2.1.1. Alginate
Alginate được tách chiết từ rong mơ S. mcclurei thu ở vùng biển Hịn Chồng
theo quy trình acid hĩa như sau:
Pha lỗng Lọc sơ bộ - Nước 600C - Pha lỗng 2-3 lần Rong mơ Chọn rửa Ngâm HCHO Rửa sạch Ngâm HCl Nấu chiết - Dung dịch Na2CO3 1,68 % - V/W= 20 lần. - Nhiệt độ nấu 55÷600C - Thời gian nấu 2giờ
- Dịch HCHO 1,2%
- V/W= 20 lần.
- Thời gian ngâm 24 giờ
- Nhiệt độ phịng
- HCl 0,3% - V/W= 20 lần.
- Thời gian ngâm 15 phút. - Nhiệt độ phịng
Rửa sạch, để
Hình 2.1. Quy trình sản xuất alginate từ rong mơ S. mcclurei
2.1.2. Các hĩa chất dùng trong tạo gel alginate.
- GDL (glucono-δ-lactone) dạng bột của hãng Sigma.
GDL là một chất acid hĩa. Nĩ là este dạng vịng của D-gluconic acid. Khi
cho vào nước nĩ dễ dàng hình thành dạng cân bằng của hỗn hợp lactone GDL và acid gluconic. Nĩ cĩ cơng thức hĩa học C6H10O6. Trọng lượng phân tử 178,14
g/mol. GDL tinh khiết dạng bột màu trắng, khơng mùi.
Gluconolactone Gluconic acid
Hình 2.2. Cơng thức cấu tạo của GDL và gluconic acid
- CaCO3 dạng bột trắng của Trung Quốc.
Javen 5 ‰ Lọc tinh Dịch lọc H2SO4 10% Rửa kết tủa Ép tách nước Trung hịa Na2CO3 Phơi (sấy) Cồn 960 Nghiền nhỏ Bột Na- Alginate
2.1.3. Vật liệu nuơi cấy mơ
Tơi chọn đối tượng thực vật nghiên cứu nuơi cấy mơ là cây dâu tây Mỹ Đá cĩ tên khoa học Fragaria vesca Lđược trồng tại các vườn dâu ở Đà Lạt.
Đây là giống dâu tây đáp ứng yêu cầu chất lượng quả thơm, ngon, thịt cứng
cĩ thể vận chuyển đi xa, năng suất cao và thích nghi tốt với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Đà Lạt. Hiện nay nơng dân Đà Lạt đang tăng diện tích trồng rau, hoa trong đĩ cĩ dâu tây. Giống dâu tây Mỹ Đá được người dân chọn nhiều nhất.
Đây cũng là một trong những giống cây đáp ứng yêu cầu chuyển đổi cơ cấu cây
trồng trong mục tiêu xây dựng nền nơng nghiệp cơng nghệ cao tại Đà Lạt- Lâm Đồng.
Chọn đỉnh sinh trưởng để nuơi cấy khởi đầu tạo những cây con sạch bệnh.
Phương pháp chọn mẫu và xử lý mẫu:
- Đỉnh sinh trưởng những cây dâu tây khỏe mạnh, phát triển tốt được dùng làm nguyên liệu để nuơi cấy khởi đầu.
- Rửa mẫu cấy bằng xà phịng. - Rửa lại bằng nước cất vơ trùng.
- Xử lý sơ bộ qua cồn 700 trong 30 giây sau đĩ tráng l ại bằng nước cất vơ trùng. - Khử trùng mẫu bằng dung dịch hypochloride calcium ở nồng độ 10% trong
vịng 15 phút. Trong quá trình khử trùng luơn lắc nhẹ để đảm bảo các mẫu được
khử trùng đều, đảm bảo mẫu khơng bị chết do tác động của hĩa chất khử trùng. - Sau đĩ mẫu được rửa lại bằng nước cất vơ trùng 4-5 lần. Mọi thao tác được
thực hiện trong tủ cấy vơ trùng.
- Sau đĩ, mẫu được đưa cấy vào mơi trường MS cĩ bổ sung BA để tái sinh
chồi. Sau 48giờ mẫu được cấy chuyền sang mơi trường mới cĩ cùng thành phần
nhằm loại bỏ các chất hĩa nâu cĩ trên mơi trường. Sau 4 tuần nuơi cấy, các mẫu
sống, sạch, cĩ sức sống tốt được chọn để tiến hành nghiên cứu trong đề tài.
Quá trình xử lý mẫu được tiến hành theo nghiên cứu của Indra [36] và của
hai tác giả Phạm Xuân Tùng và Nguyễn Thị Lan [25].
Trong kết quả và biện luận của đề tài tơi chỉ nghiên cứu cơng đoạn nhân chồi và
2.1.4. Mơi trường nuơi cấy mơ dâu tây.
Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Indra D.Bhatt và Uppenandra Dhar [32]; Phạm Xuân Tùng và Phạm Thị Lan [25] ; Văn Thị Như Ngọc [18] cho thấy cây
dâu tây Mỹ Đá phát triển thích hợp trên mơi trường MS.
Do vậy tơi chọn mơi trường MS là mơi trường cơ bản cho nghiên cứu trong
luận văn.
Thành phần cơ bản của mơi trường MS (Murashige-Skoog, 1962) như sau:[15]
a. Khống đa lượng (g/l)
- Kali nitrat (KNO3) 19,0 - Amon nitrat (NH4NO3) 16,5 - Canxi clorua (CaCl2. 2H2O) 4,4 - Magiê sulfat (MgSO4. 7H2O 3,7 - Kali monophosphat (KH2PO4) 1,7
b. Khống vi lượng (mg/l)
- Boric axit (H3BO3) 6,2 - Mangan sulfat (MnSO4 . 4H2O) 22,3 - Kẽm sulfat (ZnSO4. 7H2O) 8,6 - Kali iot (KI) 0,83 - Natri molypdat (Na2MoO4. 2H2O) 0,25 - Đồng sulfat (CuSO4. 5H2O) 0,025 - Coban sulfat (CoCl2. 6H2O) 0,25 - Na2- EDTA 37,3 - Sắt sulfat (FeSO4. 7H2O) 27,8 c. Vitamin (mg/l) - Thiamin- HCl (B1) 0,1 - Myo- inositol 100 - Glycine 2 - Nicotinic acid 0,5 - Piridoxin – HCl (B6) 0,5
Cũng theo nghiên cứu của các tác giả trên thì mơi trường dùng cho nhân chồi
dâu tây sử dụng loại cytokinin BA thích hợp hơn Kin, cũng như sử dụng phối hợp
BA và Kin. Sử dụng BA riêng lẻ ở nồng độ 0,3 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất
với chất lượng chồi khá tốt.
Trong giai đoạn hình thành rễ, tác giả Indra D. Bhatt và Uppeandra [36] cĩ kết luận rằng rễ của loài dâu tây Fragaria x ananasa ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA
với liều lượng thấp (0,1mg/l), nhưng theo nghiên cứu của tác giả Văn Thị Như
Ngọc [18] với cây dâu tây Mỹ Đá thì auxin NAA khơng phù hợp và mơi trường
thích hợp nhất là 1/2MS +0,2mg/l IBA + 0,75g/l than hoạt tính.
Do đĩ tơi chọn mơi trường nhân chồi là mơi trường MS + 20g/l đường
sucrose + 0,3mg/l BA, được làm đặc bằng agar 8g/l hoặc alginate với nồng độ
nghiên cứu.
Mơi trường ra rễ là mơi trường khống MS/2 + vitamin Morel +20g/l đường
sucrose + chất kích thích sinh trưởng IBA 0,2mg/l và 0,75g/l than hoạt tính, đặc làm
đặc bằng agar 8 g/l hoặc alginate với nồng độ nghiên cứu.
pH mơi trường được điều chỉnh đến 5,8 bằng dung dịch KOH 0,1N hoặc HCl
0,1N trước khi đem đi hấp khử trùng ở 1210C; 1,3 atm. Mơi trường được lưu giữ ở điều kiện thường trong 7-10 ngày để kiểm tra khả năng nhiễm trước khi cấy.
2.1.5. Phịng thí nghiệm và các dụng cụ
- Hệ thống phịng nuơi cấy mơ gồm các phịng: phịng pha mơi trường,
phịng cấy, phịng dự trữ mơi trường, phịng sáng.
- Các trang thiết bị và dụng cụ thiết yếu trong phịng nuơi cấy mơ.
- Cân kỹ thuật, cân phân tích, máy đo pH, nồi hấp vơ trùng autoclave, tủ cấy
vơ trùng.
- Các dụng cụ đong: ống đong, cốc đong, bình định mức, Micropipet,...
- Các dụng cụ cấy bao gồm: khay inox, panh inox, dao inox, kéo inox, bình tam giác các loại, ống nghiệm, khăn lau,.v.v. tất cả đã được hấp vơ trùng trước khi đưa vào thao tác trong box cấy.
2.1.6. Điều kiện nuơi cây
- Nhiệt độ phịng: 23÷250C . - Độ ẩm : 65 ÷70%.
- Cường độ chiếu sáng: 2500 ÷ 3000 lux. - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
2.1.7. Điều kiện kỹ thuật
- Dụng cụ và các trang thiết bị đều được khử trùng.
- Mơi trường nuơi cấy được hấp vơ trùng ở 1210C, 1,2atm trong 25 phút và
được kiểm tra vơ trùng trước khi cấy mẫu.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp kiểm tra chất lượng ban đầu của alginate.
- Xác định hàm lượng ẩm theo phương pháp trọng lượng.
- Xác định màu sắc theo phương pháp cảm quan.
- Xác định độ nhớt được thực hiện trên nhớt kế quay.
Chuẩn bị dịch đo độ nhớt: Cân chính xác 2g alginate (đã trừ đi độ ẩm) hồ tan vào 200ml nước cất. Đem lọc phần khơng tan bằng 2 lớp vải mịn để đảm bảo dung dịch được đồng nhất. Tiến hành loại khí trên máy siêu âm trong thời gian 5 phút. Dịch chuẩn bị được đo ở 200C ở các tốc độ quay 200, 400,
600 vịng/phút. Kết quả được xác định dựa vào đồ thị chuẩn của dung dịch
sucrose.(phụ lục 1).
- Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
- Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp foulch. - Xác định hàm lượng glucid bằng phương pháp debois.
2.2.2. Các thí nghiệm kiểm tra tính chất lý hĩa của hệ gel alginate. 2.2.2.1. Xác định biến đổi pH của hệ gel theo nồng độ GDL và CaCO3.
Sau một số thí nghiệm khảo sát tạo được hệ gel alginate đồng nhất tơi tiến hành xác định pH của hệ gel theo sự biến thiên của GDL và CaCO3 như sau:
Nồng độ CaCO3 : 15÷ 25 (mM) Nồng độ GDL : 10 ÷ 60 (mM)
Tiến hành cố định hàm lượng alginate 1% và CaCO3; cho GDL dao động
trong khoảng 10÷60mM và xác định pH của hệ gel.
Phương pháp tiến hành: hồ tan alginate trong nước cất để thu được dung
dịch đồng nhất, thêm mơi trường, điều chỉnh thể tích tương ứng, điều chỉnh pH dịch
về 5,8-6 với acid loãng, thêm CaCO3 với nồng độ nghiên cứu, đem hấp vơ trùng, rĩt vào cốc với thể tích đều nhau, để nguội đến nhiệt độ phịng.
Hệ gel alginate Xác định pH Alginate 1% GDL 10÷ 60 (mM) Huyền phù Dịch mơi trường Hấp vơ trùng Điều chỉnh pH CaCO3 15÷25 (mM)
GDL được hịa tan trong một lượng nhỏ nước cất, lọc vơ trùng qua giấy lọc Wattman 0,45µm, sau đĩ được thêm vào huyền phù mơi trường chứa alginate và CaCO3 vơ trùng lượng tương ứng với nồng độ nghiên cứu, lắc đều, để qua đêm và tiến hành đo pH bằng thiết bị đo pH.
2.2.2.2. Xác định độ bền của hệ gel alginate.
Alginate với nồng độ nghiên cứu được cho hịa tan trong nước cất, thêm mơi
trường điều chỉnh thể tích tương ứng, điều chỉnh pH về 5,8-6 bằng HCl 0,01N, sau
đĩ thêm CaCO3 đã được phân tán trong một lượng nhỏ nước cất với nồng độ nghiên cứu, huyền phù tạo thành được hấp vơ trùng. Rĩt vào cốc 100ml (50ml/cốc), làm nguội đến nhiệt độ phịng sau đĩ cho vào thể tích tương ứng dịch GDL đã lọc vơ
trùng theo nồng độ nghiên cứu. Lắc đều để giải phĩng Ca2+ tạo hệ gel đồng nhất.
Để qua đêm và tiến hành đo độ bền.
Mẫu agar đối chứng: agar (0,7÷ 0,9%) được cho vào thể tích mơi trường tương ứng, sau đĩ đun nhẹ cho tan và đem hấp vơ trùng ở 1210C; 1,3atm. Sau đĩ rĩt
ra cốc 100ml (50ml/ cốc), để nguội đến nhiệt độ phịng để tạo gel. Để qua đêm và tiến hành đo độ bền gel.
Đo độ bền gel alginate và agar trên thiết bị đo lưu biến gel RHEO- METER.
Alginate 0,5÷2,5 % Hệ gel alginate Đo độ bền gel GDL 10÷60 (mM) Huyền phù Dịch mơi trường Hấp vơ trùng Điều chỉnh pH CaCO3 15÷25 (mM)
Các nghiệm thức: CaCO3 (mM) Alginate (%) 15 20 25 0,5 M1 M10 M19 0,75 M2 M11 M20 1,0 M3 M12 M21 1,25 M4 M13 M22 1,5 M5 M14 M23 1,75 M6 M15 M24 2,0 M7 M16 M25 2,25 M8 M17 M26 2,5 M9 M18 M27
Mẫu agar đối chứng : Mđc1 : 0,7% ; Mđc2 : 0,8 % ; Mđc3 : 0,9%
2.2.3. Nghiên cứu ứng dụng hệ gel alginate trong nuơi cấy mơ.
2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong mơi trường đến tốc độ nhân chồi dâu tây. tốc độ nhân chồi dâu tây.
Cách tiến hành: Mẫu dâu tây ban đầu cho thí nghiệm là các cụm chồi phát
triển từ các mẫu đã được tái sinh sau 4 tuần nuơi cấy. Cụm được tách thành từng đơn vị riêng lẻ cĩ chiều cao và trọng lượng tương đối đồng đều. Được cấy vào các bình mơi trường nhân chồi (mơi trường MS + 20g/l đường sucrose + 0,3 mg/l BA)
được làm đặc bằng alginate với các nồng độ khác nhau.
Mỗi nghiệm thức được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 2 mẫu. Mẫu sau khi cấy được nuơi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2500-3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Chỉ tiêu theo dõi: Số liệu được ghi nhận sau 30 ngày nuơi cấy bao gồm số
chồi trung bình/cụm; chiều cao trung bình của các chồi/cụm; trọng lượng cụm, chất lượng chồi.
Các nghiệm thức gồm:
Nghiệm thức CaCO3(mM) GDL (mM) Nồng độ alginate %( w/v)
C1 25 52 0,5
C2 25 52 1,0
C3 25 52 1,5
C4 25 52 2,0
C5 25 52 2,5
2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong mơi trường đến tốc độ nhân chồi dâu tây. tốc độ nhân chồi dâu tây.
Bố trí thí nghiệm: Mẫu cấy là các cụm chồi được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 4 tuần nuơi cấy. Cụm được tách thành từng cụm nhỏ tương đối đều nhau về kích thước và trọng lượng. Mẫu được cấy vào các bình mơi trường
nhân chồi cĩ bổ sung alginate với nồng độ tối ưu thu được từ nghiên cứu ở mục
2.2.3.1 và bổ sung CaCO3 với nồng độ nghiên cứu.
Mỗi nghiệm thức tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, 2 mẫu/bình. Mẫu
sau khi cấy được nuơi trong phịng nuơi cây với thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày,
cường độ chiếu sáng là 2500-3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân (số chồi/cụm); chiều cao chồi, trọng lượng cụm
chồi (g) sau 30 ngày nuơi cấy.
Các nghiệm thức:
Nghiệm thức Nồng độ CaCO3 (mM) Nồng độ GDL (mM)
C6 15 32
C7 20 42
2.2.3.3. Nghiên cứuảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine (BA) đến tốc độ nhân chồi dâu tây. tốc độ nhân chồi dâu tây.
Nồng độ alginate và CaCO3 tốt nhất từ các nghiên cứu ở mục 2.2.3.1 và 2.2.3.2 được dùng trong thí nghiệm này để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến hiệu quả nhân chồi dâu tây khi cấy trên giá thể alginate.
Quá trình nhân chồi là một bước rất quan trọng, nĩ quyết định đến số lượng
cây con trong quá trình nhân cây sau này, quyết định giá thành của cây con. Vì vậy
nghiên cứu tìm ra mơi trường nhân chồi tối ưu là rất cần thiết.
Để kích thích quá trình tạo chồi trong nuơi cấy mơ ta cần bổ sung vào mơi
trường nuơi cấy các chất KTSTTV là cytokinin như BA, Kinetin.
BA cĩ ảnh hưởng rất tốt trong quá trình nhân chồi cây dâu tây. Do đĩ tơi tiến
hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BA đối với quá trình nhân chồi để tìm ra nồng độ BA tối ưu trong nhân chồi với mơi trường tạo thành từ giá thể alginate.
- Cách tiến hành:
Mẫu cấy: các cụm được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 4 tuần
nuơi cấy. Cụm được tách thành từng cụm nhỏ tương đối đều nhau về kích thước và trọng lượng. Các mẫu được cấy vào các bình mơi trường nhân chồi chứa cytokinin
BA với nồng độ khác nhau.
Điều kiện thí nghiệm: Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 2 mẫu. Mẫu cấy được nuơi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2500- 3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Các nghiệm thức: Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) C9 0,1 C10 0,2 C11 0,3 C12 0,4 C13 0,5
- Chỉ tiêu theo dõi: số chồi trung bình/cụm; chiều cao trung bình của các chồi
trong mỗi cụm chồi; trọng lượng cụm sau 30 ngày nuơi cấy.
2.2.3.4. So sánh khả năng nhân cụm dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar .
- Cách tiến hành:
Mẫu cấy là các cụm được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 4 tuần
nuơi cấy. Cụm được tách thành từng cụm nhỏ tương đối đều nhau về kích thước và trọng lượng. Các mẫu được cấy vào các bình mơi trường nhân chồi.
Thành phần mơi trường:
- Khống MS
- Đường sucrose 20g/l. - Vitamin Morel.
- BA nồng độ tốt nhất từ nghiên cứu ở mục 2.2.3.3.
- Với nghiệm thức alginate bổ sung alginate; CaCO3 tốt nhất từ các nghiên cứu ở mục 2.2.3.1 và 2.2.3.2. Bổ sung GDL ở nồng độ tương ứng với CaCO3. - Với nghiệm thức agar đối chứng : bổ sung 0,8g/l agar.
Mẫu cấy được nuơi trong phịng nuơi cấy với điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2500- 3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 2 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi trung bình/cụm; chiều cao trung bình của các chồi
trong mỗi cụm chồi; trọng lượng cụm sau 30 ngày nuơi cấy.
2.2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong mơi trường đến