Thực hành công nghệ sinh học

Nguyên liệu chính dùng để sản xuất men là mật rỉ, ngoài ra một số hóa chất khác sẽ được cung cấp trong quá trình nuôi cấy men để bổ sung các chất dinh dưỡng mà mật rỉ không đủ[3].. Nếu s

BÀI 1 SẢN XUẤT SINH KHỐI NẤM MEN

I Tổng quan

S accharomyces là một chi nấm men được sử

dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm như làm bánh

mì, sản xuất cồn Saccharomyces có nghĩa là nấm

đường và là loại vi sinh vật duy nhất được sản xuất

với quy mô rất lớn trên thế giới Nguyên liệu chính

dùng để sản xuất men là mật rỉ, ngoài ra một số hóa

chất khác sẽ được cung cấp trong quá trình nuôi cấy

men để bổ sung các chất dinh dưỡng mà mật rỉ

không đủ[3]

S accharomyces cereviseae có những yêu cầu công nghệ sau[2]:

Có sức phát triển maajnh trong dịch đường lên men

Có khả năng tiết ra hệ enzyme zimaza để lên men nhanh và hoàn toàn

Có khả năng lên men ở nhiệt độ tương đối cao mùa hè (35-380)

Có khả năng chịu được ở độ cồn tương đối ( khoảng trên 100) trong quá trìnhlên men

Chịu được ở môi trường acid, có pH khoảng 4-4,5 hoặc thấp hơn

Trong quá trình nuôi cấy nấm men người ta phải kiểm soát lượng mật rỉ nạp vào bồnlên men theo lượng cồn có trong môi trường lên men Nếu lượng mật nạp vào nhiều quánấm men sẽ không sinh sản mà sẽ thực hiện quá trình lên men tạo ra cồn khiến nồng độcồn tăng cao và năng suất men sẽ giảm, nhưng nếu lượng mật nạp vào quá ít nấm men sẽthiếu dinh dưỡng cho sinh trưởng[3]

Chất lượng của nấm men phụ thuộc vào công dụng của nó Nếu sản xuất men bánh

mì thì năng lực sinh khí trong bột (hoạt tính) là thông số cần kiểm soát, nếu nấm mendùng cho công nghiệp cồn t hì khả năng chịu nồng độ cồn cao là quan trọng[3]

Hiện nay nhờ vào tiến bộ của công nghệ gen nên người ta có thể tạo ra các chủngnấm men phù hợp với các công dụng của nó và cho năng suất cao Tuy nhiên công nghệkiểm soát quá trình lên men vẫn đóng vai trò quan trọng để sản xuất các mẻ men chấtlượng và sản lượng cao[3]

Quy trình sản xuất nấm men có thể tóm tắt như sau[3]:

Nuôi cấy trong phòng thí nghiệm  Nuôi cấy men giống trong nhà máy  Lytấm men giống  Nuôi cấy men thương mại  Ly tấm men thương mại  Lọc men Đóng gói sản phẩm men tươi hoặc sấy khô để có sản phẩm men khô

Hình 1: Saccharomyces

cereviseae

Sản phẩm men tươi có thời hạn sử dụng ngắn chỉ vài tuần và phải trữ lạnh, sảnphẩm men khô có thời hạn sử dụng dài hơn, thường trên 1 năm nếu được hút chân không

và được trữ trong điều kiện thường[3]

Quá trình sản xuất men sẽ tiêu tốn rất nhiều nước và thải ra môi trường một lượnglớn nước thải với hàm lượng COD và BOD cao đòi hroi các nhà máy pahri trang bị một

hệ thống xử lý nước thải[3]

 Đánh giá chất lượng men trong sản xuất:

Những nòi men rượu được dùng trong sản xuất cần có những yêu cầu sau: hoạtlực lên men cao, chịu được độ rượu cao, có khả năng phát triển và hoạt động trong môitrường acid, có thể chịu đựng được một số sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật tạpnhiễm[2]

Những giống men rượu tinh bột cần phải lên men được glucose, maltose và cácmono hoặc disaccarit khác có chứa trong môi trường cũng như biến đổi được cácdextrin[2]

Nấm men dùng trong thùng lên men cần có những chỉ số sau: số lượng tế bào nảychồi 10-15%, lượng tế bào chết không quá 2-4% ( số này tăng có nghĩa là trong môitrườgn có mặt các tác nhân kìm hãm hoạt động sống của nấm men); số tế bào chứaglycogen không nhỏ hơn 70% số lượng tế bào nấm men không nhỏ hơn 120 – 140 triệu/

ml [3]

II Nguyên vật liệu và phương pháp thí nghiệm

II.1 Nguyên vật liệu

- Giống nấm men được sử dụng là Saccharomyces cerevisiae được nuôi và giữu

trong ống nghiệm thạch nghiêng

- Thiết bị lắc ổn nhiệt

- Kính hiển vi

- Buồng đếm hồng cầu

- Dung dịch Methylen blue( cần được lọc bỏ tạp chất vì nếu có tạp chất thì khi

quan sát trong kính hiển vi sẽ khó đếm được tế bào nấm men)

- Nhóm chuẩn bị môi trường gồm các thành phần sau:

II.2 Phương pháp thí nghiệm

II.2.1 Sản xuất sinh khối

- Chuyển giống( mà cán bộ phòng thí nghiệm đã nuôi cấy trong 72 giờ ở điều

kiện nhiệt độ phòng) vào bình chứa môi trường đã chuẩn bị

- Số lượng nấm men được thêm vào môi trường là ml.

- Cho bình tam giác vào thiết bị lắc ổn nhiệt, lắc với tốc độ 220 rpm.

+ Hút 5ml dung dịch đã bổ sung nấm men cho vào ống nghiệm

+ Từ 5ml trên hút 4ml dung dịch cho vào ống nghiệm, sau đó bổ sung 1 giọtMethylen blue Lắc đều trong vòng 1 phút để màu thấm vào tế bào chết Cho dung dịchtrong ống nghiệm lên buồng đếm hồng cầu và quan sát dưới kính hiển vi

o Đếm tổng số tế bào trên 5 ô vuông lớn

o Đếm tổng số tế bào chết( là tế bào có màu xanh, mà khi quan sát ta thấy tếbào toàn màu đen) trên 5 ô vuông lớn

o Đếm tổng số nấm men nảy chồi trên 5 ô vuông lớn Chỉ đếm những tế bào

có chồi < ½ tế bào mẹ, các chồi > ½ tế bào mẹ được tính là một tế bào riêng lẻ

o Từ lần đếm thứ 2 trở lên nên pha loãng gấp 2,3…với nước để dễ quan sát vìsau thời gian lắc ổn nhiệt thì số lượng tế bào nấm men sẽ tăng

II.2.3 Tiến hành đo độ hấp thu A600nm

- Sau khi hút 4ml từ dung dịch mẫu để đếm tế bào thì 1ml còn lại sẽ pha với 4ml

nước rồi đem đi đo độ hấp thu với bước sóng là 600nm

 Lưu ý:

- Cần tiến hành đo độ hấp thu và đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu trong thời gian

gần nhau vì nếu để 2 thí nghiệm này cách xa nhau sẽ làm sai lệch kết quả vì tế bào nấmmen nảy chồi hay chết rất nhanh Ví dụ: khi ta đo độ hấp thụ xong, khoảng nữa tiếng saumới đếm tế bào thì số lượng tế bào để đếm và để đo độ hấp thu là khác xa nhau

- Khi đếm trên buồng đếm hồng cầu thì thời gian đếm không được quá 15 phút, vì nếu

đếm lâu quá thì số lượng tế bào sẽ thay đổi

- Sau mỗi thời gian lắc ổn nhiệt để tế bào nấm men phát triển thì khi đếm tế bào cần

pha loãng dung dịch để dễ đếm số lượng tế bào

III Kết quả và biện luận

III.1 Số liệu khi thực hành

600nm

Tổng

số tếbào

Tổng số

tế bàotrong 5

ô vuônglớn

Tổng

số tếbàonảychồi

Tổng số tếbào nảychồi trong

5 ô vuônglớn

Tổng số

tế bàochết

Tổng số tếbào chếttrong 5 ôvuông lớn

- Tổng số tế bào trong 1 ml nghiên cứu

- Tổng số tế bào nảy chồi trong 1ml mẫu nghiên cứu:

1250 10

15875 10

x

x x100= 0,79%

+ Lúc 13giờ:

3 4

Na: Tổng số tế bào trong 1ml mẫu nghiên cứu

Nb: Tổng số tế bào chết trong 1ml mẫu nghiên cứu

Nc: Tổng số tế bào nảy chồi trong 1ml mẫu nghiên cứua: Tổng số tế bào trong 5 ô vuông lớn

a1: Tổng số tế bào chết trong 5 ô vuông lớn

a2: Tổng số tế bào nảy chồi trong 5 ô vuông lớnb: Số ô vuông nhỏ trong 5 ô vuông lớn (16x5 = 80 ô vuông nhỏ)400: Tổng số ô vuông nhỏ

0,1: Thể tích dịch tế bào (tính bằng mm3) chứa trên ô trung tâm

103: Số chuyển mm3 thành ml (1000mm3 = 1 ml)n: Độ pha loãng của mẫu dung dịch nuôi cấy nấm men

3.2.2 Cách tính thông số về sinh trưởng và phát triển của nấm men trong mẫu thínghiệm

a) Thời gian thế hệ (g)

Nếu số tế bào ban đầu không phải là 1 mà là N0 thì sau n lần phân chia ta sẽ có tổng

số tế bào là N, với t = (t2-t1) biểu thị sự sai khác giữa thời gian t1 và thời gian t2 trongtrường hợp của bài thí nghiệm này, t = t2 - t1 = 1 giờ)

g =

t

n =

2 1 0

log 27,6 6,9 = 0,4+ Lúc 11h: g =

log 23,9 6,9 = -0,1+ Lúc 12h: g =

log 2

8, 2 6,9 = 0,23+ Lúc 13h: g =

log 2

8, 4 6,9 = 0,2+ Lúc 14h: g =

log 28,7 6,9 = 0,17

b) Hằng số tốc độ phân chia (c)

Giá trị nghịch đảo của thời gian thế hệ hay là số lần phân chia sau một đơn vị thờigian ( tức là sau 1 giờ) gọi là hằng số tốc độ phân chia ( c ) Hằng số tốc độ phân chia phụthuộc vào: loài vi sinh vật, nhiệt độ nuôi cấy, môi trường nuôi cấy…

c =

1

g =

n t

+ Lúc 9h: g =

11,5 = 0,7+ Lúc 10h: g =

1

0, 4 = 2,5

+ Lúc 11h: g =

10,1

 = -10

+ Lúc 12h: g =

1

0, 23 = 4,34+ Lúc 13h: g =

1

0, 2 = 5+ Lúc 14h: g =

10,17 = 5,9c) Hằng số tốc độ sinh trưởng ()Mối quan hệ giữa hằng số tốc độ sinh trưởng (), hằng số tốc độ phân chia (c) vàthời gian thế hệ ( g ):

 

= 0,46+ Lúc 10h:

0,69

0, 4

 

= 1,725+ Lúc 11h:

0,690,1

0,69

0, 2

 

= 3,45+ Lúc 14h:

0,690,17

 

= 4,1d) Đo độ đục

Abs=KxCVới :K là hằng số

C là số lượng tế bào đếm được

Abs là độ hấp thu ánh sáng

Tỉ lệnảychồi(%)

8h là thời điểm ngay khi vừa cho giống vào môi trường nuôi cấy

Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa độ hấp thụ A600nm và nồng độ tế bào

Thờigian(giờ)

A600nm

Tổng

số tếbào

THỜI GIAN NUÔI CẤY

III.3 Biện luận

Kết quả có thể không chính xác do:

- Tiến hành đo độ hấp thu và đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu trong thời gian

không gần nhau vì nếu để 2 thí nghiệm này cách xa nhau sẽ làm sai lệch kết quả vì tế bàonấm men nảy chồi hay chết rất nhanh

- Khi đếm trên buồng đếm hồng cầu thì thời gian đếm quá 15 phút, do điều chỉnh kính

hiển vi, dẫn đến số lượng tế bào tăng hay giảm

- khoảng thời gian chờ giữa các lần đếm tế bào bị sai lệch.

- Sau mỗi thời gian lắc ổn nhiệt để tế bào nấm men phát triển thì khi đếm tế bào

không pha loãng dung dịch nên khó đếm số lượng tế bào

- Khi đo độ hấp thu không đo mẫu chuẩn trước.

- Buret đựng dung dịch cần đo độ hấp thu bị trầy xước.

- Buồng đếm hồng cầu hay kính hiển vi mờ nên không đếm chính xác số lượng tế

bào

- Người đếm tế bào bị mệt hay mờ mắt nên đếm không kĩ.

BÀI 2 SẢN XUẤT THẠCH DỪA

I Tổng quan

Thạch dừa ( Nata de coco) được tạo thành bởi

sự lên men vi khuẩn Acetobacter xylinum trong môi

trường nước dừa già Thạch dừa là sản phẩm trắng

trong như thạch agar, hơi dai, có bản chất hóa học

là polysaccharide nên không có giá trị dinh dưỡng

cao, nhưng có đặc tính kích thíc nhu động ruột làm

cho việc điều hòa bài tiết được tốt hợn Chế phẩm

từ dừa này còn có tác dụng phòng ngừa ung thư và có thể giữ cho da được mịn màng.Những năm gần đây, số lượng người mắc bệnh béo phì ở các nước phát triên đang giatăng rất nhanh Thạch dừa là loại thực phẩm chứa ít năng lượng và có giá trị cảm quancao, là một phương thuốc thần diệu để giảm nguy cơ mắc bệnh béo phì [4]

1.1Thành phần của trái dừa - ứng dụng

Dừa là cây thuộc họ Palmas, bộ Sapdiciflorales Cây dừa thường ra hoa từ năm 7-12

tuổi sau khi trồng Từ thụ phấn đến khi trái chin là 12-13 tháng Khi chin, trái dừa nặng1,2-2 kg[4]

Bảng 1: Thành phần và khối lượng các bộ phận trên trái dừa nặng 1,2kg[4]

Bã dừaẩm

0,360,120,060,18

30

1.1.2 Vỏ dừa:

Gồm xơ và bụi xơ Xơ dừa dùng để se chỉ hay đan

lưới, xoắn hay tấm cao su làm nệm giường, bọc ghế,

thảm, màng lọc không khí, chất cách nhiệt…nhưng

hiệu quả kinh tế kém khi triển khai ở qui mô lớn[4]

1.1.3 Gáo dừa

Nằm dưới lớp vỏ, hình cầu, có bề dày 3-5 mm

Thành phần chính của gáo dừa là ligin, cellusoe,

pentosan giống như gỗ Được ứng dụng làm chất đốt

(cháy đề, không khói) [4]

1.1.4 Cơm dừa

Chất rắn màu trắng, bè dày khoảng 10 mm, bên ngoài

có một lớp vỏ nâu mỏng Cơm dừa được ứng dụng làm thực phẩm dưới nhiều dạng sảnphẩm khác nhau (cơm dừa khô, cơm dừa nạo sấy, sữa dừa đóng hộp…)[4]

.1.1.5 Nước dừa

Trung bình một trái dừa có chứa 300ml nước, chiếm 25% trọng lượng trái dừa Nướcdừa là loại nước giải khát phổ biến vì chứa nhiều chất dinh dưỡng như: đường, protein,lipid, vitamin, và khoáng nhưng với nồng độ rất loãng[4]

Bảng 2: Thành phần hóa học của nước dừa[4]

Bảng 4: Các acid amin có trong nước dừa[4]

(% khối lượng/ amin tổng

số)

1.2 Vi sinh vật trong sản xuất thạch dừa

1.2.1 Đặc điểm giống vi khuẩn Acetobacter:

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadieae, phân bố rỗng rãi trong tự

nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất, nước, lương thực thực

phẩm, dấm, rượu, bia, hoa quả… có khoảng 20 loài thuộc giống Acetobacter đã được

phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý nghĩa kinh tế[4]

Vi khuẩn Acetobacter: Dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy ( nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra các tế bào có hình

thái khác biệt dạng kéo dài hay phình to ra Không sinh nha bào tử, hiếu khí bắt buộc,

chịu được độ acid cao Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hóa nhiều nguồn thức ăn

cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột Tế bào đứng riêng lẻ hoặc kếtthành từng chuỗi Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏng, khả năng tạo thànhváng thay đổi tùy loại:

 Acetobacter xylinum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc.

 Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc.

 Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo.

 Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng dễ tan rã.

 Acetobacter curvum: sinh acid acetic với nồng độ cao nhưng tạo thành váng

không chắc chắn

 Acetobacter có khả năng đồng hóa muối (NH4)+ và phân giải pepton Một

số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acid pantothenic và các chất khoáng K,

Mg, Fe, P, S… ở dạng muối vô cơ, hữu cơ hoặc hợp chất hữu cơ Do đó bia, dịch tự phânnấm men, nước mạch nha, nước trái cây… là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển

của vi khuẩn Acetobacter Ngoài khả năng oxy hóa ethanol thành acid acetic, một số loài

Acetobacter còn tổng hợp được vitamin B1, B2, oxy hóa sorbit thành đường sorbose (dùngtrong công nghiệp sản xuất vitamin C) [4]

1.2.2 Phân loại Acetobacter

Đến nay đã có nhiều tác giả đề cập đến vấn đề phân loại các loài vi khuẩn giống

Acetobacter, nhưng đáng chú ý nhất là bảng phân loại Acetobacter schutzenbachii: trực

khuẩn dài, tạo thành ván dày, và không bền vững, có khả năng tích lũy trong môi trườngđến 11,5% acid acetic do đó thường được sử dụng để làm giấm theo phương pháp nhanh(phương pháp của Đức) [4]

Acetobacter suboxydans: tạo thành váng mỏng, dễ vỡ ra, có khả năng chuyển hóaglucose thành acid gluconic hay sorbic thành sorbose Loại vi khuẩn này muốn phát triểnbình thường cần được cung cấp một số chất sinh trưởng như acid para aminopenzoic,acid panthoteric, acid nicotinic[5]

Acetobacter orleansen: trực khuẩn dài trung bình không di động Gặp điều kiệnnhiệt độ cao có thể sinh ra các tế bào dị hình kéo dài hoặc phình to ra Tạo ra váng rất dàytrên môi trường dịch thể Có thể phát triển được có nồng độ rượu cao (10%-20%) và làmtích lũy đến 9,5% acid acetic Thường được dùng trong công nghiệp chuyển rượu vangthành giấm (phương pháp của Pháp) Phát triển thích hợp ở nhiệt độ 25-300C[5]

Acetobacter xylinum: trực khuẩn không di động, tạo thành váng nhăn và khá dày.

Váng có chứa hemicelluloses nên khi gặp H2SO4 và thuốc nhuộm iod sẽ bắt màu xanh

Có thể tích lũy 4,5% acid acetic trong môi trường Thường gặp loài vi khuẩn này cungvới nấm men trong “nấm chè” còn gọi là “thủy hoài sâm”, một loại sản phẩm giải khát bổdưỡng theo cách làm của người Trung Hoa Đó là một loại nước chua có vị thơm dùng

để pha nước giải khát trong các gia đình người Trung Hoa, trên mặt nước có một váng visinh vật dày được nuôi sống bằng nước chè và đường [5]

Acetobacter aceti: trực khuẩn ngắn, không di động, thường xếp thành từng chuỗi

dài Váng của vi khuẩn bắt đầu màu vàng khi nhuộm bằng thuốc nhuộm iod, chúng có thểphát triển trong môi trường có đồng độ rượu khá cao 11% và có thể tích lũy đến 6% acidacetic trong môi trường, phát triển thích hợp nhất ở nhiệt độ 340C [5]

Acetobacter pasteurianum: hình dạng tương tự như loại trên nhưng váng vi khuẩn

có dạng khô và nhăn nheo, váng bắt màu xanh khi nhuộm với thuốc iod [5]

1.2.4 Giống Acetobacter xylinum:

Chủng Acetobacter xylinum này có nguồn gốc từ Philippien Acetobacter xylinum thuộc nhóm vi khuẩn Acetic Theo hệ thống phân loại của nhà khoa học Bergey thì

Acetobacter xylinum thuộc: lớp Schizommycetes, bộ Pseudomonadales, họ Pseudomonadieae[5]

Acetobacter xylinum là loại vi khuẩn dài khoảng 2m, đứng riêng lẻ hoặc xếpthành chuỗi, có khả năng tạo váng hemicelluloses khá dày, bắt màu với thuốc nhuộm iod

và H2SO4[5]

Acetobacter xylinum sinh trưởng ở pH < 5, nhiệt độ là 28-320C và có thể tích lũy4,5% acid acetic Acid acetic là sản phẩm sinh ra trong quá trình hoạt động của vi khuẩn,nhưng khi chúng vượt quá mức cho phép, chúng sẽ quay ngược trở lại làm ức chế hoạtđộng của vi khuẩn[5]

Acetobacter xylinum hấp thụ đường glucose từ môi trường nuôi cấy Trong tế bào

vi khuẩn, glucose này sẽ kết hợp với acid béo tạo thành một tiền chất nằm trên màng tếbào Kế đó nó được thoát ra ngoài tế bào cùng với một enzyme Enzyme này có thểpolymer hóa glucose thành cellulose[5]

.Polysaccharide của vi sinh vật thường được tích lũy đáng kể trong các môi trườnglỏng Vi sinh vật có khả năng tổng hợp các oligo và polysaccharide Lượng các oligo vàpolysaccharide nội bào có thể đạt tới 60% trọng lượng khô của tế bào[5]

Tất cả oligo và polysaccharide được tổng hợp bằng cách kéo dài chuỗi saccharide

có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosaccharide Đơn vị monosaccharide đượcthêm vào tham gia phản ứng ở dạng nucleo tide, monosaccharide được hoạt hóa thường

là dẫn xuất của các uridin diphosphate (UDP-X) nhưng đôi khi cũng với các nucleotide,purin và các pirimidin khác[5]

Sự tổng hợp diễn ra theo phản ứng sau[5]:

….X-X-X-X- + UDP-X = ….X-X-X-X-X + UDP

Cơ chế quá trình sinh tổng hộp diễn ra theo sự tổng hợp các loại polysaccharidephân nhánh hiện chưa rõ[5]