tốc độ nhân chồi dâu tây.
Nồng độ alginate và CaCO3 tốt nhất từ các nghiên cứu ở mục 2.2.3.1 và 2.2.3.2 được dùng trong thí nghiệm này để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến hiệu quả nhân chồi dâu tây khi cấy trên giá thể alginate.
Quá trình nhân chồi là một bước rất quan trọng, nĩ quyết định đến số lượng
cây con trong quá trình nhân cây sau này, quyết định giá thành của cây con. Vì vậy
nghiên cứu tìm ra mơi trường nhân chồi tối ưu là rất cần thiết.
Để kích thích quá trình tạo chồi trong nuơi cấy mơ ta cần bổ sung vào mơi
trường nuơi cấy các chất KTSTTV là cytokinin như BA, Kinetin.
BA cĩ ảnh hưởng rất tốt trong quá trình nhân chồi cây dâu tây. Do đĩ tơi tiến
hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BA đối với quá trình nhân chồi để tìm ra nồng độ BA tối ưu trong nhân chồi với mơi trường tạo thành từ giá thể alginate.
- Cách tiến hành:
Mẫu cấy: các cụm được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 4 tuần
nuơi cấy. Cụm được tách thành từng cụm nhỏ tương đối đều nhau về kích thước và trọng lượng. Các mẫu được cấy vào các bình mơi trường nhân chồi chứa cytokinin
BA với nồng độ khác nhau.
Điều kiện thí nghiệm: Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 2 mẫu. Mẫu cấy được nuơi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2500- 3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Các nghiệm thức: Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) C9 0,1 C10 0,2 C11 0,3 C12 0,4 C13 0,5
- Chỉ tiêu theo dõi: số chồi trung bình/cụm; chiều cao trung bình của các chồi
trong mỗi cụm chồi; trọng lượng cụm sau 30 ngày nuơi cấy.
2.2.3.4. So sánh khả năng nhân cụm dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar .
- Cách tiến hành:
Mẫu cấy là các cụm được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 4 tuần
nuơi cấy. Cụm được tách thành từng cụm nhỏ tương đối đều nhau về kích thước và trọng lượng. Các mẫu được cấy vào các bình mơi trường nhân chồi.
Thành phần mơi trường:
- Khống MS
- Đường sucrose 20g/l. - Vitamin Morel.
- BA nồng độ tốt nhất từ nghiên cứu ở mục 2.2.3.3.
- Với nghiệm thức alginate bổ sung alginate; CaCO3 tốt nhất từ các nghiên cứu ở mục 2.2.3.1 và 2.2.3.2. Bổ sung GDL ở nồng độ tương ứng với CaCO3. - Với nghiệm thức agar đối chứng : bổ sung 0,8g/l agar.
Mẫu cấy được nuơi trong phịng nuơi cấy với điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2500- 3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 2 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi trung bình/cụm; chiều cao trung bình của các chồi
trong mỗi cụm chồi; trọng lượng cụm sau 30 ngày nuơi cấy.
2.2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong mơi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro.
Sự phát triển sung mãn của hệ rễ cây con trong nuơi cấy in vitro là điều kiện
thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà lưới và trên đồng
ruộng. Trong nuơi cấy in vitro, sự cĩ mặt của cytokinin trên mơi trường thường hạn
chế khả năng ra rễ. Cây sẽ hình thành rễ trong mơi trường cĩ bổ sung auxin hoặc
cộng sự,1984). Khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình rễ của
Fragaria x ananasa, Bhatt & Dhar (2000) kết luận: cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng
NAA với liều lượng thấp (0,1 mg/l).
Rễ của một số loài cây cĩ thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường nuơi cấy. Than hoạt tính tạo thuận lợi cho sự phát
triển của rễ nhờ khả năng hấp thụ các chất thải cĩ tính ức chế của bản thân cây hoặc
mơ nuơi cấy, đồng thời giảm cường độ ánh sánh vùng rễ phát triển.
Kết quả thí nghiệm của Phạm Xuân Tùng và Phạm Thị Lan [25] cho thấy mơi trường MS cĩ bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,2 g/l than họat tính cho bộ rễ của cây
dâu tây in vitro khá đẹp với số rễ / cây cao nhất (14,3) và chiều dài rễ vừa phải (1,2
cm). Nghiệm thức cĩ 0,3 mg/l IBA cho kết quả tuơng đương với số rễ là 12,9 rễ/cây
và chiều dài là 1,42 cm/rễ. Cerovic và Ruzic (1989) cho rằng mơi trường ra rễ in vitro tốt nhất là 1/2MS bổ sung 1g/l than họat tính và 1 mg/l IBA. Tuy nhiên, kết
quả này thu được trên những giống dâu tây khác.
Với lồi dâu tây Mỹ Đá auxin NAA khơng thích hợp và mơi trường ra rễ
thích hợp nhất là mơi trường 1/2 MS + 0,2mg/l IBA + 0,75g/l than hoạt tính [18]
Kế thừa kết quả của các tác giả trên tơi chọn mơi trường ra rễ là 1/2 MS +20g/l đường sucrose + 0,2mg/l IBA + 0,75g/l than hoạt tính để tiến hành các thí nghiệm trong cơng đoạn tái sinh rễ in vitro.
Các nghiệm thức gồm:
Nghiệm thức CaCO3 (mM) GDL (mM) Nồng độ alginate%( w/v)
R0 25 52 0,5
R1 25 52 1,0
R2 25 52 1,5
R3 25 52 2,0
R4 25 52 2,5
Mẫu cấy: các chồi cây được hình thành từ cụm nuơi sau 2 tháng. Chiều cao
Các nghiệm thức được bố trí hoàn tồn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần
5 bình; với 5 cây/bình.
Sau 30 ngày cấy chọn 10 cây cĩ tốc độ phát triển tương đối đều nhau để lấy số
liệu. Số liệu thu thập gồm số rễ trung bình / cây, chiều dài rễ trung bình / cây (cm).
2.2.3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong mơi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro.
Nồng độ alginate tốt nhất từ nghiên cứu ở mục 2.2.3.5 được dùng cho thí nghiệm này để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong mơi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro.
Mẫu cấy: các chồi cây được hình thành từ cụm nuơi sau 2 tháng. Chiều cao các chồi phải tương đối đồng đều nhau.
Các nghiệm thức được bố trí hoàn tồn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần
5 bình; với 5 cây/bình. Các nghiệm thức gồm: Nghiệm thức Nồng độ CaCO3 (mM) Nồng độ GDL ( mM) R5 15 32 R6 20 42 R7 25 52
Số liệu thu thập sau 30 ngày cấy: số rễ trung bình / cây, chiều dài rễ trung
bình / cây (cm).
2.2.2.7. So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar. giá thể agar.
Mẫu cấy: các chồi cây được hình thành từ cụm nuơi sau 2 tháng. Chiều cao
các chồi phải tương đối đồng đều nhau.
Thành phần mơi trường tái sinh rễ:
- Khống MS/2
- Đường sucrose 20g/l. - Vitamin Morel.
- IBA 0,2 mg/l.
- Than hoạt tính 0,75g/l
- Với nghiệm thức dùng alginate bổ sung alginate nồng độ tối ưu; CaCO3 tối ưu và GDL tương ứng.
- Với nghiệm thức ĐC : bổ sung 0,8g/l agar.
Các nghiệm thức được bố trí hoàn tồn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần
5 bình; với 5 cây/bình.
Số liệu thu thập sau 30 ngày cấy: số rễ trung bình / cây, chiều dài rễ trung
bình / cây (cm) và trọng lượng cây (mg).
2.2.3. Phương pháp lấy các chỉ tiêu và xử lý số liệu Chỉ tiêu về số chồi, số rễ/ mẫu cấy
Trong mỗi thí nghiệm lựa chọn những bình cĩ tốc độ tương đối đồng đều,
lấy ngẫu nhiên 10 cây để lấy số liệu. Đếm số chồi, số rễ/ mẫu.
Chỉ tiêu về chiều cao cây và chiều dài rễ
Chiều cao cây: được đo từ gốc cây đến lá dài nhất của cây với thước đo cĩ độ đo chính xác đến milimet.
Chiều dài rễ: được đo từ cuối gốc của cây đến đầu rễ dài nhất của cây với thước đo cĩ độ đo chính xác đến milimet.
Chỉ tiêu trọng lượng tươi.
Sử dụng cân phân tích cĩ độ chính xác đến 0,1 miligam. Cũng với những
bình mẫu lấy chỉ tiêu về số chồi, chiều cao chồi. Cân những mẫu này để lấy chỉ tiêu trọng lượng tươi của mẫu.
Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm được bố trí theo mơ hình khối
ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần và các số liệu sau khi thu nhập được xử lí thống kê theo
phương pháp ANOVA và sử dụng text LSD0,05 và phân tích sai số chuẩn (SE) bằng
các hàm tính tốn trong Microsoft Excel.
* Phương phápphân tích phương sai (Analysis of variance (ANOVA)) [10]:
Phương pháp này được sử dụng đểxác định sự sai khác giữa các trung bình. Kết quả phân tích phương sai được tĩm tắt trên bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng phân tích phương sai Nguồn biến động Độ tự do DF (Degree of freedom) Tổng bình phương SS Trung bình bình phương MS F tính F bảng ( = 0,05 hoặc 0,01) Between Groups (Treatment)
a -1 SSA MSA Tra bảng
Within Groups (Error) N - a SSE MSE / Tổng (Total) N - 1 SST0 /
Phương pháp bố trí thí nghiệm theo a mức yếu tố tác động khác nhau đến nhân tố cần phân tích, mỗi mức đ ược lặp lại 3 lần, N là tổng số các thí nghiệm thực hiệ n.
SSA: Tổng bình phương nghiệm thức (biểu thị sự sai khác do trung bình các nghiệm thức khác nhau)
SSE: Tổng bình phương sai số ngẫu nhiên (biểu thị sự sai khác trong các mẫu
của nghiệm thức) SST0: Tổng bình phương tồn bộ. 1 a SSA MSA a N SSE MSE
Nếu Ftính>Fbảng thì kết luận các số trung bình cĩ khác nhau ở mức ý nghĩa .
Để so sánh sự sai khác giữa hai giá trị trung bình ta dùng text LSD0.05 [64] Với LSD0,05 ( the least significant difference): Sai khác tối thiểu cĩ ý nghĩaở
mức α=0.05. LSDα = tα/2[Error df] N MSE) ( 2
Với giá trị tα/2 tra bảng t-distribution.
Nếu sự sai khác giữa trung bình 2 nhĩm lớn hơn hoặc bằng LSDα thì sự sai khác này là đáng kể ở mức ý nghĩa α.
MSA MSE
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu về tính chất ban đầu của alginate.
Bảng 3.1: Một số thành phần của alginate và agar nghiên cứu.
Mẫu Độ nhớt (mPa.s) Hàm lượng ẩm (%) Protein %g/g Glucid % (g/g) Lipid %(g/g) Khống % (g/g) A1 103,6 17,51 0,010 43,67 0,69 0,68 A2 _ 21,15 0,010 69,64 0,92 0,98
Chú thích: A1 mẫu alginate ; A2 : mẫu agar.
Màu sắc của alginate: alginate cĩ d ạng bột mịn, màu vàng ngà, khơng lẫn tạp chất.
Agar dạng bột mịn, cĩ màu trắng ngà, hịa tan hết trong nước nĩng, khơng lẫn tạp chất.
3.2. Kết quả nghiên cứu về đặc tính lý hĩa của hệ gel alginate. 3.2.2. Kết quả xác định pH của hệ gel alginate.
Trong nuơi cấy mơ độ pH của mơi trường dinh dưỡng ảnh hưởng trực tiếp tới
quá trình thu nhận các chất dinh dưỡng từ mơi trường vào tế bào. Đối với mỗi loại mơi trường nhất định và đối từng trường hợp cụ thể của các lồi cây mà điều chỉnh độ pH của mơi trường với mức ổn định ban đầu. Giá trị pH của mơi trường thích
hợp cho sự sinh trưởng và phát triển ở nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,0-6,0. Cĩ những lồi sinh trưởng phát triển tốt ở pH kiềm như cây mận (pH=8,6). Straus và Larue (1954) nhận thấy mơ sẹo nội nhũ ngơ thì pH kiềm thuận lợi cho sự tăng sinh
khối. Khi pH thấp (mơi trường acid) sẽ hoạt hĩa các enzim hidrolaza dẫn tới kìm hãm sinh trưởng đồng thời kích thích sự hĩa già của các tế bào trong nuơi cấy mơ.
Trong quá trình nuơi cấy pH của mơi trường cĩ thể giảm xuống do một số mẫu thực
vật sản sinh ra các acid hữu cơ.
Việc nghiên cứu để xác định pH của mơi trường cho phù hợp với đối tượng
nuơi cấy là rất quan trọng. Vì vậy tơi tiến hành thí nghiệm này để xác định biến đổi
ra nồng độ GDL và CaCO3 phù hợp để tạo ra mơi trường cĩ pH phù hợp trong nuơi
cấy mơ thực vật.
Kết quả thí nghiệm này được thể hiện ở bảng 2.1(phụ lục 2) và đồ thị 3.1.
Đồ thị 3.1: BIến đổi pH của hệ gel alginate theo nồng độ GDL và CaCO3. Nhận xét: Ở cùng nồng độ alginate và CaCO3 khi lượng GDL tăng thì pH của hệ gel giảm xuống. Khi hàm lượng H+ dư so với nhu cầu của CaCO3 thì pH hệ
gel giảm xuống mức acid. Cụ thể với CaCO3 15 mM thì ở GDL 30 thì gel đạt pH
trung tính, với CaCO3 20mM thì gel trung tính ở nồng độ GDL xấp xỉ 40mM, với
CaCO3 25mM thì pH trung tính với GDL xấp xỉ 50mM.
Ở cùng nồng độ GDL khi hàm lượng CaCO3 tăng thì pH hệ gel cao hơn do
nhu cầu H+ của CaCO3 tăng nên lượng H+ tự do ít nên pH ít giảm hơn. Nhìn vào đồ
thị ta thấy pH của hệ gel alginate biến thiên theo dạng đường cong acid/bazơ. Tương ứng với lượng của CaCO3 chất nhận 2 proton và GDL chất cho H+(cho 1 proton) tạo hệ gel trung tính. Quá trình này diễn ra như mơ tả ở hình 3.1.
Trong mơi trường nuơi cấy mơ pH phù hợp là 5,8-6,0. Do vậy với hệ gel
alginate thì để đạt được pH yêu cầu thì lượng dùng là GDL 32 mM khi CaCO3
15mM; GDL 42 mM khi CaCO3 20mM; GDL 52 mM khi CaCO3 25mM.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Nồng độ GDL (mM) pH CaCO3 15mM CaCO3 20mM CaCO3 25mM
Hình 3.1. Hình mơ phỏng tạo gel alginate khi cĩ mặ t của tác nhân GDL và CaCO3.
3.2.3. Kết quả xác định độ bền hệ gel alginate.
Nuơi cấy mơ trên mơi trường đặc cĩ nhiều ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu đi xa. Vì thế nĩ được ứng dụng rộng rãi trong nuơi cấy cơ quan tách rời, vi nhân giống, nuơi cấy mơ sẹo, nuơi cấy bao phấn.
Với mơi trường cấy đặc thì nồng độ tác nhân làm đặc (agar hay alginate) là thành phần quyết định đến trạng thái vật lý của mơi trường. Nồng độ cao của các
chất làm đặc, mơi trường trở nên quá cứng, sự khuếch tán của các chất dinh dưỡng như hấp thụ của mơ gặp khĩ khăn do nĩ ảnh hưởng đến tính thẩm thấu của mơi trường (theo nghiên cứu của Bhojwani và Razdan, 1983). Tuy nhiên nếu nồng độ
quá thấp thì cũng xẩy ra hiện tượng mọng nước làm tinh thể hĩa mơ cấy. Việc
nghiên cứu để tìm ra nồng độ chất tạo gel trong mơi trường thích hợp nhằm tạo độ
cứng mơi trường phù hợp cho đối tượng nuơi cấy là rất cần thiết.
Vì vậy thí nghiệm xác định độ bền hệ gel alginate dùng trong nuơi cấy mơ là cần thiết. Sau khi tiến hành thí nghiệm này tơi thu được kết quả như bảng 2.2 (phụ
Đồ thị 3.2. Biến đổi độ bền của hệ gel alginate theo nồng độ alginate và CaCO3.
MĐC1 = 141; MĐC2 = 175; MĐC3 =257
Nhận xét:
Cấu trúc phân tử alginate cho thấy các đoạn mạch ngắn giàu M sẽ khơng
tham gia quá trình tạo gel. Chỉ cĩ các đoạn mạch chứa từ GG kề nhau mới tham gia
tạo gel. Sự tạo gel của alginate là do sự hình thành liên kết giữa các phân tử alginate
và ion Ca2+, do đĩ nồng độ ion Ca2+ và nồng độ alginate sẽ ảnh hưởng đến sự tạo
gel. Nồng độ alginate trong dung dịch ban đầu càng lớn thì số mối liên kết sẽ nhiều và do đĩ cần nồng độ ion Ca2+ càng lớn. Độ bền gel cũng tăng dần theo chiều tăng
của nồng độ alginate và nồng độ CaCO3. Tuy nhiên ở một nồng độ Ca2+ xác định độ
bền gel đạt giá trị cực đại ở một nồng độ alginate nào đĩ mà lượng ion Ca2+ đủ để
kết hợp hết với lượng guluronic acid. Sau đĩ độ bền gel giảm dần theo chiều tăng lượng alginate do thiếu hụt Ca2+để tạo gel và do đĩ độ bền gel giảm đi.
Cụ thể kết quả ở thí nghiệm này ở cùng nồng độ alginate khi tăng nồng độ