Khảo sát nguồn gen duy trì và phục hồi hữu dục một số dạng CMS ngô bằng chỉ thị phân tử DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        NGUYỄN XUÂN CAO KHẢO SÁT NGUỒN GEN DUY TRÌ VÀ PHỤC HỒI HỮU DỤC MỘT SỐ DẠNG CMS NGÔ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, NĂM 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        NGUYỄN XUÂN CAO KHẢO SÁT NGUỒN GEN DUY TRÌ VÀ PHỤC HỒI HỮU DỤC MỘT SỐ DẠNG CMS NGÔ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mã số : 60.42.02.01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI, NĂM 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Nguyễn Xuân Cao Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới: PGS.TS. Phan Hữu Tôn, Trưởng bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học Ứng dụng, khoa CNSH, người thầy ñã tận tình giúp ñỡ, hướng dẫn, tạo mọi ñiều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và trong quá trình hoàn chỉnh luận văn. Tập thể các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học, ñặc biệt là các thầy cô giáo thuộc bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học Ứng dụng ñã nhiệt tình giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia ñình, bạn bè và ñồng nghiệp ñã giúp ñỡ, ñộng viên tôi trong suốt thời gian tôi làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 12 tháng 06 năm 2014 Tác giả luận văn Nguyễn Xuân Cao Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii MỤC LỤC LỜI CAM ðOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT viii 1. MỞ ðẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài 1 1.2. Mục ñích yêu cầu của ñề tài 2 1.2.1. Mục ñích 2 1.2.2. Yêu cầu 2 1.3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài 2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Giới thiệu chung về ngô 3 2.2. Tình hình nghiên cứu và sử dụng ngô lai trên thế giới và Việt Nam 3 2.2.1. Tình hình sản xuất ngô lai thế giới 3 2.2.2. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam 7 2.3. Hiện tượng ưu thế lai 9 2.3.1. Khái niệm 9 2.3.2. Cơ sở khoa học của ưu thế lai 9 2.4. Hệ thống ngô lai ba dòng 10 2.4.1. Cơ chế bất dục ñực tế bào chất 10 2.4.2. Tầm quan trọng của bất dục ñực tế bào chất 13 2.5. Hệ thống ngô lai ba dòng sử dụng bất ñực tế bào chất 14 2.5.1. Khái niệm về hệ thống ngô lai ba dòng 14 2.5.2. Dòng bất dục ñực tế bào chất (CMS) 14 2.5.3. Dòng duy trì bất dục 17 2.5.4. Dòng phục hồi hữu dục 18 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.6. Tình hình nghiên cứu và sử dụng giống ngô lai sử dụng bất dục ñực tế bào chất trên thế giới và Việt Nam 20 2.7. Tình hình nguyên cứu, ứng dụng và ưu ñiểm của chỉ thị phân tử trong chọn giống ngô lai 21 2.7.1. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống ngô lai ba dòng có sử dụng bất dục tế bào chất 21 2.7.2. Ưu ñiểm của việc sử dụng chỉ thị phân tử 22 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 3.1. Vật liệu nghiên cứu, thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu 24 3.1.1. Vật liệu nghiên cứu 24 3.1.2. Thời gian nghiên cứu: Tháng 8/2013 ñến tháng 5/2014 24 3.1.3. ðịa ñiểm nghiên cứu 24 3.2. Nội dung nghiên cứu 25 3.3. Phương pháp nghiên cứu 25 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 25 3.3.2. Theo dõi một số chỉ tiêu nông sinh học của các dòng CMS, các dòng ngô tự phối và F1 của chúng 26 3.3.3. Lai cưỡng bức các dòng CMS với các dòng ngô tự phối 27 3.3.4. ðánh giá khả năng bất dục, hữu dục các tổ hợp lai F1 27 3.3.5. Xác ñịnh khả năng chứa gen duy trì và phục hồi hữu dục cho các dạng CMS của các dòng ngô tự phối bằng các chỉ thị phân tử DNA 28 3.3.6. Phương pháp ñiện di phát hiện sản phẩm PCR 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 4.1. Kiểm tra dạng CMS bằng chỉ thị phân tử DNA 33 4.2. Lai thử tạo vật liệu khởi ñầu 34 4.3. Xác ñịnh dòng duy trì và phục hồi hữu dục qua ñánh giá khả năng bất dục, hữu dục các tổ hợp lai F1 35 4.3.1. ðánh giá khả năng bất dục, hữu dục của hạt phấn bằng cách nhuộm I-KI 1% 35 4.3.2. Xác ñịnh dòng duy trì và phục hồi hữu dục bằng phương pháp quan sát sự nảy mầm hạt phấn trên môi trường thạch 38 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v 4.4. Một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của các dòng CMS, duy trì, phục hồi và các tổ hợp lai F1 hữu dục 42 4.4.1. Một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của dòng CMS 42 4.4.2. Một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của dòng duy trì 44 4.4.3. Một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của dòng phục hồi 47 4.4.4. Một số ñặc ñiểm nông sinh học, năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai F1 hữu dục 51 4.5. Kết quả tiến hành phản ứng PCR 54 4.5.1. Kiểm tra ñộ nguyên vẹn và tinh sạch của DNA tổng số 54 4.5.2. Kết quả xác ñịnh gen rf3 duy trì cho dạng CMS-S bằng cặp mồi CAPSE3P1 và sử dụng ezyme cắt giới hạn MseI 55 4.5.3. Kết quả xác ñịnh gen rf4 duy trì cho dạng CMS-C bằng cặp mồi b0329-13.1 55 4.5.4. Tiến hành phản ứng PCR bằng cặp mồi 76755P2 phát hiện gen Rf3 phục hồi hữu dục cho dạng CMS-S 56 4.5.5. Tiến hành phản ứng PCR bằng mồi b0440-16.2 nhằm phát hiện gen Rf4 phục hồi hữu dục hạt phấn cho dạng CMS-C 57 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 62 5.1. Kết luận 62 5.2. ðề nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 PHỤ LỤC 67 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Diện tích, năng suất, sản lượng ngô thế giới giai ñoạn 2004-2008 4 Bảng 2.2. Diện tích, năng suất và sản lượng ngô một số nước trên thế giới giai ñoạn 2006-2009 5 Bảng 2.3. Tình hình sản xuất ngô Việt Nam giai ñoạn 2000-2013 và dự ñoán 2014 8 Bảng 2.4. Sự tương tác giữa tế bào chất và nhân 12 Bảng 4.1. Các tổ hợp F1 bất dục hạt phấn khi nhuộm I-KI 1% 36 Bảng 4.2. Các tổ hợp F1 hữu dục hạt phấn khi nhuộm I-KI 1% 37 Bảng 4.3. Kết quả nảy mầm hạt phấn của các tổ hợp F1 bất dục hạt phấn khi nuôi cấy trên môi trường thạch 40 Bảng 4.4. Kết quả nảy mầm hạt phấn của các tổ hợp F1 hữu dục hạt phấn nuôi cấy trên môi trường thạch 41 Bảng 4.5. Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng CMS 43 Bảng 4.6. Năng suất và yếu tố cấu thành năng suất của dòng CMS 44 Bảng 4.7. Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các dòng duy trì 45 Bảng 4.8. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng duy trì 46 Bảng 4.9. Một số ñặc ñiểm nông sinh học của dòng phục hồi 48 Bảng 4.10. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của dòng phục hồi 50 Bảng 4.11. Một số ñặc ñiểm nông sinh học của các tổ hợp F1 hữu dục 51 Bảng 4.12. Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các tổ hợp lai F1 53 Bảng 4.13. Kết quả phát hiện gen duy trì rf3, rf4 và gen phục hồi Rf3, Rf4 bằng PCR 59 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii DANH MỤC HÌNH Hình 4.1. Kích thước ñoạn băng DNA khi nhân bằng các mồi phát hiện dạng CMS 33 Hình 4.2. Soi hạt phấn dưới kính hiển vi khi nhuộm với I-KI 1% 35 Hình 4.3. Sự phát triển của hạt phấn khi nuôi cấy trên môi trường thạch 39 Hình 4.4. Dạng cây và bắp của dòng CMS 43 Hình 4.5. Kết quả ñiện di kiểm tra ñộ nguyên vẹn và tinh sạch của 1 số mẫu DNA 54 Hình 4.6. Ảnh ñiện ñi sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi CAPSE3P1 sau khi cắt bằng enzyme MseI 55 Hình 4.7. Ảnh ñiện ñi sản phẩm PCR phát hiện gen rf4 sử dụng cặp mồi b0329-13.1 56 Hình 4.8. Ảnh ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi 76755p2 phát hiện gen Rf3 (M: 1kb) 56 Hình 4.9. Ảnh ñiện ñi sản phẩm cắt với enzyme MseI phát hiện gen Rf3 57 Hình 4.10. Ảnh ñiện di sản phẩm PCR sử dụng cặp mồi b0440-16.2 phát hiện gen Rf4 phục hồi cho dạng CMS-C 58 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CMS Cytoplasmic Male Sterility CMS- C Cytoplasmic Male Sterility Charrua CMS-S Cytoplasmic Male Sterility Texas CMS- N Cytoplasmic Male Sterility Normal CS Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxyribonucleotit triphotphat EDTA Ethylene Diamin Tetraaxetic acid Kb Kilobase M Marker PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi Polymerase) TE Tris – EDTA Tris Trioxymetylaminometan TAE Tris Hcl – Acetate – EDTA [...]... kh năng n y m m và th tinh Hi n nay ngư i ta ñã xác ñ nh ñư c 4 d ng b t d c ñ c t bào ch t ngô là: CMS- T, CMS- S, CMS- C, CMS- O M i d ng gen gây b t d c ñ c CMS có gen ho c nhóm gen duy trì và ph c h i riêng Vi c tìm ra gi ng ngô nào có ch a gen duy trì ho c ph c h i cho m i d ng này là vi c làm c n thi t ñ t o dòng CMS m i ph c v ch n t o gi ng ngô lai 3 dòng B t d c ñ c t bào ch t CMS không có kh... dòng CMS, các dòng ngô t ph i và F1 h u d c c a chúng - Chi t tách DNA và phát hi n gen duy trì và ph c h i trong t p ñoàn các dòng ngô t ph i b ng ch th phân t DNA 1.3 Ý nghĩa khoa h c và th c ti n c a ñ tài - Vi c tìm ra ñư c các dòng duy trì và ph c h i h u d c có ý nghĩa l n trong vi c ch n t o gi ng ngô lai ba dòng m i K t qu nghiên c u c a ñ tài s góp ph n ñ nh hư ng cho vi c t o ra các dòng CMS. .. phát hi n d ng CMS thì các kích thư c các d ng CMS- C, CMS- T và CMS- S s nhân lên các ño n DNA có kích thư c 398bp, 440bp và7 99 bp + Marker phân t như RFLPs và markers PCR ñư c thi t k vào các ñ c tính ñ c ñáo c a khu v c mtDNA có th ñư c s d ng cho phân bi t ngô lo i CMS chính, nhanh hơn so v i các th t c ki m tra, qua truy n th ng 2.7.2 Ưu ñi m c a vi c s d ng ch th phân t - Ch th phân t và b n ñ di truy... ngô lai ba dòng m i Dư i s hư ng d n c a PGS.TS Phan H u Tôn, chúng tôi ti n hành ñ tài: “Kh o sát ngu n gen duy trì và ph c h i h u d c m t s d ng CMS ngô b ng ch th phân t DNA H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông nghi p Page 1 1.2 M c ñích yêu c u c a ñ tài 1.2.1 M c ñích Tìm ra ñư c m t s dòng ngô t ph i có ch a gen duy trì b t d c, gen ph c h i h u d c cho m t s d ng CMS. .. th c ki u gen c a dòng duy trì là N.rfrf Khi lai dòng này v i dòng b t d c S.rfrf s thu ñư c dòng CMS gi ng h t dòng ban ñ u ð ng th i, v ki u gen thì gen nhân c a dòng CMS và dòng duy trì hoàn toàn gi ng nhau Do v y, bi u hi n tính tr ng hình thái c a dòng CMS nh n ñư c sau khi th ph n c a dòng B s gi ng h t dòng CMS ban ñ u và không x y ra s phân ly các tính tr ng dòng CMS Như v y, dòng B và dòng A... trong các th h con lai F1 c a CMS có th là h u d c ho c b t d c S n xu t h t gi ng lai ñòi h i CMS, duy trì và ph c h i dòng b m , CMS mang ki u gen rfrf và m t t bào ch t CMS Cây có kh năng duy trì cho dòng CMS thì có ki u S.rfrf và N- t bào ch t bình thư ng, còn cây có kh năng ph c h i thì ph i ch a ki u gen RfRf Trong trư ng h p c a ngô, chi phí s n xu t gi ng b ng CMS có th ñư c gi m kho ng 2%... CMS- S ñó là gen Rf3, Rf9 c D ng CMS- C So v i s ph c h i c a CMS- C và CMS- S, vi c ph c h i c a CMS- C là ph c t p hơn và chưa ñư c bi t Có b ng ch ng c a ít nh t ba gen ph c h i gen nhân, ñư c g i là Rf4, Rf5 và Rf6, mà có th tương tác m t cách b sung H th ng 3 gen này có th ñư c nhân ñôi nh ng nơi khác nhau trong h gen, Rf4 và Rf5 ñã ñư c n m trên NST 8 và 5 Tương tác b sung gi a các y u t b và m có vai... cho các d ng CMS Trong ñó gen Rf1, Rf2, Rf8, Rf* ph c h i cho d ng CMS- T; gen Rf3, Rf9 ph c h i cho d ng CMS- S và gen Rf4, Rf5, Rf6 ph c h i cho d ng CMS- C; d ng CMS- O hi n nay v n chưa phát hi n ñư c xác ñ nh Ngày nay, ch th phân t ñư c s d ng r ng rãi như m t công c h u hi u trong nghiên c u ch n t o các gi ng m i Vi c phát hi n ra các dòng duy trì và ph c h i h u d c cho m t s d ng CMS có ý nghĩa... n t o gi ng ngô lai ba dòng các nhà ch n t o gi ng thư ng quan tâm ñ n b t d c ñ c d ng CMS- T, CMS- S, CMS- C (Liu et al., 2002) do có tính b t d c n ñ nh Hi n nay, có b n d ng b t d c ñ c t bào ch t là CMS- T (Taxas), CMS- C (Charrua), CMS- S (USDA), CMS- O (Parvez A et al., 2007) Tương ng m i dòng b t d c ñ c ñ u có gen duy trì và ph c h i tương ng Hi n nay, ngư i ta ñã phát hi n ñư c các gen ph c h i... t o ngô lai ba dòng H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông nghi p Page 23 3 V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U 3.1 V t li u nghiên c u, th i gian và ñ a ñi m nghiên c u 3.1.1 V t li u nghiên c u V t li u nghiên c u bao g m: - Các dòng CMS ngô: C437JA, C836A, C437R và C437K Hai dòng duy trì cho C437JA và C836A l n lư t là C437JB và C836B làm ñ i ch ng ñ phát hi n gen duy trì - . Tìm ra ñược một số dòng ngô tự phối có chứa gen duy trì bất dục, gen phục hồi hữu dục cho một số dạng CMS. ðánh giá một sổ tổ hợp lai F1 hữu dục giữa các dòng phục hồi và một số dòng CMS. 1.2.2 GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        NGUYỄN XUÂN CAO KHẢO SÁT NGUỒN GEN DUY TRÌ VÀ PHỤC HỒI HỮU DỤC MỘT SỐ DẠNG CMS NGÔ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA . GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI        NGUYỄN XUÂN CAO KHẢO SÁT NGUỒN GEN DUY TRÌ VÀ PHỤC HỒI HỮU DỤC MỘT SỐ DẠNG CMS NGÔ BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA