ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật-trường hợp: rầy nâu và bệnh đạo ôn trên cây lúa ( oryza sativa l.)

ứng dụng công nghệ sinh học trong bảo vệ thực vật-trường hợp: rầy nâu và bệnh đạo ôn trên cây lúa ( oryza sativa l.)

THÁCH THỨC

 Thay đổi khí hậu,

 Thiếu nước tưới cho cây trồng,

 Nguy cơ thiếu hụt lương thực trước tình trạng đất nông

nghiệp giảm và dân số tăng,

 Những stress phi sinh học ngày càng biểu hiện nghiêm

trọng, đặc biệt khô hạn

 Sâu bệnh hại ngày càng phát triển do cách thức ứng xử

của con người trong nông nghiệp thâm canh, theo xu

hướng kém bền vững, cân bằng sinh học trên đồng

ruộng bị phá vở;

 Vệ sinh an toàn thực phẩm đang ở mức báo động

Cây lúa: bệnh do vi nấm làm thiệt hại 40 triệu tấn / năm, côn trùng làm thiệt hại 26 triệu

NHỮNG NỘI DUNG CẦN ĐƯỢC ƯU TIÊN

pathogen, tạo tính kháng theo hướng bền vững

GIỐNG BIẾN ĐỔI GEN

GENOME HỌC VỀ CHỨC NĂNG & TÌM KIẾM GEN ĐÍCH

Ngân hàng gen

Kiểu hình

CÔNG CỤ NGHIÊN CỨU BỘ GEN

TIN SINH HỌC

Dòng đột biến Dòng dẫn xuất từ loài hoang dại Quần thể làm bản đồ di truyền Giống bản địa và hoang dại

DỮ LIỆU TRÌNH TỰ GEN

CÔNG NGHỆ CAO, TIN CẬY (e.g

microarray, gene chip, allele mining)

QTLs giả định Gen ứng cử viên Gen đích

TRÌNH TỰ GENOME CỦA 23 LOÀI CÂY ĐÃ ĐƯỢC ĐỌC ĐẾN 2008

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA

Khai thác nguồn tài nguyên di truyền đa dạng Tính trạng đơn gen

Tính trạng đa gen Khai thác hiện tượng tương đồng (synteny) MARKERS

Kiến trúc của SSR

Vùng kế cận đồng nhất

Số phân tử lập lại biến động cao trong từng cá thể

= Repeat ( e.g CA)

Repeat length: 2bp, Total # of motifs: 4

AT GT CT CG

Repeat length: 3bp, Total # of motifs: 10

ATT GTT CTT GAT CAT GGT CGT GCT CCT CGG

Repeat length: 4bp, Total # of motifs: 32

ATTT GTTT CTTT AATT GATT CATT AGTT GGTT CGTT ACTT GCTT CCTT GTAT CTAT GGAT CGAT GCAT CCAT CTGT GAGT CAGT GGGT CGGT GCGT CCGT GACT GGCT CGCT GCCT CCCT CGGG CCGG

Common repeat motifs

MICROSATELLITES

 Co-dominant (thông tin chính xác trong trường hợp dị hợp tử)

 Biến thiên lớn (quan trọng đối với loài có gene pools hẹp)

 Đang được áp dụng rộng rải

 Áp dụng tốt trong MAS, fingerprinting và MAB

Tìm kiếm SNP thông qua điện di mao dẫn

Ứng dụng SNPs để định vị gen gây bệnh

Tìm kiếm SNP thông qua micro sequencing, in silico

ƯU ĐIỂM & KHUYẾT ĐIỂM CỦA SNP

dị hợp tử

giải pháp cực tốt trong trường hợp xây dựng bản đồ di truyền)

 Khuyết điểm

marker đơn lẻ

Việc thiết lập SNP để bổ sung với marker SSR (microsatellite) được xem như hướng

ưu tiên cho các năm tới (công trình này được thực hiện thông qua hợp tác giữa IRRI,

(Targeted Local Lesion In Genome)

 Di truyền ngược (reverse genetics) xác

định chức năng gen trên cơ sở biến dị ở từng nucleotide

Thí dụ của Nhật Bản

NHIỀU BIẾN DỊ TẠI waxy LOCUS TRONG LÚA MÌ ĐƯỢC TÌM THẤY

NHỜ TILLING

TILLING là chiến lược nghiên cứu di truyền ngược, kết hợp mật

độ cao của các đột biến điểm do tác nhân hóa học và vật lý, cho phép thanh lọc nhanh để phát hiện ra những “lesions” bị kích hoạt trong chuỗi trình tự DNA xác định nào đó

DT cây trồng GM trên thế giới: 134 triệu ha, với 14 triệu nông dân tại

TÍNH KHÁNG SÂU ĐỤC

THÂN, SÂU CUỐN LÁ

 Gen chuyển nạp vào

chứng

AN TOÀN SINH HỌC

 Đánh giá mức rủi ro

 Cây GM không có marker, hoặc marker an toàn

nghiệm trên đường mannose

 OsDREB2A : xét nghiệm trên NaCl

 Cài đặt trình tự Cre-lox

Nilaparvata lugens

Trong lịch sử phát triển sản xuất lúa Việt Nam, rầy nâu là đối tượng gây hại ở mức độ dịch hại lớn (1978-79, 1985-86, 1990-91, 2006-08)

ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌNH

Phương pháp hộp mạ

ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌNH

DI TRUYỀN TÍNH KHÁNG

18 GEN KH ÁNG ĐƯỢC PHÂN LẬP (Yang và ctv 2004)

10 gen trội và 8 gen lặn

Gen lặn bph2 liên kết với Bph1, và bph4 liên kết với Bph3 (Kawaguchi và ctv

NGUỒN GEN KHÁNG RẦY NÂU TỪ LÚA HOANG

 Oryza australiensis: Bph10, Bph18(t)

 Oryza officinalis: bph11, bph12, Bph13, Bph14, Bph15

 Oryza latifolia: Bph12

1: IR31917-45-3-2

2: IR65482-4-136-2-2

3: Oryza australiensis (acc.100882)

M 1 2 3 4 5

550

500 300

Phân tích kiểu gen

1 2 3 4 5

6

M 1 2 3 4 5

500

300 250 200

Sản phẩm PCR với RG457L-L

được phân cắt bởi PvuI

Sản phẩm PCR với RG457L-L được phân cắt bởi

HinfI.

1: PTB33 2: TN1 3: IR65482-4-136 4: ASD7

5: OM1570

MAS

RM227 IR64 / HOA LÀI (F 2 )

IR64 / HOA LÀI (F 2 )

MAS

OM7347, OM6840

Kiểu hình Số cây Kiểu gen Bph-10 Mức độ

chính xác (%)

Giá trị ước đoán chính xác thông qua so sánh giữa kliểu gen và kiểu hình trên

quần thể con lai F 2 của IR64 X Hoa Lài với RM227

THIẾT LẬP BAC

Thiết lập BAC clone mang gen Bph

Thực hiện chromosome walking

Bắt đầu từ RG457

16 C 14

7 I 2

Các clone được phân cắt bởi HindIII

Bản đồ vật lý trên nhiễm sắc thể số 12 phục vụ cho việc dòng hoá gen kháng rầy nâu

RM21117.2

RM3339.6

AD17060052.3

RM16372.8

A191300111.5

RM29133.6

AD140300147.9

O051000154.4

RM27157.4

H030550172.7

OSR8190.7

K020500244.4

RM263O255.4

RM221267.3

J150700300

J151000306.2

RM250313.4

RM208336.9

A101000340.4

OSR26350

RM48351.3

CHROM.3

Dist(cM) MarkerRM360RM21814RM25124.6

Q12040056.6A10050067.1Q05075070.6B19095074

B19130074.8AF07160080.8

RM1686.4G06075091.1OSR31118.2RM168124.2RM55142.5O071300163.4Pgi1174.8RM227196RM148205.9D063000217.4

CHROM.4

Dist(cM) MarkerO0714000

O0708008.8

AB11070012.9

I19090018.5F05050025.2RM26138.7D15040057

H19075066.6AL08120084.6

RM252109.7RM255128.2AP130600135

A171300155.8Q050500160.7

CHROM.5

Dist(cM) MarkerOSR350

gl_19.1RM1319.8N10150044.5AP05090049.5

AP05150051.3

AP05170070.1

RM24975.5

CHROM.6

Dist(cM) MarkerOSR190

RM21713.2RM20417RM22520.5RM25332.2K9070043.4K09070049.2RM5054.6O05110057.1Est261Amp364.2Pgi280.8O02075093.8RM3101.2AG150410105.7G151100109.2A070200112.4H040800120.7D060950141

F050200152.1F050220154.8AB181300161.6RM30178AP201400198.8F040700207.3N061000209.8AJ130600215.5J011000222.2

CHROM.7

Dist(cM) MarkerI1823000

I1826007.4Q05070012.4J14110016.5F04095021.2AL08025026.6

G06080031

AL09170039.6

Q12010053.9RM1162.5OSR481.1RM1083.9N16080088.6N16070092.7RM18117.1RM234123.7Q051500143.3A110750155.4K181100174.1

RM248202

CHROM.8

Dist(cM) MarkerOSR300

RM3819.2RM2536.6AJ5070044.4AJ5055045.9Q12015056.4AZ0570058.5H14080060

AK10025062.6

AF15045070.6

G10080080.3D06045094.4OSR7128.9H120450144.6RM230155.8A121000173.7AP201200180

Amp2189.6

CHROM.9

Dist(cM) MarkerJ0109000

J0509005.2RM219O16.9O05060025.8D02080029.1AA03085032.6

RM25777.9RM24283.6AB18120089.6

AG080500101.5RM201107.8OSR29108.6OSR28108.6RM215117.9RM205130.4N101100132.3OSR12137

CHROM.10

Dist(cM) MarkerRM2390

A17060015.3J16150022.6H19050025.1D02090031.8RM21635.4RM24439.4G03030044.1N12065050.2RM22253.6AK10150058.9

I19080082.3AE1140086.1RM25896.5G061000134.8RM228137.6AH130350144.2AH130650160.4

CHROM.11

Dist(cM) MarkerAG1208500

AG12080014.3

AD8039632.6RM2038.7G06160061.2RM16778.1G02040084.7RM12095.4AA180450110.3RM202112AK100750125

A120550133.1L091100141

RM209148.1RM229153.2RM21159.1AJ11000171.2RM206176.5Q180750184.5RM254192.1AQ04193.3OSR6200.5RM123226.5RM224232.8

CHROM.12

Dist(cM) MarkerRM190RM24717.6OSR2029.7OSR3232.7AB17100040

A19080055.6RM26071Sdh78.9A190500106.6RM235119.1RM17124.5

118 SSR markers phủ trên 12 nhiễm sắc thể với chiều dài 1298,007 cM

RM227 và RM260 liên kết với Bph-10 với khoảng cách di

truyền 0,2 và 5,0cM, theo thứ tự

BẢN ĐỒ PHÂN GIẢI CAO Bph18(t)

Jena và ctv 2006

 186 SSR & STS markers (58 đa hình)

3.9

6.8

1.3 1.1 1.1

Markers kế cận & Vị trí giả định

S1555

2

Mark er RM46

3 RM6869

R10289

S RM3726, R2708 RM3331 RM7376

cM 3.9

6.8

1.3 1.1 1.1 4.5

Phân tích tương tác alen của 2 gen kháng rầy cùng

nằm trên vai dài NST12 (tương tác lặp đoạn)

Cross Combination Total R S (for 15:1) p

IR65482-7-216-1-2

X 527 480 47 4.39 0.05 - 0.01 IR65482-4-136-2-2

IR65482-4-136-2-2

X 239 230 9 2.52 0.05-0.01 IR65482-7-216-1-2

QiFa ZHANG et al 2008

Qbph1: Bph-4 và Qbph-2: Bph-15

Green Super Rice

BAC clones: dài 47 kb với

11 ORFs [phân tích Genscan]

GIỐNG LÚA KHÁNG RẦY NÂU

KẾT LUẬN

• Gen Bph-10, Bph-18 có thể kiểm soát tính kháng rầy

nâu đối với quần thể hiện nay ở ĐBSCL (sự pha trộn giữa loại hình BPH2 và BPH3)

• Sử dụng STS marker có thể giúp nhà chọn giống xác

định chính xác dòng con lai có chứa gen kháng ở mức

độ đồng hợp tử hay dị hợp tử

• Microsatellite marker được áp dụng trong fine mapping,

phủ trên nhiễm sắc thể 12 với chiều dài 1298,007cM, trong đó hai marker RM227 và RM260 được khuyến cáo có khả năng áp dụng MAS

KẾT LUẬN

• Các giống triển vọng: OM4498, OM5930, OM2395,

OM6055, OM5625, OM5936, OM5628, OM5799 ,

OM7347, OM6840

Khai thác gen m ới Bph-18 trên nguồn vật liệu

IR65482-7-216-1-2, nhờ marker RM6217, trên

NST số 12

BỆNH ĐẠO ÔN

Magnaporthe grisea

Có 50 major genes (Chen et al 2005), tất cả là gen trội chỉ trừ pi-21 (Jeung et al 2007)

NƯƠNG MẠ ĐẠO ÔN (SH Ou, IRRI)

ĐÁNH GIÁ KIỂU HÌNH

at locus RG64 in chromosome 6

Phân tích Southern Blot để kiểm chứng loci của marker RG64 được

phân cắt bởi XbaI

1: Sóc nâu 2: OM997 3-15: F 2

Phân tích Southern Blot để kiểm chứng loci của marker LPO111-112

OM1308 /

Tẻ tép

Sóc Nâu / OM997

GIỐNG LÚA KHÁNG ĐẠO ÔN

GIỐNG TRIỂN VỌNG KHÁNG ĐẠO ÔN:

HG1, OM5239, OM3536, OM5625, OM3401, AS996

Phản

ứng OMP 4 Nòi OMP 5 Nòi OMP 6 Nòi OMP 1 Nòi OMP 2 Nòi OMP 3 Nòi Kháng 20 65 64 12 49 14 Nhiễm 85 40 61 93 56 91

Giống lúa kháng bệnh đạo ôn không ổn định

[Phạm văn Dư và ctv 2009]

tính kháng trong vòng 2-3 vụ

đạo ôn ở ĐBSCL được ghi nhận, với 181 kiểu gen tương ứng với 181 haplotype nấm

nấm ở miền Bắc.

3 nhóm nấm gây bệnh hại chính; không có gen nào biểu thị hiệu lực hoàn toàn

đạo ôn tấn công thấp nhất

 Marker được áp dụng để tìm gen kháng bệnh đạo ôn: RG64, và LPO111-112; RM162 (NST 6); RM483 (NST 8); RM21 (NST 11)

 Gen Pi-2t liên kết với RG64, khoảng cách di truyền là 3,8cM trong Sóc Nâu và 1,0cM trong Tẻ Tép

khẳng định cơ sở phân tử và hoá sinh của gen kháng theo hướng bền vững

GIẢI PHÁP CỦA WANG VÀ LEUNG (1999)

sinh nòi (pathogen)

kéo dài giai đoạn sinh sản của pathogen

đề khẳng định cơ sở phân tử và hoá sinh của

gen kháng theo hướng bền vững

 Phân tích di truyền của pathogen: xác định gen của ký sinh là tín hiệu cơ sở; xác định yếu tố

phát sinh bệnh là công cụ tìm gen kháng

Genome của Magnaporthe grisea

Độ lớn: 40 Mb

Số NST: 7

Số gen: 11.109 Phân bổ:1 gen / 3.5 kb Gen đã giải mã: 45%

Signalp-2.0 1.258 protein

chưa được biết gắn với khu vực chitin

Synteny: không

DNA lập lại không phân

bố ngẫu nhiên, phân bố theo nhóm, có tính bảo thủ

DI TRUYỀN CỦA NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN

(IRBGC 1998, Ma et al 2006, Chen et al 2007)

Gen định vị telomere sẽ rất khó tìm marker đồng

phân ly Gen AvrPit liên kết với m355-366 (2,3

cM) Gen ArvPia liên kết với S487 (3,5 cM)

Bản đồ liên kết gen

Motif NBS-LRR

IR65482-4-136-2-2

RM527-RM3330

Pi-37, NST 1 Genetics 177: 1871-1880 (2007)

4

candidates

Gen chức năng, mã hoá 1290 peptide NBS-LRR

NIPPONBARE

 Chuỗi trình tự aa của sản phẩm gen Pi37 Ba motifs có tính bảo thủ tạo nên NBS region được gạch dưới (Lin et al 2007)

 Gen Pi-37 là đại diện đầu tiên của motif NBS-LRR không có intron

 Gen Pi-37 có chuỗi trình tự tương đồng với gen rp1 của bắp, là kết quả tiến hoá từ

 Pi-36 định vị trên nhiễm sắc thể số 8 (silico map-based cloning)

 Pi-36 mã hoá 1056 amino acids, có bổ sung Asp và Ser tại vị trí 590 để tạo

nên kiểu hình kháng, thuộc motif CC-NBS-LRR

 Pi-36 có chuỗi mật mã dài 3171-bp, bị xen đoạn bởi 4 introns

Liu et al 2007 GENETICS 176: 2541-2549

Marker CRG4

+ HaeIII

BAC clone được phân cắt bởi

HindIII

Sản phẩm PCR của BAC clone tại locus LPO111-112, với 7 clone

1: 23D 09 2: 23D 06 3: 23H 03 4: 23I 13

5: 23D 05 6: 23J 13 7: 23H 09

Pi2

HUANG et al 2008

Genetics 179: 1257-1538

Pi-ta và Pi-ta2 liên kết rất chặt như 2 alen trên 1 locus (tương tác allelic)

Chúng định vị trên centromere / NST 12, thể hiện rất thấp khả năng tái tổ hợp

Thể hiện tần suất cao repeat sequence, khó tiếp cận bằng chromosome walking so với

đánh giá kiểu gen theo graphic

PI - ta2

Hình thành một BAC contig đối với gen Pi-ta2, điều khiển tính kháng bệnh đạo

ôn của cây lúa Vùng giới hạn của Pi-ta2 và Pi-ta đã được đánh dấu Ở dưới

cùng là sự chồng lấp của những BAC clone Sự tương ứng giữa DNA marker (probe) với clone cộng tính được biểu thị bằng vạch chấm chấm (Nakamura và

NHIỄM SẮC THỂ 12 VÙNG TÂM ĐỘNG

MIMIC MUTANTS làm gia tăng sự thể hiện gen phản ứng tự vệ PR-10a,

TÍNH KHÁNG CHẤT LƯỢNG VÀ SỐ LƯỢNG

 Tính kháng về chất lượng: khả năng ngăn cản mạnh mẽ sự phát sinh các nòi chuyên tính của ký sinh, ngăn cản sự sinh sản

của ký sinh,

 Tính kháng số lượng: khả năng làm suy

giảm sự kéo dài giai đoạn sinh sản của ký sinh, theo khái niệm tương tác cơ bản

Phân tích QTL meta và genomics của tính kháng đạo

ôn (Leach et al 2009)

Tính kháng số lượng

(Shiping Wang et al 2009)

 QTLs kháng bệnh là

nguồn di truyền quý giá

cho cải tiến giống lúa

trong cây lúa có ảnh

hưởng nhỏ, mỗi QTL giải

thích ít hơn 10% biến thiên

kiểu hình

 Rất khó thực hiện kỹ thuật

fine mapping đối với các

minor QTLs

1 NGÂN HÀNG GEN VIỆT NAM RẤT THIẾU

NGUỒN CUNG CẤP GEN KHÁNG RẦY NÂU, KHÔNG CÓ GEN KHÁNG SÂU ĐỤC THÂN, SÂU CUỐN LÁ; NHƯNG CÓ RẤT NHIỀU

hợp genomics và chuyển nạp gen

2 KHAI THÁC HIỆU QUẢ NGUỒN GEN TỪ LÚA HOANG

3 Chú ý tính kháng số lượng theo hướng kháng bền vững

4 GIẢI PHÁP BAO GIỜ CŨNG PHẢI MANG

TÍNH TỔNG HỢP: giống kháng, ký sinh, môi trường

CÁM ƠN