- Hệ thống phịng nuơi cấy mơ gồm các phịng: phịng pha mơi trường,
phịng cấy, phịng dự trữ mơi trường, phịng sáng.
- Các trang thiết bị và dụng cụ thiết yếu trong phịng nuơi cấy mơ.
- Cân kỹ thuật, cân phân tích, máy đo pH, nồi hấp vơ trùng autoclave, tủ cấy
vơ trùng.
- Các dụng cụ đong: ống đong, cốc đong, bình định mức, Micropipet,...
- Các dụng cụ cấy bao gồm: khay inox, panh inox, dao inox, kéo inox, bình tam giác các loại, ống nghiệm, khăn lau,.v.v. tất cả đã được hấp vơ trùng trước khi đưa vào thao tác trong box cấy.
2.1.6. Điều kiện nuơi cây
- Nhiệt độ phịng: 23÷250C . - Độ ẩm : 65 ÷70%.
- Cường độ chiếu sáng: 2500 ÷ 3000 lux. - Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày.
2.1.7. Điều kiện kỹ thuật
- Dụng cụ và các trang thiết bị đều được khử trùng.
- Mơi trường nuơi cấy được hấp vơ trùng ở 1210C, 1,2atm trong 25 phút và
được kiểm tra vơ trùng trước khi cấy mẫu.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp kiểm tra chất lượng ban đầu của alginate.
- Xác định hàm lượng ẩm theo phương pháp trọng lượng.
- Xác định màu sắc theo phương pháp cảm quan.
- Xác định độ nhớt được thực hiện trên nhớt kế quay.
Chuẩn bị dịch đo độ nhớt: Cân chính xác 2g alginate (đã trừ đi độ ẩm) hồ tan vào 200ml nước cất. Đem lọc phần khơng tan bằng 2 lớp vải mịn để đảm bảo dung dịch được đồng nhất. Tiến hành loại khí trên máy siêu âm trong thời gian 5 phút. Dịch chuẩn bị được đo ở 200C ở các tốc độ quay 200, 400,
600 vịng/phút. Kết quả được xác định dựa vào đồ thị chuẩn của dung dịch
sucrose.(phụ lục 1).
- Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
- Xác định hàm lượng lipid bằng phương pháp foulch. - Xác định hàm lượng glucid bằng phương pháp debois.
2.2.2. Các thí nghiệm kiểm tra tính chất lý hĩa của hệ gel alginate. 2.2.2.1. Xác định biến đổi pH của hệ gel theo nồng độ GDL và CaCO3.
Sau một số thí nghiệm khảo sát tạo được hệ gel alginate đồng nhất tơi tiến hành xác định pH của hệ gel theo sự biến thiên của GDL và CaCO3 như sau:
Nồng độ CaCO3 : 15÷ 25 (mM) Nồng độ GDL : 10 ÷ 60 (mM)
Tiến hành cố định hàm lượng alginate 1% và CaCO3; cho GDL dao động
trong khoảng 10÷60mM và xác định pH của hệ gel.
Phương pháp tiến hành: hồ tan alginate trong nước cất để thu được dung
dịch đồng nhất, thêm mơi trường, điều chỉnh thể tích tương ứng, điều chỉnh pH dịch
về 5,8-6 với acid loãng, thêm CaCO3 với nồng độ nghiên cứu, đem hấp vơ trùng, rĩt vào cốc với thể tích đều nhau, để nguội đến nhiệt độ phịng.
Hệ gel alginate Xác định pH Alginate 1% GDL 10÷ 60 (mM) Huyền phù Dịch mơi trường Hấp vơ trùng Điều chỉnh pH CaCO3 15÷25 (mM)
GDL được hịa tan trong một lượng nhỏ nước cất, lọc vơ trùng qua giấy lọc Wattman 0,45µm, sau đĩ được thêm vào huyền phù mơi trường chứa alginate và CaCO3 vơ trùng lượng tương ứng với nồng độ nghiên cứu, lắc đều, để qua đêm và tiến hành đo pH bằng thiết bị đo pH.
2.2.2.2. Xác định độ bền của hệ gel alginate.
Alginate với nồng độ nghiên cứu được cho hịa tan trong nước cất, thêm mơi
trường điều chỉnh thể tích tương ứng, điều chỉnh pH về 5,8-6 bằng HCl 0,01N, sau
đĩ thêm CaCO3 đã được phân tán trong một lượng nhỏ nước cất với nồng độ nghiên cứu, huyền phù tạo thành được hấp vơ trùng. Rĩt vào cốc 100ml (50ml/cốc), làm nguội đến nhiệt độ phịng sau đĩ cho vào thể tích tương ứng dịch GDL đã lọc vơ
trùng theo nồng độ nghiên cứu. Lắc đều để giải phĩng Ca2+ tạo hệ gel đồng nhất.
Để qua đêm và tiến hành đo độ bền.
Mẫu agar đối chứng: agar (0,7÷ 0,9%) được cho vào thể tích mơi trường tương ứng, sau đĩ đun nhẹ cho tan và đem hấp vơ trùng ở 1210C; 1,3atm. Sau đĩ rĩt
ra cốc 100ml (50ml/ cốc), để nguội đến nhiệt độ phịng để tạo gel. Để qua đêm và tiến hành đo độ bền gel.
Đo độ bền gel alginate và agar trên thiết bị đo lưu biến gel RHEO- METER.
Alginate 0,5÷2,5 % Hệ gel alginate Đo độ bền gel GDL 10÷60 (mM) Huyền phù Dịch mơi trường Hấp vơ trùng Điều chỉnh pH CaCO3 15÷25 (mM)
Các nghiệm thức: CaCO3 (mM) Alginate (%) 15 20 25 0,5 M1 M10 M19 0,75 M2 M11 M20 1,0 M3 M12 M21 1,25 M4 M13 M22 1,5 M5 M14 M23 1,75 M6 M15 M24 2,0 M7 M16 M25 2,25 M8 M17 M26 2,5 M9 M18 M27
Mẫu agar đối chứng : Mđc1 : 0,7% ; Mđc2 : 0,8 % ; Mđc3 : 0,9%
2.2.3. Nghiên cứu ứng dụng hệ gel alginate trong nuơi cấy mơ.
2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong mơi trường đến tốc độ nhân chồi dâu tây. tốc độ nhân chồi dâu tây.
Cách tiến hành: Mẫu dâu tây ban đầu cho thí nghiệm là các cụm chồi phát
triển từ các mẫu đã được tái sinh sau 4 tuần nuơi cấy. Cụm được tách thành từng đơn vị riêng lẻ cĩ chiều cao và trọng lượng tương đối đồng đều. Được cấy vào các bình mơi trường nhân chồi (mơi trường MS + 20g/l đường sucrose + 0,3 mg/l BA)
được làm đặc bằng alginate với các nồng độ khác nhau.
Mỗi nghiệm thức được tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 2 mẫu. Mẫu sau khi cấy được nuơi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2500-3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Chỉ tiêu theo dõi: Số liệu được ghi nhận sau 30 ngày nuơi cấy bao gồm số
chồi trung bình/cụm; chiều cao trung bình của các chồi/cụm; trọng lượng cụm, chất lượng chồi.
Các nghiệm thức gồm:
Nghiệm thức CaCO3(mM) GDL (mM) Nồng độ alginate %( w/v)
C1 25 52 0,5
C2 25 52 1,0
C3 25 52 1,5
C4 25 52 2,0
C5 25 52 2,5
2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong mơi trường đến tốc độ nhân chồi dâu tây. tốc độ nhân chồi dâu tây.
Bố trí thí nghiệm: Mẫu cấy là các cụm chồi được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 4 tuần nuơi cấy. Cụm được tách thành từng cụm nhỏ tương đối đều nhau về kích thước và trọng lượng. Mẫu được cấy vào các bình mơi trường
nhân chồi cĩ bổ sung alginate với nồng độ tối ưu thu được từ nghiên cứu ở mục
2.2.3.1 và bổ sung CaCO3 với nồng độ nghiên cứu.
Mỗi nghiệm thức tiến hành lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, 2 mẫu/bình. Mẫu
sau khi cấy được nuơi trong phịng nuơi cây với thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày,
cường độ chiếu sáng là 2500-3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân (số chồi/cụm); chiều cao chồi, trọng lượng cụm
chồi (g) sau 30 ngày nuơi cấy.
Các nghiệm thức:
Nghiệm thức Nồng độ CaCO3 (mM) Nồng độ GDL (mM)
C6 15 32
C7 20 42
2.2.3.3. Nghiên cứuảnh hưởng nồng độ 6-benzylamino purine (BA) đến tốc độ nhân chồi dâu tây. tốc độ nhân chồi dâu tây.
Nồng độ alginate và CaCO3 tốt nhất từ các nghiên cứu ở mục 2.2.3.1 và 2.2.3.2 được dùng trong thí nghiệm này để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến hiệu quả nhân chồi dâu tây khi cấy trên giá thể alginate.
Quá trình nhân chồi là một bước rất quan trọng, nĩ quyết định đến số lượng
cây con trong quá trình nhân cây sau này, quyết định giá thành của cây con. Vì vậy
nghiên cứu tìm ra mơi trường nhân chồi tối ưu là rất cần thiết.
Để kích thích quá trình tạo chồi trong nuơi cấy mơ ta cần bổ sung vào mơi
trường nuơi cấy các chất KTSTTV là cytokinin như BA, Kinetin.
BA cĩ ảnh hưởng rất tốt trong quá trình nhân chồi cây dâu tây. Do đĩ tơi tiến
hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của BA đối với quá trình nhân chồi để tìm ra nồng độ BA tối ưu trong nhân chồi với mơi trường tạo thành từ giá thể alginate.
- Cách tiến hành:
Mẫu cấy: các cụm được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 4 tuần
nuơi cấy. Cụm được tách thành từng cụm nhỏ tương đối đều nhau về kích thước và trọng lượng. Các mẫu được cấy vào các bình mơi trường nhân chồi chứa cytokinin
BA với nồng độ khác nhau.
Điều kiện thí nghiệm: Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 2 mẫu. Mẫu cấy được nuơi trong điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2500- 3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Các nghiệm thức: Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) C9 0,1 C10 0,2 C11 0,3 C12 0,4 C13 0,5
- Chỉ tiêu theo dõi: số chồi trung bình/cụm; chiều cao trung bình của các chồi
trong mỗi cụm chồi; trọng lượng cụm sau 30 ngày nuơi cấy.
2.2.3.4. So sánh khả năng nhân cụm dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar .
- Cách tiến hành:
Mẫu cấy là các cụm được tái sinh từ các đỉnh sinh trưởng dâu tây sau 4 tuần
nuơi cấy. Cụm được tách thành từng cụm nhỏ tương đối đều nhau về kích thước và trọng lượng. Các mẫu được cấy vào các bình mơi trường nhân chồi.
Thành phần mơi trường:
- Khống MS
- Đường sucrose 20g/l. - Vitamin Morel.
- BA nồng độ tốt nhất từ nghiên cứu ở mục 2.2.3.3.
- Với nghiệm thức alginate bổ sung alginate; CaCO3 tốt nhất từ các nghiên cứu ở mục 2.2.3.1 và 2.2.3.2. Bổ sung GDL ở nồng độ tương ứng với CaCO3. - Với nghiệm thức agar đối chứng : bổ sung 0,8g/l agar.
Mẫu cấy được nuơi trong phịng nuơi cấy với điều kiện chiếu sáng 16 giờ/ngày với cường độ chiếu sáng là 2500- 3000lux và nhiệt độ 23 - 25oC.
Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình, mỗi bình 2 mẫu.
Chỉ tiêu theo dõi: số chồi trung bình/cụm; chiều cao trung bình của các chồi
trong mỗi cụm chồi; trọng lượng cụm sau 30 ngày nuơi cấy.
2.2.3.5. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ alginate trong mơi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro.
Sự phát triển sung mãn của hệ rễ cây con trong nuơi cấy in vitro là điều kiện
thiết yếu cho sự phát triển tốt của cây con trong điều kiện nhà lưới và trên đồng
ruộng. Trong nuơi cấy in vitro, sự cĩ mặt của cytokinin trên mơi trường thường hạn
chế khả năng ra rễ. Cây sẽ hình thành rễ trong mơi trường cĩ bổ sung auxin hoặc
cộng sự,1984). Khi nghiên cứu ảnh hưởng của auxin (IBA, NAA) lên sự hình rễ của
Fragaria x ananasa, Bhatt & Dhar (2000) kết luận: cây ra rễ tốt nhất khi sử dụng
NAA với liều lượng thấp (0,1 mg/l).
Rễ của một số loài cây cĩ thể được hình thành dễ dàng hơn khi bổ sung thêm than hoạt tính vào mơi trường nuơi cấy. Than hoạt tính tạo thuận lợi cho sự phát
triển của rễ nhờ khả năng hấp thụ các chất thải cĩ tính ức chế của bản thân cây hoặc
mơ nuơi cấy, đồng thời giảm cường độ ánh sánh vùng rễ phát triển.
Kết quả thí nghiệm của Phạm Xuân Tùng và Phạm Thị Lan [25] cho thấy mơi trường MS cĩ bổ sung 0,2 mg/l NAA, 0,2 g/l than họat tính cho bộ rễ của cây
dâu tây in vitro khá đẹp với số rễ / cây cao nhất (14,3) và chiều dài rễ vừa phải (1,2
cm). Nghiệm thức cĩ 0,3 mg/l IBA cho kết quả tuơng đương với số rễ là 12,9 rễ/cây
và chiều dài là 1,42 cm/rễ. Cerovic và Ruzic (1989) cho rằng mơi trường ra rễ in vitro tốt nhất là 1/2MS bổ sung 1g/l than họat tính và 1 mg/l IBA. Tuy nhiên, kết
quả này thu được trên những giống dâu tây khác.
Với lồi dâu tây Mỹ Đá auxin NAA khơng thích hợp và mơi trường ra rễ
thích hợp nhất là mơi trường 1/2 MS + 0,2mg/l IBA + 0,75g/l than hoạt tính [18]
Kế thừa kết quả của các tác giả trên tơi chọn mơi trường ra rễ là 1/2 MS +20g/l đường sucrose + 0,2mg/l IBA + 0,75g/l than hoạt tính để tiến hành các thí nghiệm trong cơng đoạn tái sinh rễ in vitro.
Các nghiệm thức gồm:
Nghiệm thức CaCO3 (mM) GDL (mM) Nồng độ alginate%( w/v)
R0 25 52 0,5
R1 25 52 1,0
R2 25 52 1,5
R3 25 52 2,0
R4 25 52 2,5
Mẫu cấy: các chồi cây được hình thành từ cụm nuơi sau 2 tháng. Chiều cao
Các nghiệm thức được bố trí hoàn tồn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần
5 bình; với 5 cây/bình.
Sau 30 ngày cấy chọn 10 cây cĩ tốc độ phát triển tương đối đều nhau để lấy số
liệu. Số liệu thu thập gồm số rễ trung bình / cây, chiều dài rễ trung bình / cây (cm).
2.2.3.6. Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong mơi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro.
Nồng độ alginate tốt nhất từ nghiên cứu ở mục 2.2.3.5 được dùng cho thí nghiệm này để nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ CaCO3 trong mơi trường đến khả năng ra rễ của cây dâu tây in vitro.
Mẫu cấy: các chồi cây được hình thành từ cụm nuơi sau 2 tháng. Chiều cao các chồi phải tương đối đồng đều nhau.
Các nghiệm thức được bố trí hoàn tồn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần
5 bình; với 5 cây/bình. Các nghiệm thức gồm: Nghiệm thức Nồng độ CaCO3 (mM) Nồng độ GDL ( mM) R5 15 32 R6 20 42 R7 25 52
Số liệu thu thập sau 30 ngày cấy: số rễ trung bình / cây, chiều dài rễ trung
bình / cây (cm).
2.2.2.7. So sánh khả năng ra rễ của cây dâu tây trên giá thể alginate và giá thể agar. giá thể agar.
Mẫu cấy: các chồi cây được hình thành từ cụm nuơi sau 2 tháng. Chiều cao
các chồi phải tương đối đồng đều nhau.
Thành phần mơi trường tái sinh rễ:
- Khống MS/2
- Đường sucrose 20g/l. - Vitamin Morel.
- IBA 0,2 mg/l.
- Than hoạt tính 0,75g/l
- Với nghiệm thức dùng alginate bổ sung alginate nồng độ tối ưu; CaCO3 tối ưu và GDL tương ứng.
- Với nghiệm thức ĐC : bổ sung 0,8g/l agar.
Các nghiệm thức được bố trí hoàn tồn ngẫu nhiên với ba lần lặp lại, mỗi lần
5 bình; với 5 cây/bình.
Số liệu thu thập sau 30 ngày cấy: số rễ trung bình / cây, chiều dài rễ trung
bình / cây (cm) và trọng lượng cây (mg).
2.2.3. Phương pháp lấy các chỉ tiêu và xử lý số liệu Chỉ tiêu về số chồi, số rễ/ mẫu cấy
Trong mỗi thí nghiệm lựa chọn những bình cĩ tốc độ tương đối đồng đều,
lấy ngẫu nhiên 10 cây để lấy số liệu. Đếm số chồi, số rễ/ mẫu.
Chỉ tiêu về chiều cao cây và chiều dài rễ
Chiều cao cây: được đo từ gốc cây đến lá dài nhất của cây với thước đo cĩ độ đo chính xác đến milimet.
Chiều dài rễ: được đo từ cuối gốc của cây đến đầu rễ dài nhất của cây với thước đo cĩ độ đo chính xác đến milimet.
Chỉ tiêu trọng lượng tươi.
Sử dụng cân phân tích cĩ độ chính xác đến 0,1 miligam. Cũng với những
bình mẫu lấy chỉ tiêu về số chồi, chiều cao chồi. Cân những mẫu này để lấy chỉ tiêu trọng lượng tươi của mẫu.
Phương pháp xử lý số liệu: Các thí nghiệm được bố trí theo mơ hình khối
ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần và các số liệu sau khi thu nhập được xử lí thống kê theo
phương pháp ANOVA và sử dụng text LSD0,05 và phân tích sai số chuẩn (SE) bằng
các hàm tính tốn trong Microsoft Excel.
* Phương phápphân tích phương sai (Analysis of variance (ANOVA)) [10]:
Phương pháp này được sử dụng đểxác định sự sai khác giữa các trung bình. Kết quả phân tích phương sai được tĩm tắt trên bảng sau:
Bảng 2.1. Bảng phân tích phương sai Nguồn biến động Độ tự do DF (Degree of freedom) Tổng bình phương SS Trung bình bình phương MS F tính F bảng ( = 0,05 hoặc 0,01) Between Groups (Treatment)
a -1 SSA MSA Tra bảng
Within Groups (Error) N - a SSE MSE / Tổng (Total) N - 1 SST0 /
Phương pháp bố trí thí nghiệm theo a mức yếu tố tác động khác nhau đến nhân
