báo cáo thực tập tại trung tâm công nghệ sinh học đà nẵng

báo cáo thực tập tại trung tâm công nghệ sinh học đà nẵng

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình thực tập tại Trung tâm Công Nghệ Sinh Học Đà Nẵng em đã được các anh chị hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp chúng em hoàn thành nhiệm vụ nhà trường giao cho Em xin chân thành cảm ơn trung tâm rất nhiều, đặc biệt là chị Nguyễn Thị Minh Quyên (người hướng dẫn trực tiếp) và anh Võ Quốc Bảo – Trưởng phòng Công nghệ tế bào thực vật, cùng với tất cả các anh chị trong Trung tâm

Trung tâm Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện cho chúng em có cơ hội làm việc thực tế qua đó cũng cố lại những kiến thức lý thuyết đã học giúp chúng em hiểu thêm về ngành học của mình Trong một tháng thực tập, em không tránh khỏi những sai lầm và thiếu sót mong các anh chị thông cảm và bỏ qua cho em Em xin chân thành cảm ơn

1.1 Lịch sử, bộ phận chức năng và tình hình hoạt động của Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng: 5

1.2 Chức năng, nhiệm vụ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật: 5

1.3 Bố trí tổng mặt bằng trung tâm 6

1.3.1 Phòng rửa, sản xuất nước khử ion, hấp môi trường: 6

1.3.2 Phòng chuẩn bị môi trường: 8

1.3.3 Phòng nuôi mẫu cấy: 10

2.1 Thành phần chính của môi trường 11

2.1.1 Đường 11

2.1.2 Các muối khoáng đa lượng 11

2.1.3 Các muối khoáng vi lượng: 12

2.1.4 Các vitamin 13

2.1.5 Các chất điều khiển sinh trưởng: 13

2.1.6 Các chất hữu cơ khác 14

2.2 Vấn đề lựa chọn môi trường 15

2.3 Chuẩn bị các dung dịch làm việc 16

3.1 Nguồn gốc phân bố 21

3.2 Phân loại 21

3.3 Đặc điểm hình thái 21

3.4 Một số tác động ảnh hưởng đến Dendrobium 22

3.5 Các giai đoạn phát triển của lan 23

3.5.1 Giai đoạn nảy mầm của hạt 23

3.5.2 Giai đoạn cây con 23

3.5.3 Giai đoạn trưởng thành 23

3.5.4 Giai đoạn mang hoa, đậu trái, tạo hột 24

3.6 Phương pháp nhân giống lan 24

3.6.1 Phương pháp nhân giống lan cổ truyền 24

3.6.2 Phương pháp nuôi cấy mô 24

3.7.1 Qui trình nuôi trồng 24

3.7.2 Thuyết minh quy trình 25

3.7.3 Môi trường nuôi cấy 27

MỞ ĐẦU

Trên thế giới hiện nay, công nghệ sinh học được coi là một trong những ngành khoa học mũi nhọn của thế kỷ 21 Công nghệ sinh học đã và đang làm thay đổi dần cuộc sống của các dân tộc trên thế giới trong các lĩnh vực y tế (nhất là dược phẩm) công nghệ vi sinh, sinh học, nông nghiệp (giống cây, giống con) Có rất nhiều khám phá và ứng dụng từ các thành tựu công nghệ sinh học đã dược loài người thừa hưởng

Năm 2000 thị trường về các sản phẩm mới của công nghệ sinh học đạt khoảng 400 tỷ USD Trong đó, các sản phẩm phục vụ y dược 29 tỷ đồng, phục vụ công nghiệp thực SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 3

phẩm 12,66 tỷ đồng, phục vụ công nghiệp năng lượng 104,7 tỷ đồng, phục vụ công nghiệp hóa phẩm 13,53 tỷ đồng, axit amin 4,5 tỷ đồng, sản phẩm phục vụ nông nghiệp 218,7 tỷ đồng Các sản phẩm phục vụ riêng cho tạo giống cây trồng, vật nuôi là 210 tỷ đồng, các cây cố định đạm 8,7 tỷ đồng, dịch đường Fructose thay saccharose 5,4 tỷ đồng [1]

Một trong những thành tựu nổi bật của công nghệ sinh học là lĩnh vực nhân giống và phục tráng giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật, tạo ra công nghệ nhân nhanh các giống cây lương thực, rau quả, cây hoa cảnh, cây công nghiệp và cây rừng có năng suất chất lượng tốt và tính chống chịu cao đối với các điều kiện ngoại cảnh bất lợi cũng như sâu bệnh, phục vụ phát triển nông – lâm nghiệp và phủ xanh đất trống đồi núi trọc

Đối với một nước đang phát triển như nước ta hiện nay thì công nghệ sinh học chỉ bước đầu hình thành và phát triển thì việc đi sâu vào nghiên cứu cũng như ứng dụng những nghiên cứu đó vào thực tế sản xuất để nâng cao năng suất cây trồng, vật nuôi là việc làm cần thiết Vì thế là sinh viên ngành công nghệ sinh học thì việc thực tập thực tế để hiểu về quá trình sản xuất thực tế ngành nuôi cấy mô và qua đó cũng cố lại những kiến thức lý thuyết đã học là việc không thể thiếu Đó cũng là mục đích của việc thực tập tại Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng lần này

II TỔNG QUAN VỀ TRUNG TÂM CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐÀ NẴNG 1.1 Lịch sử, bộ phận chức năng và tình hình hoạt động của Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng:

- Lịch sử Trung tâm:

Được tách ra từ Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học và Ứng Dụng Khoa Học Công Nghệ Đà Nẵng theo quyết định số 8725/QD-UBND ngày 12 tháng 11 năm 2010 và chính thức trở thành Trung tâm Công nghệ Sinh học Đà Nẵng ngày 01.01.2011

1.2 Chức năng, nhiệm vụ phòng Công nghệ Tế bào Thực vật:

- Nghiên cứu và ứng dụng công nghệ tế bào thực vật nhằm sản xuất giống cây trồng chất lượng cao phục vụ các vùng trồng trọt, các nhà vườn, hộ nông dân trên địa bàn thành phố Đà Nẵng và các vùng lân cận

- Tham mưu cho Ban lãnh đạo Trung tâm trong sự phát triển ngành Công nghệ Tế bào Thực vật phục vụ công tác bảo tồn và nhân nhanh các giống cây trồng, nguồn gen thực vật quý, hiếm

- Đề xuất, nghiên cứu và triển khai các chương trình ứng dụng khoa học công nghệ, các đề tài, dự án thuộc các cấp

- Thực hiện công tác đào tạo, chuyển giao công nghệ tế bào thực vật cho các cá nhân, tổ chức có nhu cầu

SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 5

1.3 Bố trí tổng mặt bằng trung tâm

1.3.1 Phòng rửa, sản xuất nước khử ion, hấp môi trường:

- Dụng cụ, chai lọ thuỷ tinh được rửa bằng nước sạch

- Sau đó được úp trên kệ đựng chai lọ hoặc úp lên rổ để khô

- Chai lọ thuỷ tinh khô được cất vào thùng giấy

- Sử dụng nước cất để pha môi trường

- Môi trường sau khi nấu được rót vào các bình thuỷ tinh, đậy nắp rồi đưa vào nồi hấp trong 25 phút, ở 120 – 121oC, P = 1 – 1,1 at

SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 7

Nồi hấp môi trường

Thông số kỹ thuật của nồi hấp môi trường:

- Nhiệt độ: max = 370oC

- Áp suất: max = 4 kpa

- Dung tích 110 lít

1.3.2 Phòng chuẩn bị môi trường:

Gồm có tủ đựng hoá chất và các máy sau:

pH meter

Cân kỹ thuật Cân phân tích

- Độ chính xác 10-3 g - Độ chính xác 10- 4 g

SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 9

Phòng cấy vô trùng:

Phòng cấy vô trùng, sàn được lát gạch men, tường được sơn, trên tường có gắn đèn UV

để khử trùng phòng Cửa phòng cấy là cửa kính Trong phòng cấy có các kệ thép được sơn trắng để đựng bình môi trường Có 2 loại tủ cấy : tủ cấy đơn và tủ cấy đôi Trong

tủ cấy có đèn trắng để dễ làm việc và đèn UV để khử trùng trước khi làm việc Ngoài

ra, trong phòng cấy còn có bình chữa lửa để có thể dập tắt lửa kịp thời khi gặp sự cố như cháy đèn cồn

Tủ cấy đơn 1.3.3 Phòng nuôi mẫu cấy:

- Biên độ độ ẩm điều chỉnh được từ 20 – 98oC

- Phòng có gắn các máy kiểm tra chính xác nhiệt độ và độ ẩm

- Trong phòng có các giá bằng gỗ hoặc bằng thép được sơn trắng để bình nuôi cấy

- Các giàn đèn huỳnh quang nhiều ngăn, có độ chiếu sáng ở chổ để bình nuôi cấy từ 2000 – 3000 lux

- Phòng có máy điều hoà nhiệt độ

III MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Hầu hết tất cả những môi trường nuôi cấy bao giờ cũng gồm năm thành phần chính:

- Đường cung cấp nguồn carbon

- Các muối khoáng đa lượng

- Các muối khoáng vi lượng

- Các vitamin

- Các chất điều khiển sinh trưởng

Ngoài ra, tùy từng tác giả có thể bổ sung thêm một số chất hữu cơ có thành phần hóa học xác định (các amino acid, EDTA ) hoặc không xác định (nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch chiết cà chua )

2.1 Thành phần chính của môi trường

2.1.1 Đường

Hai dạng đường thường được sử dụng là saccharose và glucose Nhưng saccharose được sử dụng phổ biến hơn, tùy theo mục đích nuôi cấy mà nồng độ saccharose biến đổi từ 1-12%, thông dụng là 2-3%

2.1.2 Các muối khoáng đa lượng

Nhu cầu muối khoáng của mô và tế bào thực vật tách rời không khác nhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phải cung cấp là:

N, P, K, Ca, Mg và S (Bảng 2.1).

SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 11

Bảng 2.1 Các muối khoáng đa lượng dùng trong nuôi cấy mô [2]

4 Ca Ca(NO3)2.4H2O, CaCl2.2H2O hoặc khoảng 2

CaCl2.6H2O

2.1.3 Các muối khoáng vi lượng:

Nhu cầu muối khoáng của mô thực vật trong nuôi cấy là lĩnh vực ít được nghiên cứu Rất ít các nguyên tố vi lượng đã được chứng minh là không thể thiếu được đối với sự phát triển của mô và tế bào nuôi cấy

Bảng 2.2 Các muối khoáng vi lượng dùng trong nuôi cấy mô

2.1.4 Các vitamin

Các vitamin thường được dùng trong các môi trường nuôi cấy (chủ yếu là bốn loại đầu) Các dung dịch stock vitamin dễ hỏng do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong ngăn đá tủ lạnh

Bảng 2.3 Các loại vitamin thường dùng trong nuôi cấy mô [2]

2.1.5 Các chất điều khiển sinh trưởng:

Một số chất sinh trưởng không tan trong nước, do đó khi pha dung dịch mẹ chất sinh trưởng cần chú ý:

- Đối với BAP (hay BA): trước hết thêm 2-3 giọt nước cất và vài giọt HCl 1 N, lắc cho tan sau đó thêm nước cất đến thể tích cần pha

- Đối với KIN: thêm 2-3 giọt NaOH 1 N trước khi pha đến thể tích cần thiết.Bảo quản dung dịch mẹ chất sinh trưởng trong lọ kín (riêng IAA bảo quản trong lọ màu nâu), cất giữ tủ lạnh 2,4-D, NAA tương đối bền có thể bảo quản như vậy trong một năm BAP, IBA, KIN, và GA3 bảo quản được từ 2 đến 3 tháng IAA cần pha lại hàng tháng để đảm bảo hoạt tính

SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 13

Bảng 2.4 Chữ viết tắt của một số chất kích thích sinh trưởng

Chữ

viết

tắt

Chất kích thích sinh trưởng

Chữviết tắt

Chất kích thích sinh trưởng

BAP Benzyladeninpurine NAA Naphthaleneacetic acid

GA3 Gibberellic acid 2hZ Dihydrozeatin

IAA Indoleacetic acid TDZ Thidiazuron

IBA Indolebutyric acid Zea Zeatin

2-iP 2-Isopentenyl adenin D

2,4-Dichlorophenoxyacetic acid

NOA Naphthoxyacetic acid Pic Picloram

Chú ý:

Các chất sinh trưởng có thể tác động lên mô nuôi cấy ở nồng độ rất thấp (10 - 8) Cần dùng pipette riêng cho từng loại chất sinh trưởng một Và chú ý rửa cẩn thận các ly, cốc, chai lọc đã dùng để đựng và pha các chất sinh trưởng ở nồng độ cao Ngoại trừ IAA và GA3, các chất sinh trưởng còn lại được coi là bền vững trong quá trình hấp

vô trùng [2]

IAA sau khi pha dung dịch stock, được lọc qua màng lọc millipore sau đó chứa trong các tube eppendof được bọc giấy nhôm bên ngoài, bảo quản lạnh sâu Môi trường sau khi hấp khử trùng để nhiệt độ giảm xuống còn khoảng 50-60oC khi đó mới cho IAA đã lọc vào (các thao tác thực hiện trong tủ cấy vô trùng)

2.1.6 Các chất hữu cơ khác

2.1.6.1 Nước dừa

Chất có hoạt tính trong nước dừa hiện đã được chứng minh là myo-inositol và một số amino acid khác Lượng nước dừa dùng trong môi trường nuôi cấy thường khá

và bảo quản trong lạnh sâu cho đến khi dùng Thời gian bảo quản không quá vài tháng Tốt nhất là nên sử dụng tươi.

2.1.6.2 Dịch chiết nấm men và dịch thủy phân casein

Đây là các chế phẩm thường dùng trong nuôi cấy vi sinh vật, mô và tế bào động vật đã được tiêu chuẩn hóa và bán dưới dạn thương phẩm, thành phần hóa học không rõ Dung dịch thủy phân casein cung cấp một số amino acid, lượng thường dùng là 1g/1 L môi trường

2.2 Vấn đề lựa chọn môi trường

Khi khởi sự nuôi cấy mô và tế bào một số đối tượng nhất định, vấn đề đặt ra là chọn môi trường nào và trên cơ sở nào để phối hợp tỷ lệ các chất dinh dưỡng Cách thường làm là qua các tài liệu đã xuất bản, xem các tác giả nuôi cấy mô trên cùng đối tượng ấy hoặc các đối tượng gần gũi về mặt phân loại đã dùng loại môi trường gì Bước đầu có thể giữ nguyên môi trường của các tác giả đó hoặc trên cơ sở đó mà cải tiến cho phù hợp qua một số thí nghiệm thăm dò

Trong hàng trăm môi trường do rất nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây khác nhau, nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau, có thể chia ra làm ba loại:

- Môi trường nghèo chất dinh dưỡng: điển hình là môi trường White, Knop và Knudson C

- Môi trường trung bình: điển hình là môi trường B5 của Gamborg

- Môi trường giàu chất dinh dưỡng: Điển hình là môi trường Murashige-Skoog

và Linsmaier-Skoog

Vì vậy, khi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy mô một số đối tượng mới, chưa có tài liệu trước thì nên thăm dò so sánh ba loại môi trường trên xem đối tượng nghiên cứu thích hợp với loại môi trường nào nhất Sau đó, cần tìm tỷ lệ NO3-/NH4 thích hợp Việc sử dụng mang tính kinh nghiệm đối với một số môi trường đã cản trở khá nhiều sự tiến bộ trong các nghiên cứu về nuôi cấy mô và tế bào thực vật

SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 15

Hiện nay, môi trường Murashige-Skoog được coi như là một môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về chất dinh dưỡng Vì vậy, những người mới tập sự nuôi cấy mô thường bắt đầu với môi trường này trước khi tìm ra được môi trường riêng của mình.

2.3 Chuẩn bị các dung dịch làm việc

Để thuận tiện cho việc pha các môi trường nuôi cấy (môi trường làm việc), người ta không cân hóa chất cho mỗi lần pha môi trường mà chuẩn bị trước dưới dạng đậm đặc (stock), sau đó chỉ cần pha loãng khi sử dụng Các dung dịch đậm đặc được bảo quản dài ngày trong tủ lạnh thường hoặc tủ lạnh sâu Nếu chuẩn bị môi trường tốt thì sẽ giảm một số thời gian đáng kể cho công tác nuôi cấy

Chuẩn bị môi trường Murashige-Skoog (MS, 1962), Chia làm 5 phần:

Bảng 2.5 Thành phần môi trường MS [2]

Dung dịch stock Nồng độ

NH4NO3 1650 16,5MgSO4.7H20 370 3,7

MnSO4.4H2O 22,3 0,446CoCl2.6H2O 0,025 0,5CuSO4.5H2O 0,025 (× 20) 0,5 10 mLZnSO4.4H2O 8,6 0,172

Chuẩn bị môi trường Nitsch (Nt, 1956) Chia làm 5 phần:

Bảng 2.6 Thành phần môi trường Nitsch [2]

Dung dịch stock

Nồng độ

(mg/L)

Nồng độ trong dung dịch mẹ (g/200 mL)

Dung tích dùng cho 1 L môi trường

ZnSO4.4H2O 10 0,2Na2MoO4.2H2O 0,25 0,5 mg

Chuẩn bị môi trường nuôi cấy protoplast

- Môi trường phân lập (Protoplast Isolation medium –PI)

Bảng 2.7 Thành phần môi trường phân lập PI [2]

- Môi trường nuôi cấy (Protoplast Culture medium –PC)

Bảng 2.8 Thành phần môi trường PC [2]

Dung dịch stock Nồng độ

(mg/L)

Nồng độ

trongdung dịch mẹ

(g/200 mL)

Dung tích dùng cho 1

trườngPC1: Ca(H2PO4)2.2H2O 100 (× 20) 2 10 mL

III NUÔI CẤY IN VITRO LAN DENDROBIUM 3.1 Nguồn gốc phân bố.

Giống lan này được Olf Swartz đặt tên vào năm 1799 Giống Dendrobium có khoảng 16000 loài và được tạo thêm nhiều loại mới Tên Dendrobium có nguồn gốc từ chữ Hy Lạp “Dendro”- có nghĩa là gỗ, “bios”- có nghĩa là sống Dendrobium hầu hết là

thực vật biểu sinh, sống bám trên vỏ cây Ở Việt Nam người ta gọi là Hoàng Lan, hay

có người gọi là Đăng Lan [3]

Dendrobium chỉ được tìm thấy ở Đông Bán Cầu, trải dài từ Australia, xuyên suốt nam Thái Bình Dương, Phillipines, Ấn Độ, xuất hiện một ít ở Nhật Bản và xuất hiện nhiều nhất ở Đông Nam Á

Do quá đa dạng nên Dendrobium tập trung thành 2 dạng chính:

+ Dạng đứng (Dendrobium Phalanopsis): thường mọc ở xứ nóng, chịu ẩm, rất

siêng ra hoa

+ Dạng thòng (Dendrobium Nobile): chịu khí hậu mát mẻ ở vùng đồi núi cao

như Đà Lạt, Lâm Đồng…

Ở Việt Nam Dendrobium có đến 100 loài, xếp trong 14 tông, được phân biệt

bằng thân (giả hành), lá và hoa

3.2 Phân loại.

Vị trí phân loại:

+ Lớp một lá mầm : (Monocotyledones)+ Bộ : Orchidales

+ Họ : Orchidaceae+ Họ phụ : Epidendroideae+ Tông : Epidendreae+ Giống : Dendrobium

3.3 Đặc điểm hình thái

Dendrobium có số lượng khá lớn, phân bố rộng rãi nên đặc điểm hình thái đa

dạng, do đó không có một hình dạng chung nhất định nào về hoa và dạng cây

SVTT: Nguyễn Lương Bằng Trang 21