2 PI30315 35 PI595509 68 3036 101 584493 3 PI458331 36 PI81147 69 5888 10 5
3.4.3. Phương pháp PCR phát hiện gen kháng R1, R3a 1 Tách DNA khoai tây
3.4.3.1. Tách DNA khoai tây
DNA ựược chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle, 1990)
Qui trình chiết xuất DNA:
1.Thu các lá non vào buổi sáng, ựặt trên ựá lạnh và ựưa về phòng thắ nghiệm.
2. Cắt khoảng 100 mg mô lá vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 400 ộl DEB (DNA extraction buffer), tiếp tục thêm 400 ộl DEB và trộn ựều trước khi chuyển hỗn hợp vào eppendorf 1,5 ml. đưa ngay các eppendorf vào ủ ở 650C trước khi chuyển sang nghiền mẫu khác.
3.Ủ mẫu ở 650C trong 1 giờ hoặc hơn. Ủ lâu hơn kết quả năng suất DNA eppendorf cao hơn, sạch hơn, trắng hơn.
4. Bổ sung dung dịchPhenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25:24:1) vào mỗi ống eppendorf chứa mẫu theo tỷ lệ thể tắch 1:1 và trộn nhẹ nhàng bằng cách ựảo ngược ống trong 5 phút.
5. Ly tâm ống mẫu với tốc ựộ 12.000 vòng/phút, trong 5 phút ở nhiệt ựộ phòng ựể phân tách các pha, chuyển pha lỏng phắa trên sang một eppendorf 1,5 ml mới. Các thao tác phải nhẹ nhàng, tránh gây ra lực cơ học ựể làm ựứt gãy DNA.
6. Bổ sung dung dịch Chloroform : Isoamylalcohol (24:1) theo tỷ lệ thể tắch là 1:1, trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp rồi lật ngửa eppendorf trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt ựộ phòng, 12.000 vòng/phút, chuyển dịch chiết chứa DNA ở pha lỏng phắa trên sang 1 eppendorf mới.
7. Tủa DNA bằng ethanol lạnh 100 % theo tỷ lệ thể tắch là 1 : 2 Ờ 2,5 sao cho nồng ựộ làm việc của ethanol khoảng 70%, nếu không thấy xuất hiện tủa trắng thì ựặt mẫu ở -20C trong khoảng 20 phút ựến 2 tiếng hoặc qua ựêm nếu thấy cần thiết.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 35 rpm.
9. đổ bỏ cồn, rửa eppendorf hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB. CTAB ựã ựược hòa tan trong ethanol, số còn lại ựược loại bỏ trong bước này (Aldrich và Cullis, 1993). Làm khô eppendorf trong không khắ khoảng 1h và hòa tan trong 50 ộl TE.
10. Kiểm tra chất lượng và nồng ựộ DNA bằng ựiện di trên gel agarose 1% ở hiệu ựiện thế 100V trong khoảng 15 phút. độ gọn và sáng của băng DNA cho biết mức ựộ ựứt gãy và nồng ựộ DNA tổng số.
Thành phần dung dịch tách chiết DNA
Thành phần Nồng ựộ dung dịch ban ựầu Nồng ựộ dung dịch thắ nghiệm 50 ml dung dịch Tris Ờ HCl pH = 8 1M 50 mM 2.5 ml EDTA pH = 8 0.5M 0.25 mM 2.5 ml NaCl 5M 300 mM 3.0 ml SDS 10% 1% 5.0 ml H2O 37ml Nồng ựộ dung dịch TE Thành phần Nồng ựộ dung dịch ban ựầu Nồng ựộ dung dịch thắ nghiệm 50 ml dung dịch Tris Ờ HCl 1 M 10 mM 0.5 ml EDTA 0.5 M 1 mM 0.1 ml H2O 49ml
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 36