Khảo sát nguồn gen tập đoàn giống khoai tây kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          LÊ MAI PHƯƠNG KHẢO SÁT NGUỒN GEN TẬP ðOÀN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI          LÊ MAI PHƯƠNG KHẢO SÁT NGUỒN GEN TẬP ðOÀN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Mà SỐ: 60.42.02.01 NGUỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : PGS.TS PHAN HỮU TÔN HÀ NỘI – 2014 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan, kết quả và số liệu nghiên cứu trình bày trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam ñoan các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả Lê Mai Phương Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi ñã nhận ñược sự quan tâm, giúp ñỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng như những người thân trong gia ñình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phan Hữu Tôn, người ñã tận tình hướng dẫn, ñịnh hướng, giúp ñỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Phan Hữu Hiển, ThS. Nguyễn Văn Hùng và toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Sinh học phân tử và công nghệ sinh học ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã rất nhiệt tình giúp ñỡ, tạo ñiều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực tập tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ðH Nông nghiệp Hà Nội ñã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết ñể có thể thực hiện và hoàn thành luận văn. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia ñình, anh em, bạn bè ñã ñộng viên, giúp ñỡ và tạo ñiều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Hà Nội, ngày 14 tháng 05 năm 2014 Học viên thực hiện Lê Mai Phương Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iii MỤC LỤC Lời cam ñoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục bảng v Danh mục hình vi PHẦN I MỞ ðẦU 1 1.1 ðặt vấn ñề 1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu của ñề tài 2 PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 Giới thiệu chung về cây khoai tây 4 2.1.1 Nguồn gốc và phân loại cây khoai tây 4 2.1.2 ðặc tính thực vật học của cây khoai tây 4 2.1.3 ðặc ñiểm sinh học của cây khoai tây 5 2.1.4 Một số yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của cây khoai tây 6 2.1.5 Nhu cầu dinh dưỡng của cây khoai tây 6 2.1.6 Thời vụ trồng cây khoai tây ở Việt Nam 7 2.2 Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới 8 2.3 Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam 10 2.4 Bệnh sương mai trên cây khoai tây 12 2.5 Cơ chế kháng của cây với nấm Phytophthora infestans 20 2.6 Một số nghiên cứu về khoai tây 20 2.6.1 Một số nghiên cứu về sâu bệnh hại khoai tây 20 2.6.2 Các nghiên cứu tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai 23 2.7 Ứng dụng chỉ thị DNA phân tử trong nghiên cứu các gen kháng bệnh sương mai 24 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp iv PHẦN III VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 3.1 Vật liệu nghiên cứu 27 3.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 28 3.3 Nội dung nghiên cứu 28 3.4 Phương pháp nghiên cứu 29 3.4.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài ñồng ruộng 29 3.4.2 Phương pháp ñánh giá một số ñặc ñiểm nông sinh học của các mẫu khoai tây 29 3.4.3 Phương pháp PCR phát hiện gen kháng R1, R3a 34 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 4.1 Khảo sát ñặc ñiểm nông sinh học một số mẫu khoai tây vụ ñông 2013 37 4.1.1 Thời gian sinh trưởng 37 4.1.2 ðặc ñiểm thân củ 41 4.1.3 ðặc ñiểm sự sinh trưởng phát triển của cây 50 4.1.4 ðánh giá năng suất 57 4.2 Kết quả PCR phát hiện gen kháng sương mai 63 4.2.1 Kết quả PCR phát hiện gen R1 63 4.2.2 Kết quả PCR phát hiện gen R3a 64 4.3 ðánh giá mức ñộ nhiễm bệnh ngoài ñồng ruộng 65 4.3.1 So sánh kết quả PCR với mức ñộ nhiễm bệnh sương mai trên ñồng ruộng 66 4.3.2 ðánh giá mức ñộ nhiễm một số bệnh ngoài ñồng ruộng 69 4.4 Giới thiệu một số mẫu giống khoai tây triển vọng 75 PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 77 5.1 Kết luận 77 5.2 Kiến nghị 77 TÀI LIỆU THAM KHẢO 78 PHỤ LỤC 84 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp v DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Danh sách các mẫu giống khoai tây theo dõi 27 Bảng 2: Một số chỉ tiêu theo dõi ñặc ñiểm nông sinh học 30 Bảng 3. Các chỉ thị phân tử DNA sử dụng ñể phát hiện gen R1, R3a kháng sương mai 36 Bảng 4. Bảng thời gian qua các giai ñoạn sinh trưởng 38 Bảng 5. ðặc ñiểm thân của các mẫu giống khoai tây 41 Bảng 6. ðặc ñiểm lá của các mẫu giống khoai tây 47 Bảng 7: ðặc ñiểm sinh trưởng của cây 51 Bảng 8: Bảng số liệu về năng suất của các mẫu giống khoai tây 57 Bảng 9. So sánh kết quả PCR với mức ñộ nhiễm bệnh sương mai trên ñồng ruộng 66 Bảng 10. Bảng theo dõi một số bệnh trên ñồng ruộng 69 Bảng 11. ðặc ñiểm nông sinh học của các giống khoai tây triển vọng 76 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp vi DANH MỤC HÌNH Hình 1: Triệu chứng sương mai 14 Hình 2. a) Bào tử phân sinh của nấm Phytophthora infestant , b) Bào tử phân sinh nảy mầm trực tiếp tạo ra bào tử ñộng 15 Hình 3. Chu kì phát triển của nấm Phytophthora infestans 17 Hình 4. Các chỉ thị phân tử liên kết với gen kháng sương mai 26 Hình 5: Biểu ñồ về sự khác biệt về số hoa của các mẫu giống 56 Hình 6: Biểu ñồ về sự khác biệt về số củ trung bình giữa các mẫu giống 62 Hình 7: Biểu ñồ về sự khác biệt năng suất các mẫu giống khoai tây 63 Hình 8. Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen R1 64 Hình 9. Ảnh ñiện di sản phẩm PCR phát hiện gen R3a 65 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 1 PHẦN I. MỞ ðẦU 1.1. ðặt vấn ñề Khoai tây có tên khoa học là Solanum tuberosum, thuộc họ Solanaceae, có nguồn gốc từ vùng núi Andes của Bolivia và Peru, là cây trồng ngắn ngày, chiếm một vị trí quan trọng trong các cây lương thực, thực phẩm phục vụ cho con người. Hiện nay, khoai tây là loài cây trồng lấy củ rộng rãi nhất thế giới, ñược trồng phổ biến thứ tư về mặt sản lượng lương thực sau lúa, lúa mì và ngô. Chúng có ñặc ñiểm rất dễ trồng, cho thu hoạch nhanh và thích ứng với các ñiều kiện môi trường khác nhau (International Year of the Potato. 2008; Jeff Chapman và cộng sự, 2011). Tuy nhiên, khoai tây có thể bị một số bệnh ảnh hưởng ñến năng suất và chất lượng củ. Bệnh hại trên khoai tây rất ña dạng về thành phần và nguyên nhân gây bệnh như bệnh sương mai, bệnh héo vàng, bệnh ñốm lá, bệnh héo rũ vi khuẩn, bệnh xoăn lá do virus….Trong ñó bệnh sương mai do nấm Phytophthora infestans gây ra là bệnh hại nghiêm trọng bậc nhất, gây thiệt hại 16% năng suất trên toàn thế giới (Haverkort A và cộng sự, 2009). Bệnh có thể lây nhiễm toàn bộ cây, bao gồm thân, lá và củ (Fry W, 2008). ðể ñối phó với dịch bệnh, tạo sự phát triển bền vững và giảm lượng thuốc bảo vệ thực vật thì việc tạo ra giống khoai tây mới với mức kháng cao với Phytophthora infestans ñược coi là chiến lược bền vững cho việc trồng khoai tây trong tương lai. Nhờ sự phát triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, công nghệ chọn tạo giống nhờ chỉ thị phân tử ra ñời rút ngắn thời gian chọn tạo giống, ñảm bảo ñộ chính xác và quy tụ ñược nhiều gen mục tiêu vào một giống mà phương pháp chọn giống truyền thống rất khó hoặc không thể thực hiện ñược. ðể tạo ñược giống khoai tây mới thì việc ñầu tiên là phải có nguồn gen kháng và chỉ thị phân tử liên kết với các gen kháng ñó, sau ñó ñánh giá và xác ñịnh khả Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 2 năng kháng bệnh sương mai của các giống ñể sử dụng trong công tác lai tạo giống sau này. Gen kháng bệnh sương mai ñã ñược lai tạo từ các loài dại S. demissum, S. stoloniferum và S. tuberosum andigena, S. phureja là các loài khoai tây trồng phổ biến ở khắp nơi trên thế giới (Bradshaw và cộng sự, 2006). Loài S. demissum của Mexico mang gen kháng bệnh sương mai là nguồn cung cấp 11 gen trội R (R1-R11) ñã ñược lai với S. tuberosum trong những năm 1950 và 1960 ñể tạo giống kháng (Bradshaw và Ramsay, 2005). Gen R1, R3a là gen kháng chủng ñặc hiệu với Phytophthora infestans ñã ñược lai tạo vào giống khoai tây truyền thống (Umaerus và Umaerous, 1994). Bên cạnh ñó, người ta ñã xác ñịnh ñược một hệ thống các marker phân tử DNA liên kết với các gen kháng ñã ñược phát triển và hỗ trợ ñắc lực cho chương trình chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai. Các chỉ thị phân tử DNA dựa trên PCR cho gen R1 là R1F/R(76-2sf2/76-2SR)), gen R3a là R3-1380 ñã ñược nhiều nhà chọn giống trên thế giới sử dụng ñể chọn tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai. Hiện nay Trung tâm bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng ñã thu thập ñược một tập ñoàn các giống khoai tây. ðây là một nguồn gen ña dạng cho việc lai tạo giống khoai tây kháng bệnh sương mai. Vì vậy ñể có ñịnh hướng sử dụng, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS. Phan Hữu Tôn, chúng tôi tiến hành ñề tài: “Khảo sát nguồn gen tập ñoàn giống khoai tây kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử DNA” 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của ñề tài 1.2.1. Mục tiêu  Xác ñịnh ñược các mẫu giống khoai tây có ñặc ñiểm sinh trưởng tốt và kháng bệnh sương mai.  Xác ñịnh mẫu giống khoai tây có mang gen kháng sương mai bằng chỉ [...]... t cây khoai tây 2.4 B nh sương mai trên cây khoai tây B nh sương mai khoai tây do n m Phytophthora infestans là m t trong nh ng b nh ñư c nghiên c u nhi u nh t, l ch s nghiên c u lâu dài nh t, tuy v y ñây v n là m t trong nh ng b nh h i nguy hi m nh t trong l ch s nhân lo i B nh sương mai khoai tây l n ñ u tiên ghi nh n t i Mexico, ñây cũng ñư c coi là trung tâm ña d ng sinh h c c a n m sương mai Tri... Trung tâm Khoai tây Qu c t (CIP) ti n hành chương trình ch n t o gi ng s d ng ngu n gen khoai tây c a CIP, ph i h p gi a Tuberosum (ôn ñ i) v i gen Andigena (nhi t ñ i); (gen Andigena có ngu n g c Peru và các nư c lân c n) T năm 1982 ñ n 2001, Vi n ñã ti p nh n 190 t h p lai, ñã t o ra hàng ch c v n con lai ñ ch n l c và ñã ch n ñư c nh ng gi ng khoai tây m i: VC38,6, KT2, KT3, gi ng khoai tây h t lai...th phân t DNA ph c v lai t o gi ng kháng 1.2.2 Yêu c u ðánh giá ñư c ñ c ñi m nông sinh h c và kh năng kháng sâu b nh ðánh giá kh năng kháng nhi m c a các m u gi ng khoai tây trên ñ ng ru ng Dùng ch th phân t DNA phát hi n ñư c các gen kháng R1, R3a trong các m u gi ng khoai tây H c vi n Nông nghi p Vi t Nam – Lu n văn th c s Khoa h c Nông... ch th phân t ” v i ý ñ s d ng các ch th phân t phát hi n ra ngu n gen kháng sương mai Các nhà khoa h c ñã tìm ñư c v trí các gen ñư c ñ nh v trên t ng nhi m s c th , cũng như các ch th phân t DNA liên k t v i các gen ñó, t o ra các b n ñ di truy n liên k t gen D a vào các ch th này, chúng ta có th phát hi n ñư c s có m t c a m t gen b t kỳ, n u bi t ñư c m t ho c nhi u ch th liên k t ch t v i gen ñó... R1F/R(76-2sf2/76-2SR) ñã ñư c s d ng ñ phát hi n gen R1 b i Ballvora và c ng s năm 2002 Gen R3a ñư c xác ñ nh n m trên nhánh ng n c a nhi m s c th s XI là gen kháng tr i có ngu n g c t loài khoai tây d i Solanum demissum (Huang và c ng s , 2005) Gen R3a có tính kháng cao, kháng ch ng ñ c hi u c a tác nhân gây b nh sương mai Sokolova và c ng s (2011) ñã tìm ra maker R3-1380 ñ phát hi n gen kháng R3a H c vi n Nông nghi... t Nam năm 1890 2.1.1 Ngu n g c và phân lo i cây khoai tây Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) có ngu n g c t Nam M ð u th k XVI nh ng nhà hàng h i ngư i Tây Ban Nha chinh ph c Nam M ñã ñem v tr ng nư c h Vào cu i th k XVI, khoai tây ñư c tr ng Anh, ð c, Pháp…t ñó khoai tây ñư c tr ng Ailen, nhi u nư c châu Âu khác Các nư c châu Á và châu l c khác bi t ñ n khoai tây mu n hơn các nư c châu Âu thông... là m t gen kháng sương mai quan tr ng, có tính kháng cao, kháng ñư c các ch ng ñ c hi u (Stewart và c ng s , 2003) Gen R1 ñư c xác ñ nh n m trên nhánh ng n c a nhi m s c th s V là gen kháng tr i có ngu n g c t loài khoai tây d i Solanum demissum (Leonards-Schippers và cs.1992; Ballvora và cs 2002) Gen này ñư c ñ nh v gi a maker RAPD GP21 và GP179; n m trong vùng “nóng” ch a nhi u gen kháng (Gebhardt... a c khoai tây 2.1.6 Th i v tr ng cây khoai tây Vi t Nam vùng trung du và mi n núi phía B c Vi t Nam, khung th i v tr ng khoai tây n m g n trong th i gian t v lúa mùa sang v lúa xuân Th i v t t nh t ñ tr ng khoai tây là trung tu n tháng 10 ñ n trung tu n tháng 11 Th i v này có th ñáp ng ñ y ñ nh t v nhi t ñ , ánh sáng ñ cây khoai tây sinh trư ng phát tri n và cho năng su t cao Tr ng s m hơn khoai tây. .. p Phân h u cơ có vai trò r t quan tr ng trong s n xu t khoai tây Mu n có năng su t, s n lư ng khoai tây cao, ch t lư ng t t thì ph i s d ng phân h u cơ vì phân h u cơ cung c p m t cách cân ñ i các nguyên t ña lư ng và bán ña lư ng (N, P, K, Ca) cho khoai tây và ñ c bi t là b sung ñ y ñ các nguyên t vi lư ng quan tr ng c n cho khoai tây Ngoài ra phân h u cơ còn t o ñ x p trong ñ t, tăng kh năng gi m... nh p kh u khoai tây vì: c u v khoai tây không ng ng tăng, vư t so v i cung và lư ng khoai tây trong nư c ch s n có trong vòng 6 tháng trong năm, trong khi ñó nhu c u ñòi h i ph i có khoai tây quanh năm Hi n nay, nhu c u th trư ng ngày càng tăng và áp d ng ti n b kĩ thu t trong s n xu t nên khoai tây ñã th c s ñư c chú tr ng phát tri n C nư c hi n còn kho ng 200.000 ha ñ t có th tr ng ñư c khoai các . tài: Khảo sát nguồn gen tập ñoàn giống khoai tây kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử DNA 1.2. Mục tiêu và yêu cầu của ñề tài 1.2.1. Mục tiêu  Xác ñịnh ñược các mẫu giống khoai tây. HÀ NỘI          LÊ MAI PHƯƠNG KHẢO SÁT NGUỒN GEN TẬP ðOÀN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC. HÀ NỘI          LÊ MAI PHƯƠNG KHẢO SÁT NGUỒN GEN TẬP ðOÀN GIỐNG KHOAI TÂY KHÁNG BỆNH SƯƠNG MAI BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ DNA LUẬN VĂN THẠC SĨ