Nghiên cứu sử dụng gel alginate làm giá thể thay cho agar agar trong nuôi cấy mô thực vật

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐẶNG THỊ SÁU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEL ALGINATE LÀM GIÁ THỂ THAY CHO AGAR-AGAR TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành : Công nghệ sau thu hoạch Mã số : 60.54.10 Người hướng dẫn khoa học : PGS-TS Ngô Đăng Nghĩa Nha Trang – Tháng 06 năm 2008 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trên bất cứ công trình nào khác. Tác giả luận văn Đặng Thị Sáu LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này trước hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt những kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn cô Khúc Thị An, thầy Trang Sỹ Trung và các thầy cô trong bộ môn Chế Biến trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ và có những ý kiến đóng góp rất quý báu cho tôi trong quá trình làm đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Phan Ngọc Hùng trường Đại học Yersin Đà Lạt, thầy Nguyễn Duy Hạng - Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt đã giúp đỡ và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị ở Viện Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Nha Trang đã tạo điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn bè đồng nghiệp đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Đặng Thị Sáu MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 1 DANH MỤC CÁC BẢNG 2 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ 2 DANH MỤC CÁC HÌNH 4 MỞ ĐẦU 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 6 1.1. TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU VÀ ALGINATE 6 1.1.1. Tổng quan về rong nâu 6 1.1.1.1. Một số thành phần hóa học cơ bản của rong nâu 7 1.1.1.2. Nguồn lợi rong mơ ở Việt Nam 8 1.1.2. Tổng quan về alginate 9 1.1.2.1. Cấu trúc alginate 9 1.1.2.2. Một số tính chất quan trọng của alginate 12 1.1.2.3. Tách chiết alginate 17 1.2. TỔNG QUAN VỀ NUÔI CẤY MÔ 20 1.2.1. Lịch sử nuôi cấy mô 20 1.2.2. Các điều kiện nuôi cấy mô 21 1.2.2.1. Điều kiện vật lý 21 1.2.2.2. Môi trường nuôi cấy mô thực vật 22 1.2.3. Kỹ thuật vi nhân giống 25 1.3. TỔNG QUAN VỀ TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 27 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước 27 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 27 1.4. TỔNG QUAN VỀ CÂY DÂU TÂY 29 1.4.1. Sinh trưởng và phát triển của cây dâu tây 29 1.4.1.1. Nguồn gốc, vị trí phân loại của cây dâu tây 29 1.4.1.2. Đặc tính sinh học 30 1.4.2. Các phương pháp nhân giống dâu tây tại Đà Lạt 32 1.4.2.1. Phương pháp truyền thống 32 1.4.2.2. Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô 32 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 33 2.1.1. Alginate 33 2.1.2.Các hóa chất dùng trong tạo gel alginate 34 2.1.3. Vật liệu nuôi cấy mô 35 2.1.4. Môi trường nuôi cấy mô 36 2.1.5. Phòng thí nghiệm và các dụng cụ 37 2.1.6. Điều kiện nuôi cấy 38 2.1.7. Điều kiện kỹ thuật 38 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.2.1. Phương pháp kiểm tra chất lượng của alginate 38 2.2.2. Các thí nghiệm kiểm tra tính chất lý hóa của hệ gel alginate 39 2.2.2.1. Xác định biến đổi pH của hệ gel alginate 39 2.2.2.2. Xác định độ bền của hệ gel alginate 40 2.2.3. Nghiên cứu ứng dụng hệ gel alginate trong nuôi cấy mô 41 2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường đến tốc độ nhân chồi dâu tây 41 2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO 3 trong môi trường đến tốc độ nhân chồi dâu tây 42 2.2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine (BA) đến tốc độ nhân chồi dâu tây 43 2.2.2.4. So sánh khả năng nhân cụm dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar 44 2.2.2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 44 2.2.2.6. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO 3 trong môi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 46 2.2.2.7. So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar 46 2.2.3. Phương pháp lấy các chỉ tiêu và xử lý số liệu 47 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1. Kết quả nghiên cứu về tính chất ban đầu của alginate 49 3.2. Kết quả nghiên cứu về đặc tính lý hóa của hệ gel alginate 49 3.2.2. Kết quả xác định pH của hệ gel alginate 49 3.2.3. Kết quả xác định độ bền hệ gel alginate 51 3.3. Kết quả các nghiên cứu về nuôi cấy mô dâu tây trên hệ gel alginate 53 3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate đến công đoạn nhân chồi dâu tây 53 3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO 3 trong môi trường đến tốc độ nhân chồi 56 3.3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine (BA) đến tốc độ nhân chồi 60 3.3.4. Kết quả so sánh nhân chồi trên giá thể alginate và giá thể agar 64 3.3.5. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong môi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 67 3.3.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO 3 trong môi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro 70 3.3.7. Kết quả so sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể agar và giá thể alginate 72 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO 77 PHỤ LỤC 83 1 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT NT : Nghiệm thức KTSTTV : chất kích thích sinh trưởng thực vật. TB ± SE : trung bình ± độ lệch chuẩn GDL : glucono-δ-lactone. NAA : 1- NaphthlAcetic Acid. IAA : Indol- 3- Acetic Acid. IBA : Indol- 3- Butyric Acid. Kinetin : 6-furfuryamino purine. BA : 6-Benzylamino purine MS : Murashige & Skoog, 1962. 2 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Tỷ lệ M/G của một số loại rong nâu trên thế giới 12 1.2 Sự biến thiên độ nhớt (tính bằng mPa.s) theo nồng độ của dung dịch alginate natri ở 20 0 C 14 2.1 Bảng phân tích phương sai 48 3.1 Một số thành phần của alginate và agar nghiên cứu 49 DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị Tên đồ thị Trang 3.1 Biến đổi pH của hệ gel alginate theo nồng độ GDL và CaCO 3 50 3.2 Biến đổi độ bền của hệ gel alginate theo nồng độ alginate và CaCO 3 52 3.3a Số lượng chồi trên giá thể alginate với các nồng độ khác nhau 54 3.3b Chiều cao chồi trên giá thể alginate với các nồng độ khá c nhau. 54 3.3c Trọng lượng cụm chồi trên giá thể alginate với các nồng độ khác nhau 54 3.4a Số chồi trên giá thể alginate với nồng độ CaCO 3 khác nhau 57 3.4b Chiều cao chồi trên giá thể alginate với nồng độ CaCO 3 khác nhau. 57 3.4c Trọng lượng cụm chồi trên giá thể alginate với nồng độ CaCO 3 khác nhau. 57 3.5a Số lượng chồi tạo thành trên giá thể alginate với nồng độ BA khác nhau. 61 3.5b Chiều cao chồi tạo thành trên giá thể alginate với nồng độ BA khác nhau. 61 3.5c Trọng lượng cụm chồi tạo thành trên giá thể alginate với nồng độ BA khác nhau. 62 3 3.6a Kết quả nhân chồi trên giá thể alginate và giá thể agar 65 3.6b So sánh khả năng nhân chồi dâu tây trên giá thể alginate và agar sau 30 ngày nuôi cấy 66 3.7a Số rễ dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ alginate 68 3.7b Chiều dài rễ trên giá thể alginate với các nồng độ khác nhau 68 3.8a Số lượng rễ trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO 3 khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 70 3.8b Chiều dài rễ trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO 3 khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 71 3.9a Kết quả tái sinh rễ trên giá thể alginate và giá thể agar 73 3.9b So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar. 75 4 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc của β-D- Mannuronic acid (M) và α- L-Guluronic acid (G ) theo cổ điển. 10 1.2 Cấu trúc của β-D - Mannuronic acid (M) và α- L-Guluronic acid (G ) theo hiện đại. 10 1.3 Mô hình block GGG; MMM và GMGMGM 11 1.4 Sự tạo gel của alginate theo mô hình vĩ trứng 16 1.5 Sơ đồ quy trình chung để sản xuất alginate 19 1.6 Các giai đoạn của quá trình vi nhân giống 26 2.1 Quy trình sản xuất alginate từ rong mơ S. mcclurei. 33-34 2.2 Công thức cấu tạo của GDL và gluconic acid 34 3.1 Hình mô phỏng tạo gel alginate khi có mặt của tác nhân GDL và CaCO 3 51 3.2 Chồi dâu tây trên giá thể alginate ở các nồng độ khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 55 3.3 Chồi dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO 3 khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 58 3.4 Chồi dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ BA khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy. 63 3.5 Chồi trên giá thể alginate và giá thể agar sau 30 ngày nuôi cấy 64 3.6 Rễ cây dâu tây sau 30 ngày nuôi cấy trên giá thể alginate với các nồng độ khác nhau. 69 3.7 Rễ dâu tây trên giá thể alginate với các nồng độ CaCO 3 khác nhau sau 30 ngày nuôi cấy 71 3.8 Rễ dâu tây trên giá thể alginate và trên giá thể agar sau 30 ngày nuôi cấy 74 [...]... HÌNH NGHIÊN C ỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 1.3.1 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về giá thể thay thế giá thể agar trong nuôi cấy mô thực vật, chưa có công trình nghiên cứu nào về sử dụng gel alginate làm giá thể nuôi cấy mô Năm 2006 Th.S Lương Mỹ Ngân (Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh) thử nghiệm thành công việc sử dụng môi trường thạch dừa làm. .. dùng alginate làm giá thể gel của môi trường đặc dùng trong nuôi cấy tế bào trần [43]; Kurt Ingar Draget, Kjetill Ostgaard, and Olav Smidsrod (1989) đã nghiên cứu dùng alginate làm giá thể gel trong nuôi cấy mô bắp cả Brassica napus kết quả cho thấy tính i tương thích sinh học cao của hệ gel alginate và nó có thể thay thế agar trong nuôi cấy mô. [40] - Năm 2001, Endale Gebre and B N Sathyan arayana nghiên. .. về dùng alginate chiết xuất từ rong nâu ở vùng biển Việt Nam trong nuôi cấy mô Xuất phát từ những lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu sử dụng gel alginate làm giá thể thay cho agar- agar trong nuôi cấy mô thực vật do PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa hướng dẫn Mục đích của đề tài: - Xác định được các thông số để tạo ra hệ gel alginate đồng thể có độ ổn định cao, có pH phù hợp trong ứng dụng công... F.A Malirol và Grace Lameck nghiên cứu dùng tinh bột sắn làm tác nhân thay thế agar làm giá thể môi trường nuôi cấy mô thực vật Tuy nhiên, vì tính chất gel kém, gel đục hơn so với agar và đặc tính của nó có thể thay đổi trong quá trình nuôi cấy, dẫn đến làm mềm môi trường nuôi cấy Hơn nữa, trong 29 hấp vô trùng tinh bột có thể bị đường hóa, ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, thẩm thấu và trao đổi chất... ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô thực vật - Thử nghiệm nuôi cấy mô thực vật trên giá thể gel alginate và so sánh hiệu quả với gel agar chuẩn Khả năng áp dụng của đề tài: kết quả nghiên cứu thành công của đề tài góp phần làm tăng phạm vi ứng dụng của alginate sản xuất từ rong Sargassum ở Việt Nam trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật 6 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ RONG NÂU VÀ ALGINATE 1.1.1 Tổng... hơn so với agar. [53] - Agarose có khả năng tạo gel tốt, trong suốt Tuy nhiên nó đắt tiền và nó không thể sử dụng lặp lại nhiều lần trong nuôi cấy - Carrageenan có khả năng tạo gel khi có mặt của những ion xác định nó cũng được nghiên cứu để thay thế cho agar - Năm 1988 Henderson, W.E và Kinersley A.M nghiên cứu dùng tinh bột bắp làm tác nhân tạo gel thay thế agar trong nuôi cấy mô thực vật. [53] - Năm... và protocorm Môi trường nuôi cấy là môi trường Mitra bổ sung 2% sucrose, 1 g /l peptone và được làm đặc với 0,9% agar hoặc 3% guar gum hoặc 3% isubgol Môi trường dùng cấy mô lá chứa 1 mg/l BA Kết quả nghiên cứu cho thấy cả 2 giá thể mới này cho hệ số nhân chồi cao gấp 2-3 lần so với cấy trên giá thể agar và giá thành của 2 giá thể mới này cũng rẻ hơn agar nên nó được dùng để thay agar trong nhân giống... từ mô cấy trên giá thể Tapioca và sago cao hơn với chồi trên giá thể agar Giá thể Tapioca và sago cũng rẻ hơn so với agar Kết quả 28 nghiên cứu cho thấy có thể dùng tapioca và sago thay cho agar trong vi nhân giống khoai tây.[34] - Năm 2004, Ruchi Jain và Shashi B Babbra nghiên cứu dùng Guar gum (trích từ nội nhũ của Cyamopsis tetragonoloba) và isubgol (từ vỏ trấu của hạt Plantago ovata ) thay agar trong. .. khoai tây,v.v Hiện nay chúng ta đang ở giai đoạn 4 của nuôi cấy mô thực vật - giai đoạn ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong thực tiễn chọn giống, sản xuất cây giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và vào việc nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao [20],[22],[29] 1.2.2 Các điều kiện nuôi cấy mô thực vật 1.2.2.1 Điều kiện vật lý a Cường độ ánh sáng Sự phân phối của ánh sáng, quang... 22 1.2.2.2 Môi trường nuôi cấy mô thực vật Môi trường nuôi cấy là nhân tố quan trọng nhất để xác định sự thành công hay thất bại trong nuôi cấy mô Có hơn 50 công thức môi trường khác nhau sử dụng cho nuôi cấy in vitro nhiều loại cây (Ga borg và cộng sự, 1976; Huang v m à Murashige, 1977) Trong đó môi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, đặc biệt là trong tái sinh cây Môi trường B5 (Gamborg và cộng sự, . BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG ĐẶNG THỊ SÁU NGHIÊN CỨU SỬ DỤNG GEL ALGINATE LÀM GIÁ THỂ THAY CHO AGAR- AGAR TRONG NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT . hợp trong ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô thực vật. - Thử nghiệm nuôi cấy mô thực vật trên giá thể gel alginate và so sánh hiệu quả với gel agar chuẩn. Khả năng áp dụng của đề tài: kết quả nghiên. dùng alginate chiết xuất từ rong nâu ở vùng biển Việt Nam trong nuôi cấy mô. Xuất phát từ những lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài Nghiên cứu sử dụng gel alginate làm giá thể thay cho agar- agar