta thấy công nghệ sinh học của Việt Nam còn đi một khoảng cách khá xa so với Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ…

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM

Khoa Công nghệ sinh học và Kỹ thuật môi trường

- -

TIỂU LUẬN

Đề tài: Nuôi cấy mô thực vật

MỤC LỤC

1.Đặt vấn đề - 3

2.Sơ lược về lịch sử hình thành và phát triển - 4

3.Khái niệm - 7

4.Ứng dụng - 7

5.Thành tựu-Thực tiễn nuôi cấy mô ở Việt Nam - 8

6.Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô thực vật - 9

7.Hướng phát sinh hình thái khi nuôi cấy -10

8.Quy trình nuôi cấy mô thực vật -12

9.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật -13

9.1.Môi trường vật lý -14

9.2.Vật liệu nuôi cấy -15

9.3.Môi trường nuôi cấy -16

9.4.Điều kiện vô trùng -23

10.Các phương pháp nuôi cấy mô thực vật -24

11.Các kỹ thuật dùng trong nuôi cấy mô thực vật -27

11.1.Thụ phấn in vitro -27

11.2.Dung hợp tế bào trần -27

11.3.Tạo dòng biến dị soma -28

11.4.Tạo dòng đơn bội -30

11.5.Chuyển gen -31

12.Cây trồng chuyển gen (GMO) -34

13.Dụng cụ, hệ thống và thiết bị nuôi cấy mô thực vật -37

13.1.Hệ thống Bioreactor -38

13.2.Hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời (TIS) -40

14.Những thận lợi và khó khăn trong nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam -43

15.Kết luận - Ý nghĩa khoa học -44

16 Tài liệu tham thảo -45

1 Đặt vấn đề

Nuôi cấy mô thực vật là một trong những lĩnh vực ứng dụng đạt nhiều thành công nổi bật của công nghệ sinh học thực vật Bằng các kỹ thuật nuôi cấy

người ta đã nhân giống in vitro thành công nhiều loài cây trồng có giá trị

So sánh ưu nhược điểm của các phương pháp nhân giống vô tính:

- Phụ thuộc vào mùa vụ

- Tốn công lao động, đất đai và thời gian

- Một số cây trồng không áp dụng được

- Cây giống dễ bị thoái hoá qua một số thế hệ

Nuôi cấy

mô thực

vật

- Hệ số nhân giống nhanh

- Cho ra các cá thể tương đối đồng nhất về mặt di truyền

- Có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường)

- Chủ động kế hoạch sản xuất

- Tạo được cây sạch virus

- Các cây sau nhân in vitro có

xu hướng được trẻ hóa

- Chi phí cao so với các phương pháp nhân giống vô tính khác nên giá thành không cạnh tranh

- Không phải bất cứ loại cây nào cũng có thể vi nhân giống

- Một số loài cây trồng rất dễ bị biến dị khi nhân giống in vitro

- Hiện tượng thủy tinh thể, bạch

tạng

Hình: Cây dừa cho năng suất cao và cây thuốc lá kháng virus CMV

Bằng cách nào người ta tạo được các giống cây trồng ấy?

2.Sơ lược về lịch sử hình thành và phát triển

+ Nghiên cứu sinh lý và phát sinh hình thái

+ Phát hiện ra các hoocmon sinh trưởng đầu tiên

+ Xây dựng được môi trường cơ bản: MS, N6, B5

- Giai đoạn 1965 - đến nay:

+ Nghiên cứu di truyền

+Ứng dụng các thành tựu vào sản xuất

Bảng: Những mốc chính trong lịch sử phát triển của nuôi cấy mô thực vật

1902

Haberlandt lần đầu tiên thí nghiệm nuôi cấy mô cây một lá mầm nhưng không thành công Haberlandt G., Sitzungsber Akad Wiss Wien, Math.-Naturwiss Kl., 111: 69-92

1904 Hannig tiến hành các thí nghiệm nuôi cấy phôi đầu tiên ở các loài họ cải

Crucifers Hannig B., Bot Zeitung, 62: 45-80

đầu tiên có khả năng kích thích sự tăng trưởng và phân chia tế bào

Kogl F Et al., Z Physiol Chem., 228: 90-103

1939

Gautheret, Nobecourt và White lần đầu tiên nuôi cấy mô sẹo thành công trong thời gian dài từ mô thượng tầng (cambium) ở cà rốt và thuốc lá Gautheret R J., C R Acad Sci (Paris), 208: 118-120; Nobecourt P., C R Soc Biol (Paris), 130: 1270 -1271; White P R.,

Am J Bot., 26: 59-64

1942

Gautheret lần đầu tiên theo dõi sự hình thành chất trao đổi thứ cấp trong nuôi cấy mô sẹo thực vật Gautheret R J Bull Soc Chim Biol 41: 13

thuốc lá in vitro Skoog F., Am J Bot., 31: 19-24

Am J Bot., 33: 301-318

Morel G C R Acad Sci., 230: 2318-2320

J P., Am J Bot., 38: 566-577

1952

Morel và Martin lần đầu tiên tạo được cây Dahlia sạch virus bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Morel G and Martin C., C R Hebd Seances Acad Sci (Paris), 235: 1324-1325

Morel G and Martin C., C R Acad Sci (Paris), 235: 1324-1325

1957

Skoog và Miller đã khám phá vai trò tỷ lệ nồng độ các chất auxin : cytokinin trong môi trường đối với sự phát sinh cơ quan (rễ hoặc chồi) Skoog F and Miller C O., In vitro Symp Soc Exp Biol., No 11: 118 -

131

cà rốt

ra số lượng lớn tế bào trần Cocking E C., Nature, 187: 927-929

1962

Murashige và Skoog phát minh môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật- môi trường MS Murashige T and Skoog F., Physiol Plant., 15: 473-497

1964

Guha và Maheshwari lần đầu tiên thành công trong tạo được cây đơn bội từ nuôi cấy bao phấn của cây cà rốt Guha S and Maheshwari S C., Nature, 204: 497 and Nature, 212: 97-98 (1966)

1972

Carlson và cs tạo được cây từ lai xa tế bào trần đầu tiên nhờ dung hợp

tế bào trần của 2 loài thuốc lá Nicotiana glauca và N langsdorfii Carlson P S et al., P N A S (USA), 69: 2292-2294

al., Cell, 11: 263-271

1978

Tabata và cs nuôi tế bào thực vật ở quy mô công nghiệp phục vụ sản xuất shikonin (chọn lọc dòng tế bào cho sản lượng các sản phẩm thứ cấp cao hơn) Tabata M et al., Frontiers of Plant Tissue Culture 1978, Univ Calgary Press, Calgary,: 213-222

1979

Marton và cs xây dựng quy trình chuyển gen vào tế bào trần bằng đồng nuôi cấy tế bào và Agrobacterium Marton L et al., Nature, 277: 129-131

Zimmermann U., Biochim Biophys Acta, 694: 227-277

1983

Công ty Mitsui Petrochemicals lần đầu tiên đã sản xuất chất trao đổi thứ cấp trên quy mô công nghiệp bằng nuôi cấy tế bào dịch lỏng Lithospermum spp Mitsui Petrochemicals

1985

Chuyển gen vào tế bào trần cây một lá mầm và hai lá mầm bằng phương pháp điện thẩm Fromm M E., P N A S (USA), 82: 5824-

5828

trực tiếp Crossway A et al., Mol Gen Genet., 202: 179-185

bắn gen Klein T M et al., P N A S (USA), 85: 4305-4309

Tất cả các dạng nuôi cấy mô đều được tiến hành qua hai bước :

- Các phần của thực vật hoặc một cơ quan nào đó của thực vật được tách ra khỏi phần còn lại, đó là sự tách rời tế bào, mô hay cơ quan

- Các phần tách ra khác nhau nói trên phải được đặt trong môi trường thích hợp để

- Khác: Nhân nhanh, phục tráng giống, sản xuất chất thứ cấp, làm sạch virut, duy trì và bảo quản nguồn gen quý, nghiên cứu di truyền và đột biến…

Hình: Nhân giống lan Hồ Điệp và Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long 5.Thành tựu-Thực tiễn nuôi cấy mô ở Việt Nam:

- Ở nước ta lĩnh vực áp dụng rộng rãi công nghệ nuôi cấy mô thực vật là lĩnh vực nhân giống, bảo quản nguồn gen cây trồng Nhưng mới chỉ được nghiên cứu ở các viện, các phòng thí nghiệm, mà chưa được sản xuất ở quy mô lớn, đại trà như viện

Di truyền Nông nghiệp, viện Công nghệ sinh học, viện Lúa đông bằng sông Cửu Long…và một số chương trình từ dự án quốc gia và quốc tế và thành công trong việc chuyển một số gene diệt sâu, bệnh, kháng thuốc vào một số cây như lúa, ngô, cải bắp…Nhìn sang các nước khác chúng ta thấy công nghệ sinh học của Việt Nam còn đi một khoảng cách khá xa so với Trung Quốc, Đài Loan, Mỹ…

- Năm 2008, công nghệ nuôi cấy mô đã có những bước đột phá mới: Nhân giống thành công giống sâm Ngọc Linh quý hiếm, khôi phục nhiều loài Lan rừng quý hiếm khỏi nguy cơ tuyệt chủng đặc biệt là loài lan Hài hồng - loài lan hài duy nhất

có hương thơm trên thế giới…Việt Nam có thể trở thành nước sản xuất phong lan lớn trong khu vực (20/02/2007)

- Từ năm 2001 đến nay, Sở Khoa học Công nghệ Lạng Sơn, hàng năm cung cấp hàng vạn cây giống Bạch Đàn Europhylla

Việt Nam đã bảo tồn thành công nguồn gene của các loại gỗ quý như: Vù hương -

- Loại gỗ chiết tinh dầu dùng trong dược, mỹ phẩm, cây Đăng lấy gỗ, cây trầm

hương, Chè vang - một loại chè rất khó trồng Lai tạo thành công giống lúa chịu hạn DR1, nhân nhanh nhiều loại hoa lan, mía , khoai tây sạch virut…

- Trung tâm Ứng dụng và chuyển giao tiến bộ công nghệ tỉnh Vĩnh Phúc nhân giống thành công cây Lô hội - một loài dược liệu quý của địa phương

- Ngày 16/5/2009, Lâm trường Tiền Phong, tỉnh Thừa Thiên-Huế, cho biết tỉnh vừa đầu tư xây dựng và đưa vào hoạt động một nhà nuôi cấy mô, có công suất 1 triệu cây/năm để phát triển trồng rừng

- Viện Sinh học Nông nghiệp Trường Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội là một trong

50 cơ sở chuyên môn nuôi cấy mô tế bào, bước đầu cơ sở này đã đạt những kết quả tốt: nuôi cấy các loài Phong lan, dứa Cayen, khoai tây giống siêu sạch bệnh… Hầu hết các phòng nuôi cấy mô đều có sản phẩm đầu ra liên tục và ổn định…

- Dự án “Xây dựng cơ sở ứng dụng, sản xuất giống và sản phẩm cây trồng chất lượng cao” được khởi công năm 2003, với hệ thống nhà kính với trang thiết bị hiên đại rộng hàng ngàn mét vuông Dự án được Trung tâm kĩ thuật rau quả thuộc

sở Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn Hà Nội đăng kí ở cấp thành phố

6.Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô thực vật:

Tính toàn năng: Là khả năng hình thành một cây hoàn chỉnh của tế bào, mô hay

cơ quan khi gặp điều kiện thuận lợi, do trong tế bào có chứa bộ gen mang toàn bộ

thông tin di truyền giống như cây mẹ

Sự phân hóa-phản phân hóa của tế bào:

+ Phân hóa: từ một tế bào ban đầu được biến đổi thành các tế bào chuyên hoá đặc hiệu cho các mô, cơ quan khác nhau

+ Phản phân hóa: khi các tế bào đã phân hóa thành các tế bào chuyên biệt nhưng vẫn có thể quay về dạng tế bào phôi sinh ban đầu khi gặp điều kiện thuận lợi

7 Hướng phát sinh hình thái khi nuôi cấy:

Gồm 5 phương thức cơ bản:

- Hình thái rễ, trên rễ hình thành chồi

- Hình thành chồi, sau đó hình thành rễ từ chồi

- Hình thành mô sẹo, sau đó sản sinh ra chồi và rễ, cấu trúc liên tiếp thành một trục thấp ví dụ như cà rốt

- Hình thành thể dinh dưỡng khác như thân củ, thân vẩy và hình thành hình cầu, ví

dụ tạo củ lily, lay ơn, protocorm hoa lan

- Hình thành chồi hoa hoặc một bộ phận cơ quan sinh sản, như khi nuôi cấy tế bào trụ phôi cây phong lan thì tế bào nuôi cấy có thể phân hóa thành hạt phấn và noãn

Hình: Sơ đồ phân hóa mẫu mô trực tiếp tạo chồi và cây hoàn chỉnh (thông

qua phương thức tăng khả năng phát sinh chồi nách)

Hình: Nhân giống thông qua giai đoạn tạo mô sẹo

A Mô sẹo cây tỏi sau 2 tuần nuôi cấy

B Mô sẹo sau 4 tuần nuôi cấy

C Tạo chồi từ mô sẹo

D Cây tái sinh từ mô sẹo

E Củ tỏi thu được từ cây con nuôi cấy

mô thông qua tạo mô sẹo

Mô sẹo:

- Là các tế bào vách mỏng, không chuyên hóa, được tạo thành do sự phản phân hóa của tế bào nuôi cấy, trải qua thời kỳ phân chia tế bào hình thành một khối tế bào sinh trưởng vô tổ chức

- Sự hình thành mô sẹo do chất điều tiết sinh trưởng điều khiển, có ba thời kỳ: + Thời kỳ cảm ứng: các tế bào chuyên hóa của mẫu cấy chuyển ngược trạng thái phát triển, biến đổi hình thái chức năng theo hướng tế bào phân sinh

+ Thời kỳ phân chia tế bào: các tế bào không phân hóa của mô sẹo có tần suất phân chia tương đối nhanh

+ Thời kỳ phân hóa tế bào: tốc độ phân chia và sinh trưởng tế bào giảm đi cho tới khi ngừng hẳn, trong mô sẹo xuất hiện cấu trúc mô dẫn

- Mô sẹo có màu lục, lục nhạt thì tiềm năng phát sinh cơ quan mạnh, các mô sẹo màu vàng nhạt hoặc màu sữa, xốp giòn có tiềm năng phân hóa tế bào thể phôi, các

mô sẹo màu trắng hoặc màu xám có khả năng tái sinh.Vậy mô sẹo sinh trưởng khỏe mạnh là những mô thể hiện màu vàng sữa hoặc màu trắng có độ sáng bóng, cũng có mô thể hiện màu lục nhạt hoặc màu lục, mô sẹo lão hóa chuyển thành màu vàng hoặc màu nâu

Sự biến đổi sinh lý của tế bào nuôi cấy trong quá trình phát sinh cơ quan

- Sự biến đổi axit nucleic và protein

Ví dụ: nuôi cấy lá mầm cây sam hoa cho thấy sự phát sinh của chồi có mối quan

hệ với các protein có khối lượng phân tử 1600-20000U Nhưng khi hình thành mô sẹo thì xuất hiện các protein có khối lượng phân tử từ 60000-65000U

- Sự biến đổi hô hấp và các chất hydracabon Ví dụ: Tỷ lệ NADPH/NADP+ trong

mô hình thành chồi giảm đến dưới 0.05 nhưng ở mô không hình thành chồi thì tỷ

lệ này được giảm ổn định

- Sự biến đổi cân bằng phytohormon.Ví dụ: Khi hình thành chồi yêu cầu về auxin

ở mức độ cao hơn khi hình thành hoa thì

- Biến đổi của axit amin Ví dụ: Khi hình thành chồi, mô có hàm lượng nước tương đối lớn, axit malic tăng lên, hàm lượng proline cao, tỷ lệ treosine/serine cao

8 Quy trình nuôi cấy mô thực vật:

- Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ

Trước khi tiến hành nuôi cấy cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi cấy) Các cây này cần phải sạch bệnh cùng với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi lấy mẫu sẽ làm giảm tỉ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro

- Bước 2: Nuôi cấy khởi động

Là giai đoạn khử trùng đưa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt Khi lấy mẫu cần chọn đúng loại mô, đúng giai đoạn phát triển của cây: mô non, ít chuyên hóa (đỉnh chồi, mắt ngủ, lá non, vảy củ…)

- Bước 3: Nhân nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái và tăng nhanh số lượng thông qua các con đường: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính Hệ số nhân ở giai đoạn này biến động từ 5-50 lần tuỳ thuộc vào loài cây, môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp

- Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Để tạo rễ cho chồi, người ta chuyển chồi từ môi trường nhân nhanh sang môi trường tạo rễ có bổ sung một lượng nhỏ auxin Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết sinh trưởng Đối với các phôi vô tính, chỉ cần gieo chúng trên môi trường không có chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa nồng

độ thấp của xytokinin để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh

- Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Để đưa cây từ ống nghiệm ra vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

+ Cây trong ống nghiệm đạt những tiêu chuẩn hình thái ( số lá, rễ, chiều cao cây) + Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước + Chủ động điều chỉnh ẩm độ, ánh sáng của vườn, có chế độ dinh dưỡng phù hợp

9 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô thực vật:

9.1.Môi trường vật lý:

+ Ánh sáng: Đây là yếu tố cần thiết cho sự phát triển và phát sinh hình thái của

các mô nuôi cấy Ánh sáng có ảnh hưởng tới mẫu cấy thông qua thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng

Thời gian chiếu sáng có vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của mô nuôi cấy Với đa số các loài cây, thời gian chiếu sáng thích hợp là 8-12 h/ngày

Cường độ ánh sáng ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái mô nuôi cấy Cường độ ánh sáng cao kích thích sinh trưởng của mô sẹo trong khi cường độ thấp gây nên sự tạo chồi (Ammirato, 1986) Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là từ 1000 - 7000 lux (Moresin, 1974)

Bên cạnh thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng thì chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng khá rõ tới sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao của thân chồi hơn so với ánh sáng trắng, còn ánh sáng xanh thì ức chế sự vươn cao của chồi nhưng lại ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của mô sẹo Chính vì vậy mà trong phòng thí nghiệm thường sử dụng ánh sáng của đèn huỳnh quang với cường độ 2000 - 3000 lux, đặt cách bình nuôi cấy từ 35- 40cm

Tỷ lệ quang tử của vùng ánh sáng màu đỏ/gần đỏ/và xanh/đỏ ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái

Sự phát sinh hình thái xảy ra khi ánh sáng có bước sóng thuộc ánh sáng màu xanh (400-460 mm), màu đỏ (620-680 mm), gần màu

đỏ (700-800 mm) và màu tím (300-400 mm)

Hình: Nuôi cấy hoa cúc trong bình serum 125 ml dưới hệ thống chiếu sáng đèn Compact 3U (trong) và đèn neon (ngoài, đối chứng)

+ Nhiệt độ: là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và các quá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt động của

Auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây mô Theo kết quả nghiên cứu của Vonanorld (1982) thì nếu nhiệt độ ngày/đêm là 20 oC /15 oC hoặc 20 oC /18 oC tỷ lệ ra rễ đạt được khoảng 33%, thậm chí còn thấp hơn Ở nhiệt độ trung bình thì hoạt động trao đổi chất tốt hơn Còn ở nhiệt độ cao lại thích ra nhiều tế bào không có tổ chức Trong nuôi cấy mô, nhiệt độ thường được duy trì ổn định, ban ngày từ 25 – 30oC và ban đêm từ 17 - 20 oC Nhìn chung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 25 oC (white, 1973)

+ Độ ẩm: Trong các bình nuôi cấy thì độ ẩm tương đối luôn bằng 100% nên

ta không cần phải quan tâm nhiều đến độ ẩm khi nuôi cấy mô

+ Độ thoáng khí: Nồng độ khí CO2 trong bình nuôi cấy các cây có diệp lục thường giảm thấp hơn điểm bù CO2 (50-100 mmol/mol) trong hầu hết các chế độ quang chu kỳ.Nồng độ CO2 gia tăng trong giai đoạn tối (510 mmol/mol) nhưng giảm khi chiếu sáng (100mmol/mol) trong vài giờ, khi được đưa lại và trong tối thì nồng độ

CO2 lại gia tăng trở lại Ngay cả trong trường hợp thay nắp đậy có khả năng trao đổi khí, nồng độ CO2 giảm xuống còn 100-200 mmol/mol trong thời gian có chiếu sáng do đó cây invitro sống dị dưỡng (Kozai & Seikimoto, 1988)

9.2.Vật liệu nuôi cấy:

Ảnh hưởng của mẫu cấy bao gồm tuổi sinh lý của cây (mô, cơ quan), kiểu di truyền, tình trạng sinh lý, vị trí của mẫu trên cây, vết thương, phương pháp cấy Việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy quyết định đến sự thành bại của quá trình nhân giống in vitro Về nguyên tắc thì mọi tế bào của các mô chuyên hoá đều có tính toàn năng, nghĩa là đều có thể nuôi cấy thành công Thực tế cho thấy các loài tế bào và các loại mô khác nhau có mức độ nuôi cấy thành công khác nhau Một nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào là các tế bào làm vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao Như vậy, tế bào và mô phôi non là triển vọng nhất, rồi đến các tế bào của đỉnh sinh trưởng như: mô phân sinh đỉnh ngọn, đầu rễ, lá non, tượng tầng…sau đó là các tế bào sinh dục như noãn bào

và tế bào hạt phấn ở giai đoạn non (Nguyễn Đức Thành, 2000); (Nguyễn Quang Thạch, 1995)

9.3.Môi trường nuôi cấy:

Môi trường nuôi cấy mô thực vật tuy rất đa dạng nhưng đều gồm một số thành phần cơ bản sau: Các muối khoáng đa lượng và vi lượng, vitamin, amino axít, nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trưởng, các chất hữu cơ bổ sung (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết khoai tây, bột chuối khô ) và chất làm thay đổi trạng thái môi truờng: các loại thạch (agar)

Tất cả các hợp chất này đều tham gia vào một hoặc nhiều chức năng trong sự sinh trưởng và phân hoá của thực vật nuôi cấy in vitro Các nhà khoa học sử dụng các môi trường nuôi cấy rất khác nhau Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy với thành phần hoá học đặc trưng phụ thuộc vào một số yếu tố:

- Đối tượng cây trồng hoặc mô nuôi cấy khác nhau có nhu cầu khác nhau về thành phần môi trường

- Mục đích nghiên cứu hoặc phương thức nuôi cấy khác nhau (nuôi cấy tạo mô sẹo phôi hoá hoặc phôi vô tính, nuôi cấy tế bào trần hoặc dịch lỏng tế bào, vi nhân giống…)

- Trạng thái môi trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng…) Môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào thường là lỏng lắc, lỏng sục khí

- Một số môi trường dinh dưỡng thường dùng: MS-62, WV3, N6, B5, LS…

+ Nguồn các bon: trong nuôi cấy mô, các tế bào chưa có khả năng quang hợp để tổng hợp nên chất hữu cơ do vậy người ta phải đưa vào môi trường một lượng hợp chất các bon nhất định để cung cấp năng nượng cho tế bào và mô (Debengh, 1991) Nguồn cácbon ở đây là các loại đường khoảng 20-30 mg/l có tác dụng giúp

mô tế bào thực vật tổng hợp các hợp chất hữu cơ, giúp tế bào tăng sinh khối, ngoài

ra nó đóng vai trò là chất thẩm thấu chính của môi trường Người ta thường sử dụng 2 loại đường đó là saccharose và glucose (Trần Văn Minh, 1994) Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi từ 1-12%, thông dụng là 2-3%

+ Các nguyên tố đa lượng: là những nguyên tố khoáng như: N, P, K, S, Mg,

Ca… cần thiết và thay đổi tuỳ đối tượng nuôi cấy Nhìn chung, các nguyên tố này được sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm (tỷ lệ phần nghìn) Các nguyên tố này có chức năng cung cấp nguyên liệu để mô hoặc tế bào thực vật xây dựng thành phần cấu trúc hoặc giúp cho quá trình trao đổi chất giữa các tế bào thực vật với môi trường được thuận lợi Có nhiều môi trường với thành phần, tỷ lệ các chất khác nhau, chúng ta có thể lựa chọn sử dụng Nói chung, môi trường giàu Nitơ và Kali thích hợp cho việc hình thành chồi, còn môi trường giàu Kali sẽ thúc đẩy quá trình trao đổi chất mạnh hơn

Thành phần khoáng của một môi trường cấy được xác định do sự cân bằng nồng

độ của những ion khác nhau trong dung dịch (nồng độ ion thể hiện bằng mg/l) Việc lựa chọn thành phần và hàm lượng khoáng cho một đối tượng nuôi cấy là rất khó đòi hỏi người làm công tác nuôi cấy mô phải có những hiểu biết cơ bản về sinh lý thực vật đối với dinh dưỡng khoáng Chẳng hạn, tỷ lệ nguồn nitơ tuỳ thuộc vào loài cây và trạng thái phát triển mô Thông thường, nguồn nitơ được đưa vào môi trường ở hai dạng là HN4+ và NO3- (nitrat) Trong đó, việc hấp thụ NO3- của các tế bào thực vật tỏ ra có hiệu quả hơn so với HN4+ Nhưng đôi khi NO3- gây ra hiện tượng “kiềm hóa” môi trường vì vậy giải pháp sử dụng phối hợp cả 2 nguồn nitrơ với tỷ lệ hợp lý được sử dụng rộng rãi nhất

Bảng: Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô

+ Nhóm nguyên tố vi lượng: Fe, Cu, BO, Zn, Mn, Co, I… là các nguyên tố rất quan trọng và không thể thiếu cho sự phát triển của mô và tế bào do chúng đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động của enzym Chúng được dùng ở nồng độ thấp hơn nhiều so với các nguyên tố đa lượng để đảm bảo sinh trưởng và phát triển bình thường của cây (Nguyễn Văn Uyển, 1993)

Bảng:Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô

+ Các vitamin: Mặc dù cây nuôi cấy mô có thể tự tổng hợp được Vitamin, nhưng không đủ cho nhu cầu (Czocnowki, 1952) Do đó, để cây sinh trưởng tối ưu một

số Vitamin nhóm B được bổ sung vào môi trường với lượng nhất định tuỳ theo từng hệ mô và giai đoạn nuôi cấy Các Vitamin B1 (Thiamin) và B6 (Pyridocin) là những Vitamin cơ bản nhất thường dùng trong môi trường nuôi cấy với nồng độ thấp khoảng 0,1-1mg/l (Trần Văn Minh, 1994) Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0 oC

(trong ngăn đá tủ lạnh)

Bảng: Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô

+ Dung dịch hữu cơ: có thành phần không xác định như nước dừa, dịch chiết nấm men, cà rốt, chối, khoai tây được bổ sung vào môi trường có tác dụng kích thích sinh trưởng mô sẹo và các cơ quan

Nước dừa đã được sử dụng vào nuôi cấy mô từ năm 1941 và được sử dụng khá rộng rãi trong các môi trường nhân nhanh in vitro Trong nước dừa thường chứa các acid amine, acid hữu cơ, đường, ARN và DNA Đặc biệt trong nước dừa còn

có chứa những hợp chất quan trọng cho nuôi cấy mô như: Myoinoxitol, các hợp chất có hoạt tính Auxin, các Gluxit của Cytokinin (Nguyễn Văn Uyển, 1993) Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá cao, từ 10-20% thể tích môi trường

Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô và tế bào động vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ Dung dịch thủy phân casein cung cấp một số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L môi trường

+ Chất làm đông cứng môi trường: Agar (thạch) là một loại Polysacharid của tảo

có khả năng ngậm nước khá cao 6-12g/l Độ thoáng khí của môi trường thạch có ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng mô nuôi cấy Nồng độ thạch dao động trong khoảng 6-10g/l tuỳ thuộc mục tiêu nuôi cấy Gelatin ở nồng đô ̣ cao (10%) cũng có hiê ̣u quả ta ̣o gel nhưng bi ̣ ha ̣n chế sử du ̣ng bởi vì nó nóng chảy ở nhiê ̣t đô ̣ thấp

(25oC) Công ty FMC Corp gần đây đã phát triể n một loa ̣i agarose đươ ̣c tinh sa ̣ch cao go ̣i là Sea Plaque(k), loa ̣i này có thể đươ ̣c dùng để phu ̣c hồi các protoplast đơn

(single protoplast) trong nuôi cấy Cellophane đu ̣c lỗ (perforated cellophane), cầu giấy lo ̣c (filter paper bridge), bấc giấy lo ̣c (filter paper wick), bo ̣t polyurethane (polyurethane foam) và xốp polyester (polyester fleece) là các phương thức thay đổi giá thể được dùng trong môi trường nuôi cấy mô hoă ̣c tế bào

+ Các chất điều hoà sinh trưởng:

Các Phytohormon là những chất có tác dụng điều hoà sinh trưởng và phát triển của thực vật Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật như: phân chia, biệt hoá tế bào… ngoài ra còn có ảnh hưởng đến quá trình lão hoá mô và nhiều quá trình khác Các phytohormon có thể chia thành 5 nhóm: Auxine, Cytokinin, Giberillin, Ethylen, Abscisic acid Chúng là yếu tố quan trọng nhất trong môi trường quyết định đến sự thành công của kết quả nuôi cấy Bảng : Giới thiệu tóm tắt về một số chất điều hoà sinh trưởng chính ở thực vật

1 Indole-3-acetic acid (IAA)

- Phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

- Phân chia tế bào

- Tạo và nhân callus

4 Zeatinriboside (ZR) - ức chế sự hình thành rễ

- ức chế sự kéo dài chồi

- ức chế quá trình già (hoá vàng) ở lá

1 Gibberellic acid (GA3)

4 Jasmonic acid (Ja)

Methyl jasmonate (MeJa)

- Kích thích hình thành thân củ, thân hành

- Đẩy nhanh hình thành đỉnh sinh trưởng

Hình: Tương tác giữa BA và NAA trong phát sinh hình thái của vảy tỏi

Bowiea volubilis

Ngoài ra, cần phải chú ý tới độ pH của môi trường vì nó ảnh hưởng khá rõ nét tới khả năng hoà tan các chất khoáng trong môi trường Sự ổn định của môi trường, khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của cây Nếu pH thấp (<4,5) hặc (>7,0) đều gây

ức chế sinh trưởng, phát triển của cây trong nuôi cấy in vitro Nên việc xác định được độ pH ban đầu của môi trường cho quá trình sinh trưởng và phát triển của

mô cấy là cần thiết Độ pH thường được sử dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật nói chung từ 5,6 - 6