Mơi trường nuơi cấy là nhân tố quan trọng nhất để xác định sự thành cơng hay thất bại trong nuơi cấy mơ. Cĩ hơn 50 cơng thức mơi trường khác nhau sử dụng
cho nuơi cấy in vitro nhiều loại cây (Gamborg và cộng sự, 1976; Huang và
Murashige, 1977). Trong đĩ mơi trường MS được sử dụng phổ biến nhất, đặc biệt là
trong tái sinh cây. Mơi trường B5 (Gamborg và cộng sự, 1986), N6 (Chu, 1978), NN (Nisch và Nitsch (1969) và các dẫn xuất từ các mơi trường này cĩ thể sử dụng
rộng hơn cho nhiều loại cây.[15]
Nuơi cấy trong điều kiện thí nghiệm yêu cầu dinh dưỡng tương tự như trồng ở đất, thành phần cơ bản của bất kỳ mơi trường nuơi cấy nào cũng bao gồm các
thành phần sau: các nguyên tố khống đa lượng và vi lượng, vitamin, chất điều hịa
sinh trưởng thực vật, cacbonhydrate và các chất hữu cơ tùy chọn khác.
a. Đường
Đường là nguồn dinh dưỡng cacbon để tế bào thực vật tổng hợp nên các chất
hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối.
Trong kỹ thuật nuơi cấy mơ, người ta thường sử dụng 2 dạng đường là
sucrose và glucose nhưng sucrose là phổ biến nhất. Nhu cầu carbonhydrate trong mơi trường nuơi cấy là 2-3% đối với đường sucrose và thấp hơn đối với đường
glucose. Ngồi 2 dạng trên cĩ nhiều nguồn hydrocacbon khác nhưng ít khi được sử
dụng như lactose, maltose, tinh bột,v.v.
b. Muối khống đa lượng
Là những chất cần cung cấp với số lượng lớn cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Nhu cầu về muối khống đa lượng của cây nuơi cấy mơ khơng cĩ sự khác biệt đáng kể so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên. Các nguyên tố cần
phải cung cấp là: Nitơ, Photpho, Kali, Canxi, Magiê và Sắt.
Chức năng sinh học của chúng như sau:
- Nitơ: là thành phần của protein, acid nucleic và một số coenzyme. Địi hỏi
số lượng lớn nhất.
- Canxi: tổng hợp thành tế bào, tham gia vào chức năng màng, nhận biết tế bào. - Magiê: tiền tố enzym, tham gia vào thành phần của diệp lục.
- Sắt: tham gia vận chuyển electron như một thành phần của cytochrom.
Các nguyên tố này cĩ thể được cung cấp dưới nhiều dạng khác nhau như:
- Nitơ: Ca(NO3)2 .4H2O; KNO3; NH3NO3.
- Photpho: KH2PO4
- Kali: KNO3; KC2; KH2PO4
- Canxi: Ca (NO3)2.4H2O; CaCl2.6 H2O
- Magiê: MgSO4.7H2O
- Sắt: FeSO4 ; FeNO3 + EDTA
c. Muối khống vi lượng:
Số lượng những thành phần này chỉ địi hỏi dưới dạng vết cho sự sinh trưởng
và phát triển của thực vật mà thơi, chúng cĩ vai trị đa dạng và biến đổi. Chúng
gồm: Mangan, Iod, Đồng, Coban, Bo, Molipden và kẽm,.v.v. đơi khi cĩ cả Nhơm
và Niken. Các cơng trình nghiên cứu về muối khống vi lượng của mơ thực vật
trong nuơi cấy mơ cịn rất hạn chế. Nhưng để bảo đảm cho sự phát triển của cây in vitro, người ta cung cấp hầu hết các nguyên tố vi lượng cho cây và sự cung cấp này chỉ mang tính chất kinh nghiệm. Do đĩ cĩ thể trong một số trường hợp, đối với một
số đối tượng nuơi cấy việc bổ sung một vài nguyên tố khống vi lượng là khơng cần thiết.
d. Vitamin và amino acid
Vitamin
Trong mơi trường nuơi cấy mơ thực vật người ta thường bổ sung thêm nhiều
loại vitamin khác nhau trong đĩ 4 loại sau đây là được sử dụng nhiều nhất:
- Myo – inositol - Pyridoxin HCl (B6) - Acid nicotinic (Niacine) - Thiamin HCl (B1)
Trong đĩ chỉ cĩ B1 và myo-inositol là thực sự cần thiết cho nuơi cấy tế bào thực vật trong ống nghiệm. Tuy nhiên, những vitamin khác vẫn được thêm vào mơi
trường vì lí do lịch sử.
Amino acid
Thường cĩ mặt trong các hợp chất hữu cơ cung cấp trong mơi trường nuơi
cấy mơ. Nĩ cung cấp nguồn Nitơ cho sự sinh trưởng và phát triển của thực vật. Glycine được sử dụng nhiều nhất tuy nhiên các amino acid khác như: arginin,
asparagin, aspactic acid, alan in, glutamine, glutamic acid v à prolin,… cũng rất cần thiết.
e. Các chất điều hịa sinh trưởng
Chất điều hịa sinh trưởng thực vật là thành phần then chốt trong mơi trường
quyết định hướng phát triển của tế bào thực vật. Chất điều hịa sinh trưởng thực vật được sử dụng phổ biến nhất là các hoocmon thực vật và các chất tổng hợp tương tự. Ngày nay, đã cĩ nhiều chất điều hịa sinh trưởng tự nhiên được xác định, cũng như
các chất nhân tạo được tổng hợp bằng con đường hĩa học. Tùy thuộc vào mục đích và đối tượng nuơi cấy mà người ta bổ sung vào mơi trường chất điều hịa sinh
trưởng thích hợp. Cĩ 5 nhĩm chính các chất điều hịa sinh trưởng thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid và ethylene. Auxin đẩy mạnh quá trình phân chia và phát triển tế bào. Cytokinin kích thích phân chia tế bào. Gibberellin điều hịa sự kéo dài tế bào, quyết định chiều cao cây và lượng trái đậu. Abscisic acid ức chế
phân chia tế bào. Ethylen điều hịa sự chín của trái. Trong đĩ auxin và cytokinin
được sử dụng rộng rãi nhất và thường được dùng kết hợp với nhau. Tỉ lệ
auxin/cytokinin quyết định kiểu nuơi cấy. Tỉ lệ auxin/cytokinin cao thiên về hình thành rễ, thấp kích thích tạo chồi, trung gian thiên về tạo mơ sẹo.
Các chất thường được sử dụng trong nuơi cấy mơ là:
- 2,4-D: 2,4 DichlorophenoxyAcetic Acid
- NAA: 1- NaphthlAcetic Acid
- IAA: Indol- 3- Acetic Acid
- IBA: Indol- 3- Butyric Acid
- Kinetin: 6-furfuryamino purine
- BA: 6-Benzyl Amino purine
- Thidiazuron: 1-phenyl-3-metyl-trans-2-butenylamino purine
f. Các chất bổ sung
- Thạch agar: đây là thành phần quyết định tình trạng vật lý của mơi trường,
là nguyên liệu phổ biến nhất để pha mơi trường bán đặc hay mơi trường đặc. Hàm
lượng agar dùng trong nuơi cấy mơ thường dao động từ 0,6-1% theo khối lượng.
Ngồi agar người ta cịn sử dụng các chất làm đặc khác (tuy khơng thường xuyên)
như: gelatin, alginate, carrageenan và gelrite.
- Than hoạt tính: than hoạt tính thường được bổ sung vào mơi trường ở các giai đoạn nuơi cấy khác nhau. Nĩ khơng phải là chất điều hịa sinh trưởng nhưng lại
cĩ khả năng làm thay đổi mơi trường. Than hoạt tính cĩ khả năng hấp thu nhiều
chất khác nhau, cĩ thể là các chất được tạo ra trong quá trình hấp khử trùng mơi
trường, cĩ thể là các chất do mơ cấy tạo ra hay là các chất điều hịa sinh trưởng cĩ trong mơi trường. Những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng than hoạt tính cịn ngăn
cản sự phát triển của những mơ sẹo khơng mong muốn, kích thích sự tạo hình, tăng
hiệu suất phát sinh phơi.
- Nước dừa: nước dừa thuộc nhĩm chất khơng xác định bởi vì thành phần
hĩa học của nĩ rất phức tạp.[15],[23],[29]