Nuôi cấy mô thực vật tài liệu giảng dạy

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUYÊN THIÊN NHIÊN TÀI LIỆU GIẢNG DẠY NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT Giảng viên: Nguyễn Thị Mỹ Duyên An Giang, tháng năm 2016 CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG Giáo trình tài liệu giảng dạy “Ni cấy mơ thực vật” tác giả Nguyễn Thị Mỹ Duyên, công tác Khoa Nông nghiệp Tài nguyên thiên nhiên thực Tác giả báo cáo nội dung Hội đồng Khoa học Đào tạo Khoa thông qua ngày 21/01/2016 Tác giả biên soạn Ths Nguyễn Thị Mỹ Duyên Khoa Nông nghiệp & TNTN Trưởng Bộ môn BAN GIÁM HIỆU An Giang, tháng năm 2016 i LỜI CẢM TẠ Tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” soạn thảo dựa nhiều nguồn tài liệu tham khảo Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn Cô Ths Đặng Phương Trâm Thầy PGS.TS Nguyễn Bảo Toàn giảng dạy hỗ trợ nhiều nguồn tham khảo cho tài liệu Đồng thời, xin chân thành gởi lời biết ơn xâu sắc đến Thầy Debergh Pierre ThS Võ Tòng Anh cung cấp nhiều sách tài liệu điện tử nuôi cấy mô thực vật cho tài liệu phong phú Xin chân thành cảm ơn BGH Trường với BCN Khoa Nông nghiệp & TNTN Trường Đại học An Giang tạo điều kiện cho tơi hồn thành tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” Cám ơn Quý đồng nghiệp Bộ môn Công nghệ Sinh học có nhiều chia đóng góp cho tơi hoàn thiện tài liệu giảng dạy Đây nguồn tài liệu giảng dạy hữu ích cho sinh viên ngành Công nghệ sinh học học tập sinh viên ngành liên quan tham khảo Xin trân trọng kính chào An Giang, ngày 14 tháng năm 2016 Người thực Nguyễn Thị Mỹ Duyên ii LỜI CAM KẾT Tôi xin cam đoan tài liệu giảng dạy riêng Nội dung tài liệu giảng dạy có xuất xứ rõ ràng An Giang, ngày 14 tháng năm 2016 Người biên soạn Nguyễn Thị Mỹ Duyên iii LỜI GIỚI THIỆU Học phần “Nuôi cấy mô thực vật” học phần quan trọng Chương trình đào tạo ngành Cơng nghệ Sinh học Trường Đại học An Giang Bên cạnh đó, học phần đóng góp quan trọng cho việc đào tạo cữ nhân trẻ, cán vùng Đồng Sông cửu Long chuyên môn lĩnh vực nhân chọn tạo giống trồng công nghệ cao Góp phần ứng dụng cơng tác nhân giống trồng quí phục vụ cho nhu cầu sản xuất người dân khu vực Tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” trang bị cho sinh viên ngành Công nghệ Sinh học hiểu kiến thức thực trạng giải pháp ngành nuôi cấy mô, giúp cho em nắm vững nguyên lý - kỹ thuật cần thiết nuôi cấy mô ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô nhân giống, chọn tạo giống trồng Nội dung tài liệu giảng dạy “Nuôi cấy mô thực vật” bao gồm chương: Chương 1: GIỚI THIỆU CHUNG Chương 2: NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CÔNG NGHỆ NI CẤY MƠ THỰC VẬT Chương THIẾT KẾ PHỊNG THÍ NGHIỆM NI CẤY MƠ THỰC VẬT Chương NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ Chương CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TRONG TẠO GIỐNG Chương MỘT SỐ ỨNG DỤNG KHÁC CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ Chương MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ Tác giả hy vọng Tài liệu giảng dạy tài liệu học tập hữu ích cho sinh viên ngành Cơng nghệ Sinh học trình độ Đại học Cao đẳng Xin chân thành cám ơn Tác giả ThS Nguyễn Thị Mỹ Duyên iv MỤC LỤC CHẤP NHẬN CỦA HỘI ĐỒNG i LỜI CẢM TẠ ii LỜI CAM KẾT iii LỜI GIỚI THIỆU iv MỤC LỤC v DANH SÁCH BẢNG ix DANH SÁCH HÌNH x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv Chương 1: GIỚI THIỆU CHUNG 1.1 Một số khái niệm công nghệ nuôi cấy mô thực vật 1.2 Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật giới 1.3 Hiện trạng nuôi cấy mô Việt Nam Chương 2: NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 11 2.1 Cơ sở nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.1.1 Định nghĩa 11 2.1.2 Kiến thức sinh học cần thiết cho nuôi cấy mô tế bào thực vật 11 2.1.3 Các kiểu nuôi cấy 13 2.2 Chọn mẫu cấy 13 2.3 Sự vô trùng 16 2.3.1 Khử trùng bề mặt mẫu cấy 17 2.3.2 Khử trùng môi trường dụng cụ cấy 22 2.4 Môi trường nuôi cấy 24 2.4.1 Nước 25 2.4.2 Các nguyên tố khoáng đa, vi lượng 25 2.4.3 Nguồn carbonhydrate 27 2.4.4 Vitamin 28 2.4.5 Chất tạo gel 28 2.4.6 Chất điều hòa sinh trưởng 29 v 2.4.7 Chelate 33 2.4.8 Tính thẩm thấu mơi trường 33 2.4.9 Than hoạt tính 33 2.4.10 pH 34 2.4.11 Acid hữu 34 2.4.12 Thành phần bổ sung không xác định 34 2.5 Các kiểu bình chứa nắp đậy sử dụng nuôi cấy 36 2.6 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 36 2.6.1 Chuẩn bị hóa chất 36 2.6.2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy 37 2.6.3 Chuẩn bị dung dịch mẹ 37 2.7 Điều kiện nuôi cấy 38 2.7.1 Nhiệt độ 38 2.7.2 Ánh sáng 39 2.7.3 Ẩm độ 39 Chương THIẾT KẾ PHỊNG THÍ NGHIỆM NUÔI CẤY MÔ 41 3.1 Ngun tắc thiết kế phịng thí nghiệm ni cấy mô 41 3.2 Tổ chức phịng thí nghiệm ni cấy mơ thực vật 41 3.2.1 (a) Phòng sinh trưởng 41 3.2.1 (b) Phịng cấy vơ trùng 43 3.2.2 Phòng rửa dụng cụ sản xuất nước cất 44 3.2.3 (a) Phòng sấy, hấp kho đựng dụng cụ 44 3.2.3 (b) Phịng chuẩn bị mơi trường, chuẩn bị mẫu 44 3.2.4 Phịng sinh hóa để hóa chất 45 3.2.5 Văn phòng làm việc nơi tiếp khách 45 3.2.6 Vườn ươm 45 3.3 Trang thiết bị hóa chất phịng ni cấy 45 3.3.1 Dụng cụ thuỷ tinh 45 3.3.2 Trang thiết bị hóa chất phịng ni cấy 45 3.3.3 Hóa chất thành phần 46 Chương NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ 47 vi 4.1 Nhân giống hữu tính – Gieo hạt ống nghiệm 47 4.1.1 Chuẩn bị môi trường gieo hạt 47 4.1.2 Khử trùng trái lan 48 4.1.3 Gieo hạt lan 49 4.2 Nhân giống vơ tính – Vi nhân giống 50 4.2.1 Kỹ thuật vi nhân giống 50 4.2.2 Các giai đoạn vi nhân giống 51 4.3 Sự dưỡng cấy mô 57 4.3.1 Cấu trúc hình thái giải phẩu cấy mô 57 4.3.2 Quang hợp 59 4.3.3 Kỹ thuật dưỡng 60 4.4 Một số kỹ thuật giúp gia tăng sinh trưởng 63 4.4.1 Kỹ thuật hai lớp 63 4.4.2 Kỹ thuật gia tăng sinh khối cách sử dụng bình phản ứng sinh học 63 4.5 Nhân giống từ phôi vô tính 66 4.5.1 Phơi vơ tính 66 4.5.2 Sự thành lập phơi vơ tính 67 4.5.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình hình thành phơi vơ tính 69 4.5.4 Ứng dụng phơi vơ tính việc tạo hạt giống tổng hợp 72 Chương CÁC ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO TRONG CHỌN TẠO GIỐNG 75 5.1 Nuôi cấy giao tử 75 5.1.1 Giới thiệu gen thể bội 75 5.1.2 Mục đích ứng dụng việc nuôi cấy tế bào đơn bội 75 5.1.3 Kỹ thuật cấy tế bào đơn bội 77 5.1.4 Lợi bất lợi nuôi cấy hạt phấn 86 5.2 Nuôi cấy phôi nhũ 87 5.3 Cấy phôi cứu phôi 89 5.4 Thụ tinh ống nghiệm 91 5.5 Chọn lọc in vitro tế bào thực vật có đặc tính kháng 94 5.6 Nuôi cấy tế bào trần 97 vii 5.7 Biến đổi gen 107 5.7.1 Các điều kiện cần cho chuyển gen thực vật 108 5.7.2 Các phương pháp chuyển gen thực vật 108 5.7.3 Phân tích thực vật biến đổi gen 115 5.7.4 Hiệu kiểu gen thay đổi quần thể xảy tự nhiên thực vật 119 Chương MỘT SỐ ỨNG DỤNG KHÁC CỦA KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ, TẾ BÀO THỰC VẬT 121 6.1 Ra hoa ống nghiệm 121 6.2 Tạo bệnh phục hồi nhiễm virus 122 6.2.1 Cấy đỉnh sinh trưởng (mô phân sinh chồi) 122 6.2.2 Xử lý nhiệt 125 6.2.3 Kỹ thuật vi ghép 127 6.2.4 Tạo chồi bất định, sau nuôi cấy đỉnh sinh trưởng 129 6.3 Cấy tế bào, callus 130 6.4 Sản xuất chất biến dưỡng thứ cấp phương pháp nuôi cấy tế bào 133 6.4.1 Chất biến dưỡng thứ cấp 133 6.4.2 Sản phẩm chất biến dưỡng thứ cấp 134 Chương MỘT SỐ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NUÔI CẤY MÔ 137 7.1 Sự nhiễm mẫu 137 7.2 Ảnh hưởng sinh lý sinh thái đến mẫu cấy 142 7.3 Biến dị tế bào sô ma 146 7.4 Cấu trúc bất thường 147 7.5 Các dạng thể khảm 147 TÀI LIỆU THAM KHẢO 151 THỰC TẬP MÔN HỌC 155 viii DANH SÁCH BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Khả sử dụng nuôi cấy mô tế bào thực vật vào công tác chọn tạo giống trồng Bảng 1.2 Một số thuật ngữ nuôi cấy mô thực vật Bảng 2.1 Các hoá chất, nồng độ thời gian khử trùng 20 Bảng 2.2 Các chất khử trùng tác dụng lên mô cấy 20 Bảng 2.3 Các chất khử trùng hiệu 21 Bảng 2.4 Thành phần môi trường nuôi cấy 24 Bảng 2.5 Thành phần nguyên tố khống mơi trường ni cấy 25 Bảng 2.6 Tác dụng chất điều hịa sinh trưởng cấy mô 32 Bảng 2.7 Một số môi trường nuôi cấy mô 35 Bảng 2.8 Pha dung dịch gốc môi trường MS 38 Bảng 4.1 Thành phần môi trường Knudson 48 Bảng 5.1 Một số môi trường (MT) sử dụng nuôi cấy tế bào trần 102 Bảng 5.2 Một số chuyển gen thương phẩm 117 Bảng 6.1 Sản lượng Paclitaxel tạo 134 ix PHẦN THỰC HÀNH (30 tiết) BÀI 1: CHUẨN BỊ DUNG DỊCH MẸ VÀ PHA MÔI TRƯỜNG MS (1962) 1.1 Mục đích Các dung dịch mẹ (stock) giúp chuẩn bị mơi trường ni cấy nhanh xác Bài gồm công việc chuẩn bị chung để làm quen với dụng cụ, thao tác, hóa chất pha môi trường nuôi cấy mô, kết thu dùng để thực tập 1.2 Dụng cụ, hóa chất   Dụng cụ - Cốc thủy tinh cal nhựa 1000ml - Cốc thuỷ tinh 50ml, 100 ml, 200 ml, 500ml - Ống đong 100ml, 200ml, 500ml - Keo thủy tinh - Đũa thủy tinh, pipet 10ml 1ml - Cân đa lượng, cân vi lượng, nồi nấu, máy đo pH, tủ sấy Hóa chất + NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O CaCl2 KH2PO4 FeSO4.7H2O Na2 EDTA + H3BO3 MnSO4 ZnSO4.7H2O Na2MoO4.2H2O CuSO4.2H2O KI CoCl2 + Pyridoxine Thiamine HCl Nicotinic Glycine + Myo-Inositol + BA, TDZ NAA Kinetin 2,4D + Đường, agar, than hoạt tính, cồn 96%,… + Các phụ liệu sử dụng thao tác nuôi cấy mô: giấy cấy, chai nước cất, chai không, dao kéo,… 155 1.3 Thực hành  Pha dung dịch mẹ: dung dịch mẹ gồm loại đa lượng, sắt, vi lượng, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng loại + Đa lượng (Macro MS): cân hóa chất riêng theo nhóm để pha stock cho 10 lít mơi trường MS MS1: NH4NO3 16,5g KNO3 19g MgSO4.7H2O 3,7g MS2: CaCl2 3,3g MS3: KH2PO4 1,7g Các nhóm hóa chất sau cân hịa tan 100ml lên thể tích đến 1000ml, viết nhãn loại + Sắt: Pha cho 100 lít mơi trường FeSO4.7H2O 2,78g EDTA 3,73g Hịa tan máy khuấy từ nhiệt độ 100oC + Vi lượng (Micro MS): Pha chung thành phần dùng cho 1.000 lít H3BO3 6,2g MnSO4 22,3g ZnSO4.7H2O 11,5g Na2MoO4.2H2O 0,25g CuSO4.2H2O 0,025g KI 0,83g CoCl2 0,025g Hòa tan 100ml nước cất, sau lên thể tích đến 1.000ml + Vitamine: Pha riêng loại, 100 lít mơi trường Pyridoxine 50mg Nicotinic 50mg Thiamine HCl 40mg Glycine 20mg Hòa tan chất vài ml nước cất, sau lên thể tích đến 100ml 156 + Chất điều sinh trưởng  - BA (BAP): hòa tan 100 mg BA vài giọt NaOH 1N (tối đa ml), sau lên thể tích đến 100ml nước cất lần để có hàm lượng 1mg/1ml - Kinetin: cách pha tương tự BAP - TDZ (Thidiazuron): cách pha tương tự BAP - NAA: hòa tan 50 mg NAA vài giọt (tối đa 0,5 ml) cồn 96% vài giọt dung dịch NaOH 1N (pH 5.8) (tối đa ml), sau lên thể tích tương ứng nước cất lần để có hàm lượng 1mg/1ml - IAA, IBA: tương tự NAA Đối với IAA tốt nên pha sử dụng, IAA trữ chai màu hổ phách 4oC không lâu tuần - 2,4D: hòa tan 50 mg 2,4D 25 ml cồn 50% thêm nước cất lần vào thể tích cần thiết (tương ứng 50 ml) để có hàm lượng 1mg/1ml Pha mơi trường sử dụng để ni cấy Chia làm 12 nhóm, nhóm pha lít mơi trường MS theo Murashige & Skoog (1962) theo công thức bảng 1.1 (Chú ý sử dụng keo nhỏ) - Nhóm 1, (MT 1): MS (2 lít) - Nhóm 2, (MT 2): MS + mg/l BA (1 lít) - Nhóm 3, (MT 3): MS + mg/l NAA (1 lít) - Nhóm 4, (MT 4): MS + mg/l BA + 0,5 mg/l NAA (1 lít) - Nhóm 5, 10 (MT 5): MS + mg/l BA + 0,5 mg/l 2,4 D (1 lít) - Nhóm 11 (MT 6): MS + 0,5 mg/l 2,4 D (1 lít) Trình tự: 1) Lấy dung dịch mẹ cân chất chưa pha sẵn theo trình tự đa lượng, vi lượng, sắt EDTA, vitamin, chất hữu cơ, chất ĐHST Lên thể tích đến 800 mg 2) Cân thạch, đường để chung vào mơi trường 3) Nấu để thạch tan hồn tồn, lên đủ thể tích 1000 ml Chỉnh pH đến 5,7 (hoặc 5,8) (Điều chỉnh pH HCl 0,1N KOH 1M) 4) Chia vào chai ống nghiệm, đậy nắp hấp tiệt trùng 121oC khoảng 30 phút (tùy theo lượng môi trường) 5) Khi đủ thời gian, xả bớt để hạ áp suất nồi, lấy mơi trường lúc cịn ấm 157 Bảng 1.1 Chuẩn bị môi trường MS từ dung dịch mẹ STT Hóa chất Thành phần mơi trường (mg/l) Lấy từ dd mẹ (ml) NH4NO3 1.650 100 KNO3 1.900 Nhóm Đa lượng MS1 MgSO4.7H2O 370 Đa lượng MS2 CaCl2 330 100 Đa lượng MS3 KH2PO4 170 100 Fe EDTA FeSO4.7H2O 27,8 10 Na2EDTA 37,3 Vi lượng H3BO3 6,2 MnSO4 22,3 ZnSO4.7H2O 11,5 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.2H2O KI CoCl2 Vitamine 0,025 0,83 0,025 Pyridoxine 0,5 Nicotinic 0,5 Thiamine HCl 0,4 Glycine 0,2 Myo-Inositol 100 Chất hữu Chất điều hòa sinh NAA, IAA trưởng BA, Kinetin, TDZ Thành phần khác Thạch g/l Đường 20 g/l Than hoạt tính g/l 158  Chuẩn bị dụng cụ cấy: - Các dụng cụ dao, kéo, kẹp, lưỡi dao cấy: trước dùng lần cần rửa sạch, phơi khơ gói giấy nhôm giấy thường sấy tiệt trùng tủ sấy 100oC, khoảng 45 – 60 phút - Chuẩn bị nước vô trùng: cho nước cất vào khoảng 2/3 chai, đậy kín hấp với mơi trường - Chuẩn bị giấy cấy: dùng giấy sạch, có độ dày độ mịn để lót cắt mẫu Tốt giấy A4, hay giấy lọc, gói kín ghi ngày vào trước sấy tủ sấy 100oC khoảng 40-60 phút Chú ý kiểm tra không để lâu giấy bị cháy  Lưu ý: - Dung dịch mẹ sau sử dụng cất nhiệt độ - 10oC (ngăn mát tủ lạnh); vitamin điều hòa sinh trưởng cần trữ cánh cửa ngăn đá - Môi trường cất nơi mát, tránh bụi bặm Thường cất giữ phòng sinh trưởng - Dụng cụ chuẩn bị cấy tiệt trùng cần để nguội, giữ ngun giấy gói cất nơi khơ, mát, khơng tiếp xúc nguồn lây nhiễm 159 BÀI 2: GIEO CẤY HẠT LAN - LÚA 2.1 Mục đích: Thiết lập mơ cấy ống nghiệm 2.2 Vật liệu, hóa chất - Vật liệu: Mẫu cấy trái lan, hạt lúa - Hóa chất: Clorox (NaOCl) thủy ngân (HgCl2), cồn 70%, cồn 90% - Dụng cụ: Dao thái lan gọt trái cây, dao mổ số 11, kẹp cấy, giấy tiệt trùng 2.3 Thực hành - Khử trùng trước tủ cấy cách lau cồn 70o Bật đèn UV khử trùng phòng cấy 15 - 30 phút trước sử dụng - Pha hóa chất khử trùng: Clorox (NaOCl) Cloramin B, thủy ngân (HgCl2), cồn 70% - Trước cấy, người cấy cần rửa tay xà phịng thật kỹ đến khủy tay Sau chờ khơ tiếp tục khử trùng tay cồn 70o, chờ khô vào cấy - Cho dụng cụ cấy vào ổ ghim tiệt trùng, bật công tắc điện để đốt nóng tiệt trùng dụng cụ cấy (chú ý: lấy dụng cụ chờ giảm nhiệt trước cấy)  Trái lan: Chuẩn bị: rửa trái vòi nước chảy 10 phút  ngâm với nước rửa chén - 10 phút  xả vòi nước chảy khoảng 15 – 20 phút  sau đem vào thao tác tủ cấy vô trùng - Ngâm cồn 70% khoảng 30 giây - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng cách gắp chồi cho vào keo nước khử trùng - Ngâm tiếp Calcium hypochloride (Clorine) [Ca(OCL)3] 10% 15 phút; Javel (1:5) 20 phút - Rửa lại lần với nước cất vô trùng - Gắp trái lan để vào đĩa petri có sẳn giấy thấm - Dùng dao xẻ trái để bày hạt ra, gắp hạt rải mặt môi trường (MT1, MT2, MT4 MT6) Mỗi sinh viên cấy keo (tương ứng loại mơi trường Chú ý: Ghi tên người cấy, nhóm, ngày cấy, giống vào keo sau cấy  Lúa Chuẩn bị: hạt lúa bóc vỏ  cho vào bình khử trùng  rửa vịi nước chảy 10 phút  ngâm với nước rửa chén - 10 phút  xả vòi nước chảy khoảng 15 – 20 phút  sau đem vào thao tác tủ cấy vô trùng - Ngâm cồn 70% khoảng 30 giây đến phút 160 - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng cách gắp chồi cho vào keo nước khử trùng - Ngâm tiếp HgCl2 0,1% 15 phút - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng - Gắp hạt cấy vào môi trường (MT1, MT2, MT4, MT5 MT6) - Trữ mẫu điều kiện tối sáng - Mỗi sinh viên cấy keo tương ứng với loại mơi trường; - hạt/keo Hình Ni cấy tạo mơ sẹo lúa Chồi mơ sẹo hình thành khoảng - tuần nuôi cấy Mô sẹo (màu trắng sữa) cấy chuyền – lần, lần cách tuần trước tái sinh môi trường MS + 0,5 mg/l NAA + mg/l Kinetin Chú ý: Ghi tên người cấy, nhóm, ngày cấy, giống vào keo sau cấy  Ghi nhận kết (bài phúc trình) - Số bình nhiễm sau ngày, 14 ngày (ghi nhận khả nhiễm nấm nhiễm khuẩn? nhiễm mẫu hay thao tác cấy?) - Sau tuần, tuần, tuần quan sát tượng nảy mầm hạt lan, nẩy mầm tạo mô sẹo hạt lúa - Tự nhận xét rút kinh nghiệm thao tác cấy  Mỗi nhóm chuẩn bị mơi trường dùng cấy cho (bài 3): - Nhóm 1, (MT 7): MS + mg/l TDZ (1 lít) - Nhóm 2, (MT 8): MS + mg/l TDZ + 0,2 mg/l NAA (1 lít) - Nhóm 3, (MT 9): MS + mg/l BA (1 lít) - Nhóm 4, (MT 10): MS + mg/l BA + 0,2 mg/l NAA (1 lít) - Nhóm 5, 10 (MT 3): MS + mg/l NAA (2 lít) - Nhóm 11 (MT 11): MS + mg/l Kinetin (1 lít) 161 BÀI 3a: KỸ THUẬT KHỬ TRÙNG MẪU CẤY VÀ TẠO MẪU IN VITRO 3.1 Mục đích Khử trùng đưa mẫu vào ống nghiệm có ý nghĩa quan trọng thao tác khó thực hiện, thường hay xảy tình trạng khử trùng mẫu mẫu chết bị ảnh hưởng độc từ hóa chất khử trùng, mẫu khơng bị ảnh hưởng hóa chất bị nấm hay khuẩn làm nhiễm mẫu Bài thực tập nhằm giúp làm quen với bước thiết lập mô cấy môi trường 3.2 Vật liệu, hóa chất  Vật liệu Mẫu: hoa cúc, kim ngân hoa, khoai môn (khoai sọ)  Hóa chất: Calcium hypochloride [Ca(OCl)2] (Chlorine), Thủy ngân (HgCl2), nước cất tiệt trùng, cồn 70%, cồn 90%  Dụng cụ, vật liệu khác: - Dao, kéo, kẹp cấy, giấy thấm tiệt trùng, chai thủy tinh tiệt trùng - Môi trường ni cấy: mơi trường cịn lại (sử dụng keo nhỏ) 3.3 Chuẩn bị cấy - Khử trùng trước tủ cấy cách lau cồn 70o Bật đèn UV khử trùng phòng cấy 15 - 30 phút trước sử dụng - Pha hóa chất khử trùng - Trước cấy, người cấy cần rửa tay xà phịng thật kỹ đến khủy tay Sau chờ khơ tiếp tục khử trùng tay cồn 70o, chờ khô vào cấy - Cho dụng cụ cấy vào ổ ghim tiệt trùng, bật công tắc điện để đốt nóng tiệt trùng dụng cụ cấy (chú ý: lấy dụng cụ chờ giảm nhiệt trước cấy) 3.4 Thực hành * Hoa cúc/Kim ngân hoa: Chuẩn bị: Cắt chồi non hoa cúc/kim ngân hoa, cắt bỏ lá già chừa non  cho mẫu vào keo  cho chảy vòi nước chảy khoảng 20 – 25 phút  ngâm mẫu nước xà phòng khoảng 10 - 15 phút  rửa xà phòng vòi nước chảy khoảng 15 – 20 phút  sau đem vào thao tác tủ cấy vơ trùng - Ngâm cồn 70% khoảng 30 giây – phút - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng cách gắp chồi cho vào keo nước khử trùng - Ngâm lắc dung dịch khử trùng: (1) (HgCl2) 0,1% 10 phút; (2) (HgCl2) 0,1% 15 phút; (3) Calcium hypochloride [Ca(OCl)2] 10% 15 phút; (4) Calcium hypochloride [Ca(OCl)2] 10% 25 phút vài giọt nước rữa chén Mẫu cần ngập dung dịch khử trùng hoàn toàn - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng 162 - Gắp mẫu để vào đĩa petri có sẳn giấy thấm, dùng dao kéo cắt bớt mơ bị hư hại q trình khử trùng - Cấy mẫu sau khử trùng vào môi trường chuẩn bị sẳn Mỗi keo mẫu Chú ý: sinh viên cấy keo tương ứng với loại mơi trường Ghi rõ tên người cấy, nhóm, ngày cấy, giống vào tất keo sau cấy * Khoai cao (sọ)/Gừng: Chuẩn bị: (1) Chọn củ khỏe nhú mầm  chà rửa lớp vỏ bên ngồi, cắt lấy mầm củ (có phần thịt củ) Cho mẫu vào keo  cho chảy vòi nước chảy khoảng 20 – 25 phút  Ngâm mẫu nước xà phòng khoảng 10 – 15 phút  Rửa xà phòng vòi nước chảy khoảng 15 – 20 phút  Tráng lại nước cất  Sau đem vào thao tác tủ cấy vơ trùng - Ngâm cồn 70% khoảng 30 giây – phút - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng cách gắp chồi cho vào keo nước khử trùng - Ngâm lắc dung dịch khử trùng: (1) (HgCl2) 0,1% 10 phút; (2) (HgCl2) 0,1% 15 phút; (3) Calcium hypochloride [Ca(OCl)2] 10% 15 phút; (4) Calcium hypochloride [Ca(OCl)2] 10% 25 phút vài giọt nước rữa chén Mẫu cần ngập dung dịch khử trùng hoàn toàn - Rửa lại – lần với nước cất vơ trùng - Gắp mẫu vào đĩa petri có sẳn giấy thấm cho ráo, dùng dao kéo cắt bớt mơ bị hư hại q trình khử trùng - Cấy mẫu sau khử trùng vào môi trường chuẩn bị sẳn mẫu/keo Chú ý: sinh viên cấy keo tương ứng với loại mơi trường Ghi rõ tên người cấy, nhóm, ngày cấy, giống vào tất keo sau cấy 3.5 Ghi nhận kết - Tỷ lệ nhiễm nấm/ khuẩn - Phát triển mẫu cấy: mẫu chết, mẫu không phát triển, mẫu xuất chồi, quan sát khác có - So sánh kết loại hoá chất khử trùng ảnh hưởng đến khử trùng mẫu cấy; ảnh hưởng môi trường nuôi cấy phát triển mẫu cấy - Quan sát mẫu định kỳ tuần tháng 163 BÀI 3b: KỸ THUẬT KHỬ TRÙNG MẪU CẤY VÀ TẠO MẪU IN VITRO 3.1 Mục đích Khử trùng đưa mẫu vào ống nghiệm có ý nghĩa quan trọng thao tác khó thực hiện, thường hay xảy tình trạng khử trùng mẫu mẫu chết bị ảnh hưởng độc từ hóa chất khử trùng, mẫu khơng bị ảnh hưởng hóa chất bị nấm hay khuẩn làm nhiễm mẫu Bài thực tập nhằm giúp làm quen với bước thiết lập mô cấy môi trường 3.2 Vật liệu, hóa chất  Vật liệu Mẫu: hoa đồng tiền, hoa lan  Hóa chất: Calcium hypochloride (Ca(OCl)2 (Chlorine), Thủy ngân (HgCl2), nước cất tiệt trùng, cồn 70%, cồn 90%  Dụng cụ, vật liệu khác: - Dao, kéo, kẹp cấy, giấy thấm tiệt trùng, chai thủy tinh tiệt trùng, - Môi trường nuôi cấy: môi trường lại (sử dụng keo nhỏ) 3.3 Chuẩn bị cấy - Khử trùng trước tủ cấy cách lau cồn 70o Bật đèn UV khử trùng phòng cấy 15 - 30 phút trước sử dụng - Pha hóa chất khử trùng: thủy ngân (HgCl2), Calcium hypochloride, Javel (tỉ lệ 1:5), cồn 70% - Trước cấy, người cấy cần rửa tay xà phòng thật kỹ đến khủy tay Sau chờ khơ tiếp tục khử trùng tay cồn 70o, chờ khô vào cấy - Cho dụng cụ cấy vào ổ ghim tiệt trùng, bật cơng tắc điện để đốt nóng tiệt trùng dụng cụ cấy (chú ý: lấy dụng cụ chờ giảm nhiệt trước cấy) 3.4 Thực hành * Hoa lan: Vật liệu: đoạn chồi Dendrobium cao 10 cm Chuẩn bị: rửa chồi lan vòi nước chảy Dùng dao mổ lột hết non bao xung quanh chồi để lộ chồi bên chồi  cho chảy vòi nước khoảng 20 – 25 phút  ngâm mẫu nước xà phịng pha lỗng khoảng 10 - 15 phút dùng gòn lau nhẹ lên thân chồi  rửa xà phòng vòi nước chảy khoảng 15 – 20 phút  sau đem vào thao tác tủ cấy vô trùng - Ngâm cồn 70% khoảng 30 giây – phút Rửa lại – lần với nước cất vô trùng cách gắp chồi cho vào keo nước khử trùng - Ngâm lắc dung dịch khử trùng: (1) (HgCl2) 0,1% 10 phút; (2) (HgCl2) 0,1% 15 phút vài giọt nước rữa chén; (3) dung dịch Javel thương 164 phẩm theo tỉ lệ 1:5 25 - 30 phút Mẫu cần ngập dung dịch khử trùng hoàn toàn - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng - Gắp chồi để vào đĩa petri có sẳn giấy thấm, dùng dao kéo cắt bớt mơ bị hư hại q trình khử trùng Tách riêng chồi bên chồi Cấy chồi vào môi trường chuẩn bị sẳn Mỗi keo mẫu Chú ý: sinh viên cấy keo tương ứng với loại môi trường Ghi rõ tên người cấy, nhóm, ngày cấy, giống vào tất keo sau cấy * Hoa Đồng tiền: Chuẩn bị: Chọn non khỏe mạnh, bệnh Cho mẫu vào keo  cho chảy vòi nước chảy khoảng 20 – 25 phút  Ngâm mẫu nước xà phòng khoảng 10 – 15 phút  Rửa xà phòng vòi nước chảy khoảng 15 – 20 phút  Tráng lại nước cất  Sau đem vào thao tác tủ cấy vơ trùng - Ngâm cồn 70% khoảng 30 giây – phút - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng cách gắp chồi cho vào keo nước khử trùng - Ngâm lắc dung dịch khử trùng: (1) (HgCl2) 0,1% phút; (2) (HgCl2) 0,1% 10 phút; (3) Calcium hypochloride [Ca(OCl)2] 10% 20 phút; (4) dung dịch Javel thương phẩm theo tỉ lệ 1:5 25 phút vài giọt nước rữa chén Mẫu cần ngập dung dịch khử trùng hoàn toàn - Rửa lại – lần với nước cất vô trùng - Gắp mẫu vào đĩa petri có sẳn giấy thấm cho ráo, dùng dao kéo cắt bớt mô bị hư hại trình khử trùng - Cấy mẫu sau khử trùng vào môi trường chuẩn bị sẳn  cuống lá/keo, phiến lá/keo Chú ý: sinh viên cấy keo tương ứng với loại mơi trường Ghi rõ tên người cấy, nhóm, ngày cấy, giống vào tất keo sau cấy 3.5 Ghi nhận kết - Tỷ lệ nhiễm nấm/ khuẩn - Phát triển mẫu cấy: mẫu chết, mẫu không phát triển, mẫu xuất chồi, quan sát khác có - So sánh kết loại hoá chất khử trùng ảnh hưởng đến khử trùng mẫu cấy; ảnh hưởng môi trường nuôi cấy phát triển mẫu cấy - Quan sát mẫu định kỳ tuần tháng 165 BÀI 4: NUÔI CẤY NHÂN PROTOCORM, CHỒI LAN 4.1 Mục đích: Trong cấy lan, protocorm có khả thành lập từ mẫu cấy hạt, lá, chồi Protocorm nhân lên tạo chồi nhằm mục đích nhân nhanh tạo số lượng lớn mẫu cấy (chồi) Giai đoạn thường có hỗ trợ cytokinin Ngoài ra, sau giai đoạn nhân nhanh chồi lan kéo dài việc sử dụng lượng thấp cytokinin để chuẩn bị cho việc tạo rễ cho chồi lan 4.2 Vật liệu, mẫu  Vật liệu: Dao, kéo, kẹp, giấy cấy, cồn 70%, cồn 96%,…  Mẫu cấy: mẫu cụm protocorm, chồi lan 4.3 Thực hành * Lan Hồ điệp: Gắp cụm protocorm like body (PLBs) khỏi keo  tách rời cụm PLBs kích thước khoảng 0,5 cm cấy vào môi trường chuẩn bị sẳn; Cấy mẫu/keo Mỗi sinh viên cấy keo tương ứng với loại môi trường MT13, MT14 MT16 * Lan Cattleya/Dendrobium: Gắp cụm chồi khỏi keo  tách thành chồi riêng (cắt bỏ rễ có) Cấy mẫu vào mơi trường chuẩn bị sẳn Cấy mẫu/keo Mỗi sinh viên cấy keo tương ứng với loại môi trường MT12, MT15, MT17 Chú ý: Ghi rõ tên người cấy, nhóm, ngày cấy, giống vào tất keo sau cấy 4.4 Ghi nhận kết quả: Quan sát tuần, tuần, tuần sau cấy - Sự tạo chồi: có/ khơng, số lượng - Sự nhân protocorm: có/ khơng, tỉ lệ phần trăm (%) mẫu tạo mô sẹo - So sánh kết loại môi trường Quan sát cảm quan: màu sắc, cấu trúc đặc điểm khác có 166 BÀI 5: VI NHÂN GIỐNG QUA CÁC GIAI ĐOẠN NHÂN NHANH CHỒI VÀ TẠO RỄ 5.1 Mục đích Trong q trình vi nhân giống thường có giai đoạn, giai đoạn có chức riêng Trong giai đoạn giai đoạn nhân nhanh, tạo số lượng lớn con; giai đoạn người ta thường hay sử dụng Cytokinin cho vào mơi trường ni cấy để kích thích phát triển nhiều chồi Và giai đoạn giai đoạn tạo rễ, giúp tạo hoàn chỉnh chuẩn bị thích nghi với mơi trường bên ngồi; giai đoạn người ta thường sử dụng Auxin cho vào môi trường, sau ý đến điều kiện ngồi cảnh (ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ, ), tạo điều kiện cho cấy mơ thích nghi dần với tự nhiên 5.2 Vật liệu, mẫu  Vật liệu: Dao, kéo, kẹp, giấy cấy, cồn 70%, cồn 96%…  Mẫu cấy: Bình hoa Sinningia speciosa (Gloxinia) in vitro 5.3 Chuẩn bị cấy - Khử trùng trước tủ cấy cách lau cồn 70o Bật đèn UV khử trùng phòng cấy 15 - 30 phút trước sử dụng - Pha hóa chất khử trùng: thủy ngân (HgCl2), Calcium hypochloride, Javel (tỉ lệ 1:5), cồn 70% - Trước cấy, người cấy cần rửa tay xà phòng thật kỹ đến khủy tay Sau chờ khơ tiếp tục khử trùng tay cồn 70o, chờ khô vào cấy - Cho dụng cụ cấy vào ổ ghim tiệt trùng, bật cơng tắc điện để đốt nóng tiệt trùng dụng cụ cấy (chú ý: lấy dụng cụ chờ giảm nhiệt trước cấy) 5.4 Thực hành * Nhân chồi: - Gắp cụm chồi khỏi keo, cắt đốt thân có mang mầm ngủ cấy vào môi trường nhân chồi (MT1, MT7, MT8, MT9, MT10, MT11); cấy vào môi trường tạo cụm chồi tạo mô sẹo (MT1, MT5, MT6, MT9, MT10) - Mỗi sinh viên cấy keo nhân chồi, keo Mỗi keo cấy – mẫu cấy * Tạo rễ: - Gắp cụm chồi khỏi keo  tách thành chồi riêng lẻ cắt cấy vào môi trường tạo rễ (MT1, MT3) - Mỗi sinh viên cấy - keo Mỗi keo cấy – chồi Chú ý: Ghi rõ tên người cấy, nhóm, ngày cấy, giống vào tất keo sau cấy 167 5.4 Ghi nhận kết quả: Quan sát tuần, tuần, tuần sau cấy - Sự tạo chồi: có/ khơng, số lượng - Sự tạo rễ: có/ khơng, số lượng - Sự tạo mơ sẹo: có/ khơng, tỉ lệ phần trăm (%) mẫu tạo mô sẹo - So sánh kết loại môi trường Quan sát cảm quan: màu sắc, cấu trúc đặc điểm khác có  Mỗi nhóm chuẩn bị mơi trường dùng cấy cho (bài 4): - Nhóm 1, (MT 12): MS + mg/l TDZ + mg/l than hoạt tính - Nhóm 2, (MT 13): MS + mg/l TDZ + mg/l than hoạt tính - Nhóm 3, (MT 14): MS + mg/l TDZ + 0,5mg/l NAA + mg/l than hoạt tính - Nhóm 4, (MT 15): MS + mg/l BA + mg/l than hoạt tính - Nhóm 5, 10 (MT 16): MS + mg/l BA + mg/l than hoạt tính - Nhóm 11 (MT 17): MS + + mg/l Kinetin + mg/l than hoạt tính 168 BÀI 6: KỸ THUẬT THUẦN DƯỠNG VÀ ĐƯA CÂY MƠ RA VƯỜN ƯƠM 6.1 Mục đích Thuần dưỡng khâu quan trọng định thành công giai đoạn đưa vườn yếu tố định thành công hay không kỹ thuật cấy mơ Bởi sản phẩm cấy mơ có sử dụng hay không tùy thuộc vào thành công giai đoạn 6.2 Vật liệu, mẫu  Mẫu: chai mô nghệ, hoa Sinningia speciosa (Gloxinia) in vitro đủ thân rễ để đưa vườn  Vật liệu: - Giá thể trồng (rễ rừng) trùng sẳn, tro trấu - Thau, rỗ nhựa, bình xịt, kẹp dài 6.3 Thực hành Gắp lấy khỏi chai, tách rời rữa môi trường bám xung quanh rễ  đặt nghệ/ hoa Gloxinia nhẹ nhàng vĩ (rỗ) cho nước  trồng vào khay/ rỗ chuẩn bị sẳn giá thể  giữ ẩm mát cho thời gian khoảng tuần Sau ngày chuyển khay trồng nơi có cường độ ánh sáng cao 6.4 Ghi nhận kết  Quan sát thay đổi màu sắc, hình dạng (thân, lá, rễ, chiều cao) sau ngày, 14 ngày, 30 ngày  Tỉ lệ sống hoa Gloxinia/nghệ Thang điểm: - Mẫu cấy không nhiễm: điểm - Mẫu cấy phát triển: - Cây trồng không chết: điểm - Đi thực tập đầy đủ, giờ: điểm - Thực tập nghiêm túc, tích cực: điểm - Bài báo cáo: điểm 169 ... Chuyển gen mong muốn vào thực vật (cây mới) Nuôi cấy mô thực vật Là nuôi cấy vô trùng quan, mô tế bào thực (Plant Tissue Culture) vật môi trường nuôi cấy xác định rõ, việc nuôi cấy trì điều kiện kiểm... thực vật Việt Nam kỉ 21 gì? 10 Chƣơng NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG ĐẾN CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT 2.1 CƠ SỞ CỦA NUÔI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT 2.1.1 Định nghĩa Ni cấy mô tế bào thực vật nuôi cấy vô... thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật Các nghiên cứu Thực vật học Sinh lý thực vật chứng minh sở khoa học nuôi cấy mơ, tế bào thực vật tính tồn tế bào Haberlandt (1902) (Hình 1.1), nhà thực vật học