Bài giảng nuôi cấy mô thực vật doc

Khái niệm CNSH tế bào thực vậtLà ngành sử dụng các tác nhân sinh học can thiệp lên cơ thể thực vật nhằm tạo ra các giống cây trồng mới, dược chất, xử lý môi trường, tạo nguồn thực phẩm m

Chương 1 Công nghệ sinh học tế bào thực vật-cơ sở hình thành và lịch sử phát triển.

Chương 2 Nhân giống vô tính in vitro – Những khái niệm cơ bản và quy trình thực hiện

Chương 3 Công nghệ nuôi cấy dịch huyền phù và thu nhận hợp chất thứ cấp

Chương 4 Công nghệ tạo cây đơn bội in vitro và ứng dụng trong công tác giống cây trồng

Chương 5 Công nghệ hạt nhân tạo và ra hoa in vitro

Chương 6 Một số phương pháp canh tác hiện đại

D MÀNG NHÂN (Nuclear envelope)

E LƯỚI NỘI CHẤT NHÁM (dính với ribosome - Rough endoplasmid reticum)

F LƯỚI NỘI CHẤT TRƠN (không dính với ribosome - Smooth endoplasmid

reticum)

G KHÔNG BÀO (Vacoule)

H MÀNG KHÔNG BÀO (Tonoplast)

I DIỆP LỤC (Chroroplast)

J THÀNH TẾ BÀO (Cell wall)

K MÀNG TẾ BÀO (Plasma membrance)

L TY THỂ (Mitochondrion)

M PEROXISOME

N BỘ MÁY GOLGI (Golgi

apparatus)

1.1.1 Khái niệm CNSH tế bào thực vật

Là ngành sử dụng các tác nhân sinh học can thiệp lên cơ thể thực vật nhằm tạo ra các giống cây trồng mới, dược chất, xử lý môi trường, tạo nguồn thực phẩm mới, an toàn…

 có nhiều triển vọng trong tương lai, mang lại nhiều lợi ích, nhất là đối với một nước có nền kinh

tế chủ yếu là nông nghiệp như Việt Nam

1.1.2 Cơ sở hình thành

a Tính toàn năng của tế bào

b Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào

1.1.2 Cơ sở hình thành

a Tính toàn năng của tế bào

Mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của

cả cơ thể sinh vật đó Khi gặp điều kiện thuận lợi, có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh.

thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh

b Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào

b Sự phản phân hóa và phân hóa của tế bào

Sự sinh trưởng của thực vật

Tế bào phôi sinh

Tế bào dãn

Tế bào phân hóa có chức năng

riêng biệt

 Sự phân hóa

 Sự phản phân hóa

Trong điều kiện cần thiết và thích hợp, các tế bào, cơ quan lại có thể trở về dạng phôi sinh và phân chia mạnh mẽ

mạnh mẽ   phản phân hóa tế bào

Ví dụ : Khi nuôi cấy mô lá hoa Cúc, các tế bào đã phân hóa của lá gặp điều kiện thuận lợi sẽ phản phân hóa và phân chia liên tục tạo thành các mô sẹo (callus)

sẹo (callus)   chồi, rễ, cây hoàn chỉnh…

Tế bào phôi sinh Tế bào dãn Tế bào phân hóa có

chức năng riêng biệt Phân hóa tế bào

Phân hóa tế bào

Sự phản phân hóa

? Theo các bạn, người ta có thể can thiệp vào quá trình này hay không?

Để thúc đẩy phân bào, cần có sự tham gia của một

? Theo các bạn, ở thực vật có mấy phương thức sinh sản?

Cây con

Sinh sản vô tính

Sinh sản hữu tính

? Theo các bạn theo phương pháp truyền thống người ta thường tạo giống cây trồng bằng phương pháp nào?

Thuận lợi và hạn chế của các phương pháp

đó là gì?

Phương pháp nhân giống truyền thống

Phương pháp giâm cành

Giâm cành

hoa Thiên lý hoa Kim ngân Giâm cành

Chiết cành hoa Hoàng hậu

Chiết cành

Chanh dây

Ghép cà chua trên gốc cà tím

Ghép cành đào nhật tân với đào lông

Hoa Cẩm chướng trong ống nghiệm

Cây mít trong ống nghiệm

1.2 CN Nuôi cấy mô, tế bào thực vật – Tầm quan trọng và lịch sử phát triển

a Về mặt lý luận sinh học cơ bản

+ Giúp so sánh đặc tính của cơ thể với các hợp phần

quan giữa các bộ phận trong cây

+ Giúp phân biệt từng giai đoạn một cách cụ thể và chính xác theo chu kỳ phát triển của cá thể tạo thuận lợi cho công tác nghiên cứu về qui luật sinh trưởng, phát triển, quan hệ giữa chúng với môi trường… và chủ động điều khiển

sự phát triển cây trồng theo ý muốn.

+ Biết được nguyên nhân gây bệnh và đưa ra biện pháp phòng bệnh cho cây trồng

b Về mặt thực tiễn sản xuất

Kỹ thuật nhân giống in vitro có những ưu việt

mà các phương pháp khác không có được:

+ sử dụng các mô nuôi cấy nhỏ;

+ có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp;

+ có hệ số nhân giống rất cao và các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.

Ứng dụng vào thực tiễn sản xuất

Kỹ thuật nhân nhanh được ứng dụng vào những mục đích sau:

+ Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác giống.

+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt

+ Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác

+ Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus + Bảo quản tập đoàn gen

1.2.2 Lịch sử phát triển công nghệ nuôi cấy mô và tế bào thực vật

Năm 1838, học thuyết tế bào (cell theory) do hai nhà khoa học Schleiden và T Schwann đã ra đời:

“ Tất cả các tế bào thực vật và động vật đều được tạo nên từ nhiều nhóm tế bào và tế bào là đơn vị căn bản của sinh giới ”

Giai đoạn 1: Gottlieb Haberlandt (1902), đưa ra giả thuyết về tính toàn năng của tế bào.

Giai đọan 2: năm 1934, White nuôi cấy thành công cây Cà chua ( Lycopersicon esculentum )

Giai đoạn 3: Skoog và Miller (1957) thành công

trong nuôi cấy mô sẹo cây thuốc lá

Giai đoạn hiện nay, ứng dụng mạnh mẽ vào thực

tiễn chọn giống, nhân giống, vào sản xuất các hợp chất thứ cấp, nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao

Ở Việt Nam, nuôi cấy mô đã và đang trở thành một

trong những lãnh vực được quan tâm rất nhiều trong ngành trồng trọt.

Chương 2 NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO – KHÁI NIỆM CƠ BẢN VÀ QUY TRÌNH THỰC HIỆN

2.1 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN THƯỜNG DÙNG

TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITROIN VITRO

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN

2.5 CÁC HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG CÂY TRỒNG

BẰNG NUÔI CẤY MÔ

2.1 NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN THƯỜNG

DÙNG TRONG NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN VITRO

2.1.1 Các thuật ngữ chuyên ngành.

2.1.2.Phòng thí nghiệm

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

2.1.1 Các thuật ngữ chuyên ngành

- Tạo phôi vô tính - Mẫu cấy (explant)

- Mô sẹo (Callus) - Sinh trưởng bất định (adventitous)

- Dòng đơn tính (Clone) - Nuôi cấy (culture)

- Vô trùng (sterile) - Môi trường (medium, media)

2.1.2 Phòng thí nghiệm

a Cách bố trí PTN nuôi cấy mô Thực vật

b Các thiết bị chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật

1 2 3 4 5

6

Sơ đồ một phòng thí nghiệm nuôi cấy mô hoàn chỉnh:

1: Phòng rửa và sản xuất nước cất; 2: phòng sấy, hấp, kho thủy tinh sạch; 3: phòng chuẩn bị môi trường; 4: phòng chuẩn bị mẫu; 5: phòng cấy vô trùng; 6: phòng ảnh; 7: phòng kính hiển vi; 8,9: phòng sáng;

10: phòng sinh hóa.

b Các thiết bị chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật

1 Phòng rửa và nước cất:

+ Máy cất nước một lần + Máy cất nước hai lần

+ Máy sản xuất nước khử ion

2 Phòng sấy hấp

+ Tủ sấy 60 – 600 0 C

+ Nồi hấp tiệt trùng (autoclave) + Nồi hấp loại nhỏ

3 Phòng chuẩn bị môi trường

+ Máy đo pH chính xác 0,1 đơn vị

b Các thiết bị chủ yếu của phòng thí nghiệm nuôi cấy mô thực vật

4 Buồng cấy vô trùng

+ Đèn tử ngoại treo trần hoặc treo

7 Phòng sáng

+ Các giàn đèn huỳnh quang

+ Máy điều hòa nhiệt độ + Máy lắc ngang khoảng 100 vòng/phút

+ Các dụng cụ nuôi cấy tế bào đơn

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

- Các nguyên tố đa lượng

- Các nguyên tố vi lượng

- Các phụ gia hữu cơ

- Các chất kích thích sinh trưởng thực vật (phytohormone): auxin, cytokinin, acid abscisic (ABA), ethylene, gibberellin (GA)…

Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao

Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao  tạo rễ,

Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp

Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp  thân,

Nếu tỷ lệ này gần một đơn vị

Nếu tỷ lệ này gần một đơn vị  tạo mô sẹo.

- Nguồn carbon: Glucose, sucrose, fructose

- Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường: agar, alginate, phytagel, methacel và gel-rite

2.2 Các phương pháp nhân giống vô tính in vitro

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH IN

VITRO

2.2.1 Sinh trưởng không phân hóa (undifferentiated

growth)

a Nuôi cấy mô sẹo - callus

b Nuôi cấy dịch huyền phù tế bào

c Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

2.2.2 Sinh trưởng có phân hóa (differentiated growth)

a Nuôi cấy rễ tơ (hairy root)

b Công nghệ nuôi cấy phôi vô tính

2.2.3 Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) – phương pháp tạo cây sạch virus

a. Nuôi cấy mô sẹo – callus

Khi các phần bị cắt hay bị tổn thương của thân, rễ, lá…

được đặt vào trong môi trường thích hợp sau một thời

gian tại đó sẽ xuất hiện những phần mô lồi ra, có màu

trắng nhạt hoặc vàng nhạt, mô này gọi là mô sẹo hay

Callus (A) và tái sinh chồi từ callus (B) của chi Lilium

Quy trình nhân giống cây

trồng từ callus

 Kết luận : Sự tái sinh mô từ nuôi cấy callus : Sự tái sinh mô từ nuôi cấy callus

là sự cảm ứng các tế bào phân chia vô tổ chức bằng các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (plant growth regulators) trong môi trường dinh dưỡng rắn

b Nuôi cấy mô dịch huyền phù tế bào

Huyền phù tế bào là một môi trường lỏng được lắc liên tục (đôi khi là dịch thể tĩnh), trong đó có sự hiện diện của những tế bào soma cô lập hoặc những cụm nhỏ tế bào có khả năng phát sinh phôi, tái sinh thành một cây hoàn chỉnh.

 Kết luận : Nuôi cấy dịch huyền phù là sự tiến triển từ thực vật đến mẫu vật, tới callus và cuối cùng tới dịch huyền phù Sau vài tháng nuôi cấy (tùy theo nguồn nguyên liệu) trong môi trường lỏng, người ta sẽ nhận được một huyền phù tế bào ổn định gồm những tế bào cô lập hay những nhóm nhỏ tế bào có thể sử dụng cho các thí nghiệm về sự tái sinh thực vật hay các

kỹ thuật ở mức tế bào.

? Theo các bạn, chức năng chính của thành tế bào

là gì?

c Nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

 Các phương pháp tách thành tế bào:

Bằng phương pháp cơ học hoặc enzyme

1 Cơ học: mẫu được nghiền nhỏ rồi đưa vào dung dịch gây co nguyên sinh, làm cho phần nguyên sinh chất co lại Sự phản

co nguyên sinh tiếp theo sẽ làm giãn nở và đẩy phần nguyên sinh chất ra khỏi tế bào qua những khe hở  khá phức tạp,

số lượng tế bào trần tồn tại độc lập rất ít

2 Enzyme: vô trùng bề mặt mẫu lá, ngâm trong dung dịch thẩm thấu thích hợp, loại bỏ biểu bì mặt dưới (hoặc cắt mẫu

lá thành lát mỏng), sau đó xử lý với hỗn hợp enzyme (cellulase, hemicellulase, pectinase) có tỉ lệ thay đổi tùy theo nguồn mẫu  thu được lượng lớn tế bào trần

Cuscuta reflexa protoplast Spinach protoplast

 Quy trình nuôi cấy tế bào trần (protoplast)

1 Tách tế bào trần: chú ý chọn nguyên liệu, phương pháp tách, xác định tỉ lệ sống sót, loại bỏ xác thành tế bào còn sót lại

2 Nuôi cấy tế bào trần: chú ý mật độ tế bào, môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy

Dung hợp tế bào trần : là sự kết hợp của hai hay nhiều tế bào trần tạo ra một khối tế bào trần, trong đó nhân của chúng có thể kết hợp hoặc tồn tại riêng rẽ.

 tạo ra các khối callus hoặc phôi soma, ứng dụng tạo ra các khối callus hoặc phôi soma, ứng dụng trong tạo con lai tế bào soma, có thể xáy ra theo 2 con đường: tự phát hay cảm ứng

 Tóm lại :

Protoplast là những tế bào bị loại bỏ thành tế bào,

có thể được tạo ra bằng phương pháp cơ học hoặc enzyme Các protoplast được phân lập có thể thường được sử dụng để:

(1) biến đổi thông tin di truyền của tế bào thực vật,

(2) tạo ra cây lai vô tính thông qua dung hợp

protoplast (protoplast fusion),

(3) nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus ở thực vật… nghiên cứu sự xâm nhiễm của virus ở thực vật…

2.2.2 Sinh trưởng có phân hóa (differentiated growth)

a Nuôi cấy rễ tơ (hairy root)

b Nuôi cấy phôi (embryogenesis)

Nuôi cấy rễ tơ và sự phát triển cây hoàn chỉnh

từ nuôi cấy rễ tơ

a Nuôi cấy rễ tơ (hairy root)

a Nuôi cấy rễ tơ (hairy root)

Rễ tơ Nuôi cấy trên môi trường thích

hợp

Thu nhận sản phẩm

 Kết luận :

Nuôi cấy rễ tơ có thể bắt đầu từ việc tách rễ

tơ của nhiều loài thực vật   môi trường môi trường

nuôi cấy rễ sinh trưởng nhanh   sản xuất sản xuất

các chất thứ cấp.

b Nuôi cấy phôi (embryogenesis)

Khái niệm : Ở thực vật có hoa, phôi là những thực thể có hình thái rõ rệt và đảm nhiệm chức năng như giai đoạn trung gian trong thời kỳ chuyển tiếp giữa pha giao tử thể và bào tử thể, có 2 dạng: phôi hữu tính và phôi vô tính.

Cấu tạo phôi Thực vật

Nội nhũ

Lá mầm

Tiền tầng sinh gỗ Trụ dưới lá mầm

Mô phân sinh đỉnh rễ

Tế bào mầm của cuống noãn

Mô phân sinh đỉnh chồi

Vỏ phân sinh ngọn

? Theo các bạn, phôi thực vật phát triển trải qua mấy giai đoạn?

Các biến đổi hình thái phôi cây hai lá mầm

 Các giai đoạn hình thành phôi

 Kết luận

Sự hình thành phôi trải qua các giai đọan:

1 Sự biệt hóa tế bào có khả năng sinh phôi thành tế bào phôi,

2 Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình thành thông qua các giai đoạn sau: phôi hình cầu, phôi hình tim

và phôi cá đuối (thủy lôi, gậy) và phôi trưởng thành.

Phát sinh phôi vô tính có thể được khởi đầu theo hai con đường: phát sinh phôi trực tiếp (preembryogenic determined cell) hoặc phát sinh phôi gián tiếp

Sự phát triển phôi Arabidopsis

Sự phát triển phôi hoa lyly

 Nuôi cấy phôi hữu tính

Phôi hữu tính : có sự kết hợp giữa các loại giao tử khác nhau

- Kỹ thuật tách phôi : vật liệu thực vật  : vật liệu thực vật  vô trùng hạt trước khi tách phôi (hạn chế sự tổn thương của dây treo phôi vì đây là thành phần có vai trò rất quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát riển của phôi non).

- Thành phần môi trường nuôi cấy : thay đổi tùy theo loài và mục đích nuôi cấy

 Nuôi cấy phôi vô tính

Phôi vô tính có thể xuất hiện trong điều kiện in vitro từ 3

nguồn sau (Kohlenbach, 1978):

- Các tế bào sinh dưỡng của cây trưởng thành

- Các mô tái sinh không phải là hợp tử

- Các lá mầm và trụ dưới lá mầm của phôi và cây con, không có bất cứ sự phát triển nào của mô sẹo

Quá trình phát triển phôi cần chú ý 2 giai đoạn:

- Cảm ứng biệt hóa tế bào của những tế bào tiền phôi

- Biểu hiện của các tế bào tiền phôi

Các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi

soma từ nuôi cấy lá hoa lisianthus

Nuôi cấy phôi vô tính hoa African violet

Tiềm năng phát sinh phôi sinh dưỡng của mẫu cấy

 Ứng dụng của nuôi cấy phôi

- Thu nhận thể đơn bội: loại bỏ trực tiếp NST sau khi lai xa để thu nhận thể đơn bội

- Kiểm tra nhanh sức nảy mầm của hạt

- Nhân giống các cây hiếm

- Thụ phấn trong ống nghiệm

- Hạt nhân tạo

? Theo các bạn, thế nào là mô phân sinh đỉnh?

? Vị trí của MPS sinh trên cơ thể thực vật?

 Mô phân sinh (meristematic tissue) Mô phân sinh (meristematic tissue)

- Định nghĩa

Mô phân sinh là những tế bào non chưa phân hóa, có khả năng phân chia rất nhanh và liên tục cho tới cuối đời sống của cây để tạo thành các

mô khác.

Cấu trúc mô phân sinh (meristem)

Mô phân sinh đỉnh

Lá

Sơ khởi lá

Chồi thứ cấp

- Đặc điểm chung của MPS

 Là những tế bào non, chưa phân hóa

 Hình dạng không giống nhau ở các vị trí khác nhau: ở

phần ngọn (thân, rễ) có đường kính gần đồng đều, còn ở tầng phát sinh thì hẹp, dài, hình thoi.

 Kích thước tế bào nhỏ bé, chất tế bào đậm đặc, nhân to,

các không bào nhỏ li ti.

 Tế bào xếp sít nhau không để hở các khoảng gian bào

Vách tế bào mỏng, nước chiếm tới 92,5%, ngoài ra còn chứa chủ yếu là pectin và hemicellulose, rất ít cellulose.

? Theo các bạn, tại sao MPS đỉnh (meristem)

là nơi sạch virus và có thể dùng tạo cây sạch bệnh?

Meristem không có virus có thể do các lý do sau (Mathews, 1970, Wang et Hu, 1980):

+ Virus vận chuyển trong cây nhờ có hệ thống mô dẫn, hệ thống này không có ở mô phân sinh đỉnh.

+ Trong quá trình phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các thông tin di truyền của virus

+ Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng meristem mạnh hơn các vùng khác trong cây

+ Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép virus.