Dâu tây là một chi thuộc họ Rosaceae giống Fragaria. Cĩ 4 nhĩm cơ bản
trong Fragaria do sự kết hợp các nhiễm sắc thể đơn bội hoặc là do số lượng nhiễm
sắc thể của chúng.
Cĩ trên 20 lồi dâu tây khác nhau trên khắp thế giới. Dâu tây được phân loại
dựa trên số lượng nhiễm sắc thể của chúng. Cĩ 7 kiểu nhiễm sắc thể cơ bản mà tất
cả chúng cĩ nĩi chung. Tuy nhiên, chúng thể hiện tính đa bội khác nhau. Một số lồi là lưỡng bội, cĩ 2 tập hợp chứa 7 nhiễm sắc thể (2n=14). Các loài khác là tứ bội
(4 tập hợp, 4n=28), lục bội (6 tập hợp, 6n=42), bát bội (8 tập hợp, 8n=56) hay thập
bội (10 tập hợp, 10n=70).
Lồi F. vesca cĩ 14 NST và được coi là thể lưỡng bội, loài F x ananassa là lồi quan trọng nhất với thể bát bội với 56 nst. Việc lai tạo những giống đơn bội rất khĩ nhưng việc lai tạo dễ thành cơng hơn khi lai hai lồi cĩ cùng mức độ bội thể như nhau. Trong thực tế, giống F x ananassa được lai tạo bởi 2 loại mới trên thế
giới là F. chiloensis (L) Duch và F. virginiana Duch.[60]
Những lồi dâu tây được phân loại bởi Staudt (1989,1999) và Yuetal (1985)
được phân bố theo sự phân vùng địa lý. Ở châu Âu và Mỹ loài Fragaria đã được
vesca là loại phân bố rộng nhất bao gồm ở châu Âu, châu Á và châu Mỹ. Những
lồi cịn lại phân bố hạn chế theo vùng sinh thái địa lý như ở các vùng châu Âu- Siberia, Bắc Trung Quốc và Manchuria, nam Trung Quốc, Nhật Bản và châu Mỹ. [37]
1.4.1.2. Đặc tính sinh học của dâu tây.
Dâu tây là cây thân thảo lâu niên cĩ một thân chính hay đỉnh sinh trưởng, từ đĩ sẽ mọc lên lá, rễ, ngĩ (cây con) và những chồi hoa.
Đỉnh sinh trưởng là một chồi ở trung tâm và các lớp mạch bao xung quanh. Đỉnh sinh trưởng bao gồm một lõi chính và được bao phủ bằng những lớp mỏng
vịng lên phía trên nĩ. Phía cùng của mỗi nách lá là những chồi bất định cĩ thể tạo
thành cây con, đỉnh sinh trưởng mới hay ở dạng chồi ngủ tùy thuộc vào điều kiện mơi trường.
a. Lá
Lá của dâu tây được sắp xếp theo hình xoắn trơn ốc, lá thứ 6 lại cĩ phương
trùng với lá đầu tiên. Lá dâu thơng thường cĩ hình lơng chim với 3 lá chét, chúng cĩ
lớp biểu bì bao quanh và những lớp thịt lá đặc thù của cây 2 lá mầm.
Lá hầu hết của tất cả các giống chỉ sống được vài tháng rồi rụng. Vào mùa lạnh giá cây dâu vẫn tồn tại nhưng hầu như chúng khơng cĩ lá, duy chỉ cĩ loài
L.chilogensis vẫn cịn một vài lá và cây được thay lá trong mùa xuân.
b. Rễ
Rễ cơ bản được phát sinh từ đỉnh sinh trưởng và sau đĩ được mọc trực tiếp
xuống đất. Phẫu hình của rễ thuộc dạng mầm (hai lá mầm). Những rễ mọc thêm cũng mọc ra xung quanh từ đỉnh sinh trưởng. Những rễ nhánh thường dài từ 2-5cm và nếu được cung cấp nước đầy đủ chúng sẽ chuyển sang dạng bĩ sợi.
Thơng thường cây dâu cĩ từ 20-30 rễ chính và hàng trăm thứ rễ thứ cấp ( cấp
2, cấp 3 và cấp cao hơn). Cĩ từ 50 -90% rễ tập trung ở độ sâu từ 10-15cm trong đất.
Rễ bên (rễ thứ cấp) sống được từ 1-2 năm, rễ chính cĩ thể sống được từ 2-3 năm
phụ thuộc vào chủng loại và điều kiện mơi trường. Rễ dâu thường bị các loài nấm
c. Ngĩ ( cây con)
Hầu hết các giống dâu tây thường tạo thành cây con ở dạng ngĩ (stolon) bao
gồm 2 đốt. Những cây con được tạo thành ở đốt thứ 2. Mắt đốt thứ nhất ở dạng ngủ
nghỉ hoặc hình thành một nhánh tạo thành cây một con khác.
Mỗi cây con dạng ngĩ cĩ thể sản sinh ra cây ngĩ tiếp theo. Giống
F. ananassa thường tạo ra 10 -15 cây ngĩ, cây của loài F. virginiana cĩ thể sản sinh
gấp 2-3 lần số lượng trên. Ngĩ của loài F. ananassa sống được trong vịng một năm, nhưng của loài F. chiloensis cĩ thể sống được vài năm.
Cây mẹ cĩ thể chuyển nước, chất dinh dưỡng và các chất đồng hĩa đến cho
cây con trong vài tuần đầu hay cĩ thể đến 1 năm tùy thuộc vào lồi và kiểu gen của
chúng. Rễ của cây con cĩ thể tự hút nước và dinh dưỡng sau 2-3 tuần.
d. Hoa
Kiểu phát hoa của dâu tây là một cụm được giới hạn trên một chồi phát hoa nguyên thủy. Từ chồi phát hoa nguyên thủy cĩ 2 bơng thuộc thế hệ thứ 2, cĩ 4 bơng
thuộc thế hệ thứ 3 và 8 bơng thuộc thế hệ thứ 4. Một bơng cĩ 10 đài hoa, 5 cánh hoa và 20-30 nhị hoa đực và từ 60-600 nhụy hoa cái. Số lượng nhụy hoa lớn nhất tìm thấy ở hoa đầu tiên, sau đĩ giảm dần theo từng thế hệ của bơng.
Sự thụ phấn của dâu tây phụ thuộc vào cơn trùng, thơng thường do loài ong thụ phấn. Phấn hoa đã thành thục trước khi bao phấn nở và khơng phát tán ra ngồi
trước khi hoa nở. Hạt phấn cĩ thể sống được từ 2-3 ngày và núm nhụy cĩ thể tiếp
nhận phấn hiệu quả trong vịng 8-10 ngày. Sự thụ phấn xẩy ra sau 24-48 giờ tính từ
lúc nhụy tiếp nhận hạt phấn.
e. Quả
Trái dâu là trái tập hợp, bởi vì trên một noãn bao gồm nhiều bầu nhụy. Các
hạt tạo thành cĩ thể được gọi là trái thật của dâu. Phơi của dâu chứa 2 lá mầm hình ½ elip, bên trong chứa protein và chất béo, khơng chứa tinh bột, phía chính giữa là lõi. Sau khi 2 lớp vỏ được tách ra bởi các bĩ mạch thì hạt yêu cầu chất dinh dưỡng để phơi phát triển. [37]
1.4.2. Các phương pháp nhân giống dâu tây tại Đà Lạt1.4.2.1. Phương pháp truyền thống 1.4.2.1. Phương pháp truyền thống
Dâu tây được trồng ở Đà Lạt từ rất lâu khi con người đến vùng đất này để
sinh sống và khai phá. Loại dâu thường được trồng là giống dâu cũ mà người dân
quen gọi là “dâu ta”. Hầu hết là các cây dâu thường sinh cây con ở dạng ngĩ nên
người dân Đà Lạt thường sử dụng phương pháp nhân giống bằng cách tách những
cây con hoặc những cây ngĩ sinh ra từ cây mẹ ban đầu để làm cây giống cho thế hệ
nhân giống tiếp theo. Phương pháp này vẫn cịn được sử dụng cho đến ngày nay.
1. 4.2.2. Phương pháp nhân giống bằng nuơi cấy mơ
Khi cĩ kỹ thuật nuơi cấy mơ, bắt đầu là cây khoai tây, người nơng dân đã
thấy hiệu quả khi sử dụng cây khoai tây bằng cấy mơ đã mang lại hiệu quả kinh tế
như thế nào nên họ bắt đầu chú ý đến những cây giống khác thơng qua phương pháp
này. Nuơi cấy mơ dâu tây thường được các cơ sở cấy mơ và các trung tâm nghiên cứu đĩng trên địa bàn Đà Lạt cung cấp giống. Qua nuơi cấy bằng đỉnh sinh trưởng người ta đã tạo ra hàng loạt các cây giống đồng đều và cĩ được những giống phù hợp với vùng đất cũng như điều kiện sản xuất.
Phương pháp nhân giống cổ truyền thường được người dân sử dụng do rất dễ
thực hiện lại khơng tốn kém và khơng mất nhiều thời gian. Tuy nhiên nhân giống
bằng phương pháp này khơng tạo ra được giống với số lượng lớn, chất lượng lại khơng đồng đều và việc nhân giống này cĩ thể làm giảm năng suất ở những thế hệ
tiếp theo. Với một số giống mà đặc tính sinh cây con bằng ngĩ hạn chế thì việc
nhân giống theo phương pháp cổ truyền khơng đạt hiệu quả.
Nhân giống bằng phương pháp cấy mơ địi hỏi phải cĩ cơ sở thực hiện, phải
cĩ kỹ thuật chuyên mơn và cần phải cĩ một thời gian nhất định. Tuy nhiên ưu điểm
của phương pháp này là cĩ được số lượng cây giống lớn, chất lượng đồng đều, và cĩ thể nhân giống được một số giống dâu mà khả năng sản sinh cây ngĩ của giống
hạn chế. Hơn nữa việc nhân giống bằng cấy mơ tạo ra cây con sạch bệnh và đáp ứng được nhu cầu về cây giống của người nơng dân. [18]
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU2.1.1. Alginate 2.1.1. Alginate
Alginate được tách chiết từ rong mơ S. mcclurei thu ở vùng biển Hịn Chồng
theo quy trình acid hĩa như sau:
Pha lỗng Lọc sơ bộ - Nước 600C - Pha lỗng 2-3 lần Rong mơ Chọn rửa Ngâm HCHO Rửa sạch Ngâm HCl Nấu chiết - Dung dịch Na2CO3 1,68 % - V/W= 20 lần. - Nhiệt độ nấu 55÷600C - Thời gian nấu 2giờ
- Dịch HCHO 1,2%
- V/W= 20 lần.
- Thời gian ngâm 24 giờ
- Nhiệt độ phịng
- HCl 0,3% - V/W= 20 lần.
- Thời gian ngâm 15 phút. - Nhiệt độ phịng
Rửa sạch, để
Hình 2.1. Quy trình sản xuất alginate từ rong mơ S. mcclurei
2.1.2. Các hĩa chất dùng trong tạo gel alginate.
- GDL (glucono-δ-lactone) dạng bột của hãng Sigma.
GDL là một chất acid hĩa. Nĩ là este dạng vịng của D-gluconic acid. Khi
cho vào nước nĩ dễ dàng hình thành dạng cân bằng của hỗn hợp lactone GDL và acid gluconic. Nĩ cĩ cơng thức hĩa học C6H10O6. Trọng lượng phân tử 178,14
g/mol. GDL tinh khiết dạng bột màu trắng, khơng mùi.
Gluconolactone Gluconic acid
Hình 2.2. Cơng thức cấu tạo của GDL và gluconic acid
- CaCO3 dạng bột trắng của Trung Quốc.
Javen 5 ‰ Lọc tinh Dịch lọc H2SO4 10% Rửa kết tủa Ép tách nước Trung hịa Na2CO3 Phơi (sấy) Cồn 960 Nghiền nhỏ Bột Na- Alginate
2.1.3. Vật liệu nuơi cấy mơ
Tơi chọn đối tượng thực vật nghiên cứu nuơi cấy mơ là cây dâu tây Mỹ Đá cĩ tên khoa học Fragaria vesca Lđược trồng tại các vườn dâu ở Đà Lạt.
Đây là giống dâu tây đáp ứng yêu cầu chất lượng quả thơm, ngon, thịt cứng
cĩ thể vận chuyển đi xa, năng suất cao và thích nghi tốt với điều kiện khí hậu thổ nhưỡng Đà Lạt. Hiện nay nơng dân Đà Lạt đang tăng diện tích trồng rau, hoa trong đĩ cĩ dâu tây. Giống dâu tây Mỹ Đá được người dân chọn nhiều nhất.
Đây cũng là một trong những giống cây đáp ứng yêu cầu chuyển đổi cơ cấu cây
trồng trong mục tiêu xây dựng nền nơng nghiệp cơng nghệ cao tại Đà Lạt- Lâm Đồng.
Chọn đỉnh sinh trưởng để nuơi cấy khởi đầu tạo những cây con sạch bệnh.
Phương pháp chọn mẫu và xử lý mẫu:
- Đỉnh sinh trưởng những cây dâu tây khỏe mạnh, phát triển tốt được dùng làm nguyên liệu để nuơi cấy khởi đầu.
- Rửa mẫu cấy bằng xà phịng. - Rửa lại bằng nước cất vơ trùng.
- Xử lý sơ bộ qua cồn 700 trong 30 giây sau đĩ tráng l ại bằng nước cất vơ trùng. - Khử trùng mẫu bằng dung dịch hypochloride calcium ở nồng độ 10% trong
vịng 15 phút. Trong quá trình khử trùng luơn lắc nhẹ để đảm bảo các mẫu được
khử trùng đều, đảm bảo mẫu khơng bị chết do tác động của hĩa chất khử trùng. - Sau đĩ mẫu được rửa lại bằng nước cất vơ trùng 4-5 lần. Mọi thao tác được
thực hiện trong tủ cấy vơ trùng.
- Sau đĩ, mẫu được đưa cấy vào mơi trường MS cĩ bổ sung BA để tái sinh
chồi. Sau 48giờ mẫu được cấy chuyền sang mơi trường mới cĩ cùng thành phần
nhằm loại bỏ các chất hĩa nâu cĩ trên mơi trường. Sau 4 tuần nuơi cấy, các mẫu
sống, sạch, cĩ sức sống tốt được chọn để tiến hành nghiên cứu trong đề tài.
Quá trình xử lý mẫu được tiến hành theo nghiên cứu của Indra [36] và của
hai tác giả Phạm Xuân Tùng và Nguyễn Thị Lan [25].
Trong kết quả và biện luận của đề tài tơi chỉ nghiên cứu cơng đoạn nhân chồi và
2.1.4. Mơi trường nuơi cấy mơ dâu tây.
Theo kết quả nghiên cứu của các tác giả Indra D.Bhatt và Uppenandra Dhar [32]; Phạm Xuân Tùng và Phạm Thị Lan [25] ; Văn Thị Như Ngọc [18] cho thấy cây
dâu tây Mỹ Đá phát triển thích hợp trên mơi trường MS.
Do vậy tơi chọn mơi trường MS là mơi trường cơ bản cho nghiên cứu trong
luận văn.
Thành phần cơ bản của mơi trường MS (Murashige-Skoog, 1962) như sau:[15]
a. Khống đa lượng (g/l)
- Kali nitrat (KNO3) 19,0 - Amon nitrat (NH4NO3) 16,5 - Canxi clorua (CaCl2. 2H2O) 4,4 - Magiê sulfat (MgSO4. 7H2O 3,7 - Kali monophosphat (KH2PO4) 1,7
b. Khống vi lượng (mg/l)
- Boric axit (H3BO3) 6,2 - Mangan sulfat (MnSO4 . 4H2O) 22,3 - Kẽm sulfat (ZnSO4. 7H2O) 8,6 - Kali iot (KI) 0,83 - Natri molypdat (Na2MoO4. 2H2O) 0,25 - Đồng sulfat (CuSO4. 5H2O) 0,025 - Coban sulfat (CoCl2. 6H2O) 0,25 - Na2- EDTA 37,3 - Sắt sulfat (FeSO4. 7H2O) 27,8 c. Vitamin (mg/l) - Thiamin- HCl (B1) 0,1 - Myo- inositol 100 - Glycine 2 - Nicotinic acid 0,5 - Piridoxin – HCl (B6) 0,5
Cũng theo nghiên cứu của các tác giả trên thì mơi trường dùng cho nhân chồi
dâu tây sử dụng loại cytokinin BA thích hợp hơn Kin, cũng như sử dụng phối hợp
BA và Kin. Sử dụng BA riêng lẻ ở nồng độ 0,3 mg/l cho hệ số nhân chồi cao nhất
với chất lượng chồi khá tốt.
Trong giai đoạn hình thành rễ, tác giả Indra D. Bhatt và Uppeandra [36] cĩ kết luận rằng rễ của loài dâu tây Fragaria x ananasa ra rễ tốt nhất khi sử dụng NAA
với liều lượng thấp (0,1mg/l), nhưng theo nghiên cứu của tác giả Văn Thị Như
Ngọc [18] với cây dâu tây Mỹ Đá thì auxin NAA khơng phù hợp và mơi trường
thích hợp nhất là 1/2MS +0,2mg/l IBA + 0,75g/l than hoạt tính.
Do đĩ tơi chọn mơi trường nhân chồi là mơi trường MS + 20g/l đường
sucrose + 0,3mg/l BA, được làm đặc bằng agar 8g/l hoặc alginate với nồng độ
nghiên cứu.
Mơi trường ra rễ là mơi trường khống MS/2 + vitamin Morel +20g/l đường
sucrose + chất kích thích sinh trưởng IBA 0,2mg/l và 0,75g/l than hoạt tính, đặc làm
đặc bằng agar 8 g/l hoặc alginate với nồng độ nghiên cứu.
pH mơi trường được điều chỉnh đến 5,8 bằng dung dịch KOH 0,1N hoặc HCl
0,1N trước khi đem đi hấp khử trùng ở 1210C; 1,3 atm. Mơi trường được lưu giữ ở điều kiện thường trong 7-10 ngày để kiểm tra khả năng nhiễm trước khi cấy.
2.1.5. Phịng thí nghiệm và các dụng cụ
- Hệ thống phịng nuơi cấy mơ gồm các phịng: phịng pha mơi trường,
phịng cấy, phịng dự trữ mơi trường, phịng sáng.
- Các trang thiết bị và dụng cụ thiết yếu trong phịng nuơi cấy mơ.
- Cân kỹ thuật, cân phân tích, máy đo pH, nồi hấp vơ trùng autoclave, tủ cấy
vơ trùng.
- Các dụng cụ đong: ống đong, cốc đong, bình định mức, Micropipet,...
- Các dụng cụ cấy bao gồm: khay inox, panh inox, dao inox, kéo inox, bình tam giác các loại, ống nghiệm, khăn lau,.v.v. tất cả đã được hấp vơ trùng trước khi đưa vào thao tác trong box cấy.
2.1.6. Điều kiện nuơi cây
- Nhiệt độ phịng: 23÷250C . - Độ ẩm : 65 ÷70%.
- Cường độ chiếu sáng: 2500 ÷ 3000 lux.
- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
2.1.7. Điều kiện kỹ thuật
- Dụng cụ và các trang thiết bị đều được khử trùng.
- Mơi trường nuơi cấy được hấp vơ trùng ở 1210C, 1,2atm trong 25 phút và
được kiểm tra vơ trùng trước khi cấy mẫu.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp kiểm tra chất lượng ban đầu của alginate.
- Xác định hàm lượng ẩm theo phương pháp trọng lượng.
- Xác định màu sắc theo phương pháp cảm quan.
- Xác định độ nhớt được thực hiện trên nhớt kế quay.
Chuẩn bị dịch đo độ nhớt: Cân chính xác 2g alginate (đã trừ đi độ ẩm) hồ tan vào 200ml nước cất. Đem lọc phần khơng tan bằng 2 lớp vải mịn để đảm bảo dung dịch được đồng nhất. Tiến hành loại khí trên máy siêu âm trong thời gian 5 phút. Dịch chuẩn bị được đo ở 200C ở các tốc độ quay 200, 400,
600 vịng/phút. Kết quả được xác định dựa vào đồ thị chuẩn của dung dịch
