Đang tải... (xem toàn văn)
Những đoạn DNA với những gene khác nhau, trong đó có trpA mà người ta muốn tạo dòng.. Làm thế nào mà người ta tìm ra được 1 gene hoặc xác định nó?..[r]
(1)TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ DỰ ÁN HỢP TÁC VIỆT NAM – HÀ LAN
BÀI GIẢNG
CÔNG NGHỆ SINH HỌC ỨNG DỤNG
Người biên soạn: TS Trần Thị Lệ
(2)BÀI I
CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP
I Khái niệm
Ý nghĩa tạo dòng DNA
Trước khoảng trăm năm Gregor Mendel đưa định
luật cho phép giải thích di truyền đặc điểm sinh học Cơ sở định luật đặc điểm di truyền sinh vật điều khiển yếu
tố, gọi gene, tồn tế bào Sự khám phá lại định luật
này Mendel vào năm 1900 khai sinh di truyền học, ngành khoa học
này có mục đich hiểu chất gene giải thích tác động
Công nghệ DNA tái tổ hợp tập hợp kỹ thuật phân tử để định vị,
phân lập, biến đổi nghiên cứu đoạn DNA Thuật ngữ tái tổ hợp dùng
thường xuyên mục tiêu phối hợp DNA từ hai nguồn xa Ví dụ:
các gene từ hai nguồn vi khuẩn khác liên kết lại, gene người đưa vào nhiễm sắc thể vi khuẩn Công nghệ DNA tái tổ hợp (thường gọi công nghệ di truyền) bao gồm mạng lưới kỹ
thuật phân tử dùng để phân tích, biến đổi tái tổ hợp trình tự
DNA
2 Tạo dịng DNA gì?
Về ngun tắc thí nghiệm tạo dịng DNA gồm bước sau đây:
1 Tinh DNA
2 Cắt phân tử DNA
3 Xác định độ lớn đoạn DNA
4 Đưa đoạn DNA vào vectơ tạo DNA tái tổ hợp Đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ
6 Xác định tế bào chủ chứa phân tử tái tổ hợp DNA
3 Tại tạo dòng DNA quan trọng vậy ? Ý nghĩa tạo dịng đối với
nghiên cứu và cơng nghệ sinh học
Từ hình 1.1 ta nhận thấy việc tạo dịng gene q trình tương đối đơn
giản Tại phương pháp sinh học lại có ý nghĩa lớn ? Câu trả
lời là: Trước hết việc tạo dòng gene tách gene khỏi tất gene khác dạng tinh khiết, mà gene thường tồn với tế bào
Sẽ hiểu xác quan sát thí nghiệm tạo dịng hình 1.2 Đoạn DNA tạo dịng thuộc hỗn hợp gồm nhiều đoạn khác nhau, mà đoạn mang gene phần gene Hỗn hợp tồn hệ
gene sinh vật (ví dụ hệ gene người) Sau đoạn đưa
vào phân tử vector phù hợp tạo nên tập hợp phân tử DNA tái tổ hợp,
trong phân tử mang gene cần tìm Thông thường tế bào chủ tiếp nhận phân tử DNA tái tổ hợp Như vậy, gene
tách từ nhiều gene khác người ta nghiên cứu đặc điểm xác
(3)gene vi khuẩn E.coli có khoảng 2000 gene, tìm gene điều
kiện có nhiều dịng khơng (Hình 1.3)?
Kỹ thuật gene mở loạt hội mà trước khơng thể có Vấn đề gene có kích thước q nhỏ có hàng ngàn gene tế
bào Thậm chí quan sát kính hiển vi mạnh nhất, DNA xuất
một sợi dây bé xíu, khơng thể thấy nucleotide khơng có dấu hiệu để
nhận biết chỗ bắt đầu kết thúc gene
Hình 1.1 Các bước tạo dòng DNA Thiết kế phân tử DNA tái tổ hợp
Vector
Đoạn DNA ngoại lai
Phân tử DNA tái tổ hợp
2 Đưa vào tế bào chủ Vi khuẩn
3 Nhân phân tử DNA tái tổ hợp
Vi khuẩn chứa phân tử DNA tái tổ hợp
4 Nhân tế bào chủ
5 Xuất dòng qua nhiều lần phân chia tế bào
(4)Hình 1.2 Bằng việc tạo dịng người ta tạo dạng đồng chứa
các đoạn DNA khác Vector
Các đoạn DNA
Các phân tử DNA tái tổ hợp
Mỗi phân tử chứa đoạn DNA khác
Đưa vào vi khuẩn
Nuôi môi trường agar
(5)Để minh họa vấn đề xem xét ví dụ đặc trưng di
truyền phân tử sau: Giả thiết muốn phân lập gene người
đưa vào vi khuẩn để sản xuất lượng lớn protein người Vấn đề phải tìm gene mong muốn Geneome đơn bội người chứa khoảng 3,3 tỷ
cặp base Giả sử gene mà muốn phân lập dài 3.000 bp Như gene đích
của chiếm phần triệu geneome, để tìm kiếm gene
một hệ gene đồ sộ khó khăn nhiều so với việc tìm kiếm kim
một đống cỏ khơ Và định vị gene, tách khỏi geneome nào? Khơng có forcep đủ nhỏ để gắp đoạn DNA, khơng có
một kéo học đủ nhỏ để cắt khỏi hệ gene đoạn gene riêng biệt
Hình 1.3 Vấn đề khó khăn chọn lọc
Một đoạn nhỏ từ geneome E coli
Gene muốn tạo dòng
Những đoạn DNA với gene khác nhau, có trpA mà người ta muốn tạo dịng
(6)1 Kỹ thuật Southern blot 90
2 Kỹ thuật Northern blot 106
3 Kỹ thuật Western blot 106
III Kỹ thuật xác định trình tự DNA 111
1 Phương pháp Sanger-Coulson (phương pháp enzyme hay dideoxy) 111
2 Phương pháp Maxam-Gilbert (Phương pháp hoá học) 113
3 Phân tích trình tự DNA dài .115
4 Các khả xác định trình tự DNA 117
5 Giải trình tự gene phương pháp tự động 117
IV Kỹ thuật PCR 120
1 Nguyên tắc 120
2 Kỹ thuật PCR 121
3 Phân tích sản phẩm PCR 126
4 Những khó khăn khiếm khuyết Taq-polymerase 129
5 Ứng dụng PCR .130
V Các kỹ thuật xác định tính đa hình DNA dựa PCR 133
1 Kỹ thuật RAPD: Đa hình đoạn DNA khuếch đại ngẫu nhiên 133
2 Kỹ thuật AFLP (amplified fragment length polymorphism) – Sự đa hình chiều dài phân đoạn DNA khuếch đại 134
3 Kỹ thuật SSR (simple sequence reppeats): Đa hình đoạn trình tự lặp lại đơn giản 135
VI Thư viện hệ gene (geneomic library) thư viện cDNA .136
1 Thư viện hệ gene ( geneomic library) .136
2 Thư viện cDNA .139
Bài CÔNG NGHỆ CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT 145
I Giới thiệu chung .145
II Phương pháp chuyển gene gián tiếp 146
1 Hệ thống Agrobacterium 146
2 Ti-plasmid nhân tố gây biến nạp tự nhiên thực vật .148
3 T-DNA trật tự biên 25 bp .149
4 Vùng vir 149
5 Quá trình chuyển T-DNA .150
6 Các dẫn xuất Ti-plasmid vector thực vật .151
7 Phương thức truyền gene vào thực vật nhờ Agrobacterium .153
III Phương pháp chuyển gene trực tiếp .156
1 Chuyển gene vào protoplast .156
2 Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào xung điện .157
3 Chuyển gene phương pháp bắn gene 157
4 Chuyển nạp DNA ngoại lai vào tế bào kỹ thuật vi tiêm (microinjection) 160
Bài ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ CHUYỂN GEN VÀO TẾ BÀO THỰC VẬT Chuyển gene kháng thuốc diệt cỏ 160
2 Chuyển gene kháng sâu bệnh 161
3 Chuyển gene gây chín chậm- DR (delayed ripening ) 162
4 Chuyển gene tạo hoa có màu sắc kiểu hoa 164
5 Chuyển gene sản xuất protein động vật người 167
6 Chuyển gene thay đổi protein 168
7 Chuyển gene tạo tính bất dục trồng 169
8 Chuyển gene giúp trồng chống điều kiện bất lợi 171
(7)I Giới thiệu chung 176
1 Sơ lược lịch sử phát triển 176
2 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật 177
3 Một số thuật ngữ khái niệm 177
4 Môi trường dinh dưỡng 179
5 pH môi trường 182
6 Vô trùng mẫu cấy 182
II Thụ phấn nuôi cấy phơi (hữu tính) in vitro 183
1 Tính bất hợp giao tử trước thụ tinh - thụ phấn in vitro 183
2 Tính bất hợp giao tử sau thụ tinh - Nuôi cấy phôi in vitro 183
3 Kỹ thuật ni cấy phơi hữu tính 184
4 Một số khó khăn ni cấy phơi hữu tính 184
III Nhân giống in vitro 185
1 Ý nghĩa việc nhân giống trồng phương pháp nuôi cấy mô tế bào 185
2 Các phương thức nhân giống in vitro 185
3 Các giai đoạn quy trình nhân giống vơ tính in vitro 189
5 Nhân giống in vitro đặc điểm không di truyền 192
IV Nuôi cấy bao phấn tạo giống trồng 192
1 Vấn đề đơn bội thực vật 192
2 Phương pháp tạo đơn bội in vitro 193
3 Ứng dụng đơn bội 195
4 Một số tồn nuôi cấy đơn bội 196
V Nuôi cấy tế bào trần & triển vọng ứng dụng 196
1 Kỹ thuật nuôi cấy tế bào trần 197
2 Dung hợp tế bào trần 198
3 Ứng dụng protoplast 199
VI Làm bệnh virus công tác phục tráng giống trồng 200
1 Nguyên lý làm virus trì tính bệnh 200
2 Các kỹ thuật làm virus in vitro 201
3 Kiểm tra, nhân nhanh trì tình trạng bệnh 202
VII Tạo đột biến chọn dòng tế bào thực vật 204
1 Khái niệm 204
2 Các nguyên nhân gây biến dị soma 204
3 Cách chọn dòng 206
4 Các hướng chọn lọc biến dị soma 206
5 Xác định biến dị nuôi cấy mô 208
6 Khả ứng dụng chọn lọc biến dị soma 208
VIII Công nghệ tế bào bảo quản nguồn gene 209
1 Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu 209