Noùi chung, khi coù moät yeáu toá laï coù haïi- coù theå gaây caùc hieäu öùng sinh hoùa (khaùng nguyeân) xaâm nhaäp vaøo cô theå, heä thoáng mieãn dòch coù nhieäm vuï nhaä[r]
(1)Bài
NHẬN DIỆN KHÁNG NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP OUTERLONY
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT
1. Các khái niệm cần nhớ
Miễn dịch khả thể nhận loại bỏ vật lạ (kháng nguyên - Ag: Antigen) Từ cổ xưa, người ta biết ứng dụng miễn dịch việc phòng trừ số bệnh nhiễm khuẩn, khái niệm miễn dịch học xuất từ sớm Tuy nhiên, cuối kỷ thứ XIX, miễn dịch học trở thành môn khoa học riêng biệt Trong lịch sử phát triển môn miễn dịch học, quan niệm đáp ứng miễn dịch thay đổi theo tiến khoa học kỹ thuật đồng thời có mối liên hệ mật thiết với số ngành khoa học khác Sinh học phân tử, Y sinh học, Dược học, Thú y, Vi sinh học…
Trong thể động vật bậc cao (trong có người), đáp ứng miễn dịch tạm chia thành hai loại: đáp ứng miễn dịch tự nhiên đáp ứng miễn dịch thu được Tuy nhiên hai khái niệm có mối quan hệ mật thiết với Nói chung, có yếu tố lạ có hại- gây hiệu ứng sinh hóa (kháng nguyên) xâm nhập vào thể, hệ thống miễn dịch có nhiệm vụ nhận biết sau có hoạt động có hiệu để loại bỏ Đáp ứng miễn dịch dịch thể đáp ứng miễn dịch tế bào hai phương thức mà hệ thống miễn dịch sử dụng để chống lại kháng nguyên Đối với miễn dịch dịch thể kháng thể hịa tan, xác globulin miễn dịch đảm đương chức Các globulin miễn dịch sản xuất từ tế bào plasma (tương bào), biệt hóa từ lympho bào B
(2)
Hình 45 :Sơ đồ cấu trúc phân tử Ig.
Về phân loại, người ta chia Ig thành lớp phân tử sau:
+ Globulin miễn dịch G (IgG): chiếm khoảng 70-75% tổng số Ig huyết người Đây lớp kháng thể chủ yếu đáp ứng miễn dịch phân tử độc quyền kháng độc tố Lớp IgG có vai trò quan trọng chế đáp ứng miễn dịch + Globulin miễn dịch A (IgA): chiếm khoảng 15-20% tổng số Ig huyết Chúng có hai loại IgA nội dịch huyết IgA tiết niêm mạc IgA phương tiện bảo vệ chỗ hữu hiệu thể, ngăn cản xâm nhập kháng nguyên (virus, vi khuẩn, tế bào lạ, phân tử sinh hóa…)
+ Globulin miễn dịch M (IgM): chiếm khoảng 10% tổng lượng IgG huyết thanh, chúng có vai trị đặc biệt quan trọng trường hợp nhiễm khuẩn sớm
+ Globulin miễn dịch D (IgD): chiếm 1% tổng lượng Ig huyết Cho tới chức IgD chưa xác định rõ ràng, người ta thường thấy nồng độ chúng tăng chậm trường hợp nhiễm khuẩn mãn tính khơng đặc hiệu cho loại nhiễm khuẩn
(3)2. Phản ứng kháng nguyên- kháng thể
IgG hệ thống miễn dịch có nhiệm vụ kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên Đây chức quan trọng bên cạnh chức khác hoạt hóa bạch cầu, bổ thể, hoạt hóa chế vận chuyển qua màng tế bào…
Khả kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên có cấu trúc đặc biệt phân tử globulin miễn dịch
Hình 46:Hình cấu trúc không gian protein kháng thể cách bắt Ag
Phản ứng in-vitro diễn kháng nguyên kháng thể hay gọi phương pháp huyết học (serological assays) sử dụng rộng rãi chẩn đoán bệnh
(4)- Lame x 8,5cm
- Bộ dụng cụ đục lỗ thạch - Bình tam giác
- Ống tiêm 1ml - Buồng aåm
- Agarose tinh khiết - Nước muối sinh lý - Dung dịch đệm PBS
- Dung dòch nhuộm màu Commassive brilliant blue - Dung dịch tẩy màu
- Vaccine DPT
- Huyết kháng độc tố bạch hầu
- Huyết chuẩn (đã biết trước nồng độ) - Giải độc tố bạch hầu
III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
(Phương pháp khuyếch tán hai chiều Outerlony đề xuất)
- Giải hấp phụ vaccine DPT: dùng vaccine DPT để giải hấp phụ độc tố bạch hầu khỏi gel aluminum dung dịch Na Citrat nồng độ 2% 24
- Tiến hành phản ứng nhận diện: dùng phản ứng khuyếch tán kép (double diffusion) Outerlony đề xuất (được gọi tắt phản ứng Outerlony)
- Các bước tiến hành sau:
+ Chưng thạch: Agarose tinh khiết 1% pha dung dịch đệm PBS có pH= 7,2
+ Đổ thạch lên lame: dùng lame nhỏ film 2,5x8cm, khoảng 3ml thạch/ lame
(5)Hình 47 : Cách bố trí lỗ thạch lame Tiến hành phản ứng Outerlony buồng ẩm, thực nhuộm ép tiêu
GỒM CÁC BƯỚC SAU:
Ngâm tiêu vào dung dịch sinh lý 12- 18 để loại bỏ yếu tố kết hợp khơng đặc hiệu
Nhuộm tiêu thuốc nhuộm commassive brilliant blue 10 phút
Rửa thuốc nhuộm cách ngâm tiêu vào dung dịch tẩy màu (chú ý trình ngâm phiến phải thay dung dịch tẩy màu thường xuyên) Cẩn thận tránh làm biến dạng phiến thạch bong agarose
Ép khô tiêu
IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý
Khơng để hóa chất dây vào tay, quần áo
Làm thí nghiệm, sinh viên phải mang găng tay
V. YÊU CẦU
- Nộp lại cho cán hướng dẫn mẫu kết Huyết kháng độc tố bạch hầu 50 Iu/ml
Vaccine DPT giải hấp phụ pha loãng ở nồng độ khác
(6)Baøi
PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN HUYẾT THANH TỪ MÁU NGƯỜI VAØ ĐỘNG VẬT
I. CƠ SỞ LÝ THUYẾT a Định nghĩa
Huyết huyết tương fibrinogen số yếu tố đông máu khác
b Vai trị huyết Công nghệ Sinh học động vật
Là thành phần quan trọng, thiếu môi trường nuôi cấy mô tế bào động vật Huyết có đặc điểm:
(1) Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào amino acid thiết yếu, tiền chất nucleic acid, nguyên tố vi lượng…
(2) Cung cấp nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào phân chia
(3) Chứa protein có khả làm bất hoạt trypsin (một enzyme sử dụng để tách tế bào động vật) tránh tượng enzyme gây tổn thương tế bào
(4) Cải thiện tính tan chất dinh dưỡng
(5) Cải thiện tính dính tế bào lên bề mặt bình ni nhờ yếu tố làm tăng độ dính tế bào lên giá đỡ
(6) Chống oxy hóa: huyết có tính kháng oxy mạnh ức chế độc tính oxy
Huyết nguyên liệu hàng đầu điều chế vaccin công nghiệp dược phẩm nói chung
c Nguyên tắc thu nhận huyết
(7)Các bước thiết yếu việc thu nhận huyết bao gồm: - Thu nhận máu từ thể
- Tạo cục máu đông bình chứa
- Tách huyết khỏi cục máu đông lọc ly tâm - Tinh sạch, bảo quản
II.NGUYÊN LIỆU, HÓA CHẤT, DỤNG CỤ 1 Hóa chất
- Hóa chất bảo quản: merthiolate cần sử dụng với nồng độ cho việc bổ sung chúng vào huyết không làm loãng huyết
- Mẫu máu (thu nhận từ thỏ)
2 Dụng cụ - thiết bị
a Dùng cho việc thu máu
Thỏ 2,5kg nặng (không cho ăn 12 trước để huyết thu lipid nhất)
Bàn cột thỏ, đoạn dây cột Dao cạo
Kéo, pince y tế Bông gòn + cồn 70o Bộ dụng cụ lấy máu:
+ Kim tiêm vơ trùng, 18G, 2in + Ống dẫn nhựa cao su
+ Ống nghiệm vơ trùng có sẵn nắp đậy
Đèn bóng trịn 15W (đặt bên tai thỏ, làm nóng để máu khơng đơng nhanh q trình lấy máu)
Băng keo y tế
Chai đựng máu có nắp đậy (đã hấp khử trùng) 10.Giá để ống nghiệm
11.Găng tay, trang quần áo bảo hộ 12.Đồ cấp cứu cá nhân
b Dùng cho việc thu nhận huyết
Tủ lạnh
(8) Máy li tâm ống nghiệm
Chai thủy tinh có nắp vặn để chứa huyết (vơ trùng) Phễu lọc + giấy lọc (vô trùng)
Milipore filter (màng lọc) 0,22-0,45m Thiết bị làm lạnh sâu (-800C -200C) Giấy khăn lau
III. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM 1 Phương pháp thu máu
a Cố định thỏ nằm úp bàn thao tác
b Cạo lơng tai thỏ để nhìn thấy rõ tĩnh mạch tai
c Để lấy máu dễ dàng, cần làm giãn nở mạch cách dùng đèn bóng trịn 15W làm ấm mặt tai thỏ
d Saùt trùng nơi định lấy máu tai thỏ
e Ghim kim tiêm vào tĩnh vạch theo chiều hướng vào gốc tai thỏ (ngược với chiều chảy máu)
f Giữ thỏ nằm yên thu máu vào ống nghiệm vô trùng gắn với kim tiêm qua ống dẫn
g Phương pháp thu đến 20ml máu thỏ (một con, lần) Nếu máu ngưng chảy, búng nhẹ vào tĩnh mạch tai để tiếp tục thu máu
h Sau thu đủ thể tích máu cần dùng, đặt gịn gạc lên vết cắt, dùng ngón ngón trỏ để ép chặt vết thương lại
i Dùng băng keo để giữ miếng gạc vị trí j Thu huyết theo quy trình bên k Xử lý bảo quản
2 Thu nhận huyết
a Để yên mẫu máu 1-2 nhiệt độ phịng nhằm tạo cục máu đơng Cẩn thận tách cục máu đông khỏi thành ống nghiệm thìa thép que gỗ Giữ ống nghiệm đựng máu tủ lạnh vòng 12-24 để cục máu đơng co lại
(9)rotor có bán kính 14cm) Cẩn thận lấy huyết cách gạn lấy phần dịch bên dùng pipette hút
c Thường huyết thu lần li tâm chứa bạch cầu, để loại tế bào này, cần li tâm lặp lại sản phẩm thu lần ly tâm thứ mô tả
e Khử trùng huyết thu phương pháp lọc
f Thêm chất bảo quản, sau bảo quản lạnh để giữ huyết nhiều ngày
g Để thuận lợi cho việc lưu giữ huyết sử dụng cần lượng nhỏ, huyết cần chia vào nhiều chai đựng có kích thước nhỏ Đây điều bắt buộc thực lưu trữ huyết trạng thái đông lạnh
IV. NHỮNG ĐIỂM CẦN LƯU Ý
Trong trình làm cần thật nhẹ nhàng, tránh gây lắc mạnh ống đựng máu khiến vỡ tế bào hồng cầu
Sau lấy máu (khơng q 10ml) phải khử trùng vết thương tai thỏ băng lại
Khử trùng toàn dụng cụ
Trước li tâm phải cân đối trọng cho ống nghiệm
V. YÊU CẦU
- Huyết có màu vàng nhạt đều, suốt, có hồng cầu vỡ - Khơng có lớp mỡ váng bên
- Khơng có lớp cặn đáy chai đựng
- Khơng có bọt khí vật lạ sợi huyết lơ lửng - Huyết thu đảm bảo vô trùng
+ Dịch ni cấy đục so với ban đầu: có diện vi sinh vật mẫu huyết
+ Dịch nuôi cấy không đổi so với ban đầu: khơng có diện vi sinh vật mẫu huyết
(10)Để lạnh 4oC, 12-24h
Lặp lại 2-3 lần
Ly tâm 4oC, 50.000g, 20 phút
Gạn lấy phần huyết cho vào chai đựng
Ly tâm 1000g, 30 phút, to=40oC Hút dịch
BẢO QUẢN Ở –20OC
Chia thành mẫu nhỏ Lọc vô trùng
Lọc qua giấy lọc nhám
QUY TRÌNH THU NHẬN HUYẾT THANH Để yên 1-2h, to phòng