Phân lập và khảo sát khả năng kháng một số vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo scenedesmus quadricauda

Với sự phong phú và ña dạng về thành phần loài, việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ vi tảo có thể mở ra hướng nghiên cứu sử dụng các hợp chất này chống lại vi khuẩn và nấm gây bệnh,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

- Tôi xin cam ñoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

- Tôi xin cam ñoan rằng mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 01 tháng 5 năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

ðỗ Văn Tuân

Nhân dịp này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô thuộc Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ Sinh học ứng dụng, ñã giúp ñỡ, ñóng góp nhiều ý kiến quý báu và tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành luận văn này

ðể hoàn thành khoá học này, tôi còn nhận ñược sự ñộng viên hỗ trợ rất lớn của gia ñình, bạn bè ñã tạo ñiều kiện về vật chất và tinh thần ñể tôi học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn./

TÁC GIẢ

ðỗ Văn Tuân

2.2 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo 7

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

3.3.1 Phân lập và ñịnh danh vi tảo Scenedesmus quadricauda 17 3.3.2 Chiết dịch tảo bằng các dung môi khác nhau 22 3.3.3 Phân tách các thành phần dịch chiết bằng sắc ký lớp mỏng 24 3.3.4 Thử hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm của dịch chiết 25

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

S quadricauda Scenedesmus quadricauda

X oryzae pv oryzae Xanthomonas oryzae pv oryzae

R solanacearum Ralstonia solanacearum

H maydis Helminthosporium maydis

S aureus Staphylococcus aureus

S epidermidis Staphylococcus epidermidis

E coli Escherichia coli

S platensis Spirulina platensis

C vulgaris Chlorella vulgaris

E viridis Euglena viridis

C reinhardtii Chlamydomonas reinhardtii

O sancta Oscillatoria sancta

S grantiana Spirogyra grantiana

D olivaceous Desmococcus olivaceous

C humicola Chlorococcum humicola

T erythraeum Trichodesmium erythraeum

C disperses Chroococcus disperses

C ellipsoidea Chlorella ellipsoidea

C grovesii Chara grovesii

C callicoma Cladophora callicoma

H reticulatum Hydrodictyon reticulatum

S leibleinii Schizomeris leibleinii

P corium Phormidium corium

S bijugatus Scenedesmus bijugatus

S obliquus Scenedesmus obliquus

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết một số loài vi tảo 9

Bảng 2.2: Khả năng kháng vi nấm của vi tảo 11

Bảng 2.3 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus 14

DANH MỤC HÌNH

3.3 Chiết rút phân ñoạn bằng n- hexan và ethyl ether 23

4.2 Hình thái của chủng tảo Scenedesmus sp. 29

4.3 ðồ thị sinh trưởng của tảo Scenedesmus sp. 30

4.4 Kết quả nhân ñoạn ITS1 của tảo Scenedesmus sp. 30

4.6 Kết quả BLAST ñoạn ITS1 tảo Scenedesmus sp với cơ sở dữ liệu

4.7 Thành phần các nhóm chất trong dịch chiết 34

4.8 Biểu ñồ khả năng kháng vi khuẩn R solanacearum của dịch chiết tảo

4.9 Khả năng kháng vi khuẩn R solanacearum của dịch chiết tảo S

4.12 Biểu ñồ khả năng kháng nấm H maydis của dịch chiết tảo S quadricauda 37

4.13 Khả năng kháng nấm H maydis của dịch chiết tảo S quadricauda 37

PHẦN I

MỞ ðẦU 1.1 ðặt vấn ñề

Trong số các loài tảo ñược biết hiện nay, vi tảo (microalgae) chiếm tỉ lệ lớn, ña dạng về thành phần loài và phân bố rộng trong ñó có khoảng hơn 1400 loài tảo nước ngọt và 530 loài tảo nước mặn [Dương ðức Tiến, Võ Hành, 1997;

Phạm Bình Quyền et al., 2002] Nhiều nghiên cứu gần ñây cho thấy một số loài

vi tảo nước ngọt chứa các hoạt chất sinh học có tác dụng kháng virus, vi khuẩn

và nấm, trong ñó bao gồm một số loài thuộc chi Scenedesmus [Beena et al.,

2011, Vinay Kumar et al., 2013], Spirulina [Justella et al., 2011; Sayda et al.,

2012, Hemtanon et al., 2005], Chlorella [Fabian et al., 2013] Với sự phong phú

và ña dạng về thành phần loài, việc khai thác các hợp chất tự nhiên từ vi tảo có thể mở ra hướng nghiên cứu sử dụng các hợp chất này chống lại vi khuẩn và nấm gây bệnh, ñặc biệt trong nông nghiệp

Trong sản xuất nông nghiệp, nhất là ñối với các cây trồng có ý nghĩa kinh tế

như lạc, cà chua, khoai tây vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh rất nghiêm

trọng ðây là bệnh phổ biến và gây tổn thất nghiêm trọng làm giảm ñáng kể ñến

năng suất và chất lượng của nông sản phẩm [Nguyễn Tất Thắng et al., 2011] Ngoại

trừ việc sử dụng một số chế phẩm kháng sinh và các biện pháp canh tác, cho ñến nay vẫn chưa có biện pháp phòng trừ bệnh héo xanh hiệu quả

Một số tác nhân gây bệnh hại cây trồng nghiêm trọng khác hiện nay phải kể

ñến ñó là vi khuẩn X oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá lúa Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn X oryzae pv oryzae ñã trở thành một trong những bệnh tàn phá nghiêm

trọng những giống lúa hiện nay, cây lúa bị nhiễm bệnh trong giai ñoạn ñẻ nhánh mạnh sẽ bị giảm năng suất từ 20 ñến 40%, nếu nhiễm ở giai ñoạn ñầu gây suy giảm

năng suất lên ñến 50% [Jeung Ju, 2006] Nấm H maydis gây bệnh ñốm lá nhỏ ở

ngô làm tổn thương lá, gây ảnh hưởng ñến khả năng quang hợp và làm giảm năng

suất [Abdel, 2012; Farhan et al., 2012] Cho ñến nay biện pháp phòng và trị bệnh

hiệu quả nhất là sử dụng thuốc hóa học Tuy nhiên việc sử dụng thuốc hóa học hiện

nay ựã gây ra hiện tượng kháng thuốc, ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng ựến sức khỏe con người

Với sự ựa dạng lớn về các loài vi tảo nước ngọt, việc nghiên cứu khả năng kháng vi khuẩn và nấm của các hợp chất tự nhiên tách chiết từ các loài vi tảo sẽ góp phần phát triển các chế phẩm ứng dụng trong bảo vệ thực vật Trong số các loài tảo

nước ngọt, tảo S quadricauda phân bố ở hầu hết các thủy vực nước ngọt và nước

lợ, có tốc ựộ sinh trưởng nhanh dễ thắch nghi với các ựiều kiện môi trường tự nhiên

[đặng Thị Thanh Hòa et al., 2007; Dương đức Tiến, Võ Hành, 1997] Ngoài ra tảo

S quadricauda có khả năng sinh trưởng trong môi trường dinh dưỡng ựơn giản, kể

cả trong các thủy vực ô nhiễm và dễ dàng nuôi trồng ở quy mô lớn Xuất phát từ

thực tế ựó, chúng tôi thực hiện ựề tài ỘPhân lập và khảo sát khả năng kháng một

số vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus quadricaudaỢ

1.2 Mục ựắch và yêu cầu

1.2.1 Mục đắch

Nghiên cứu này nhằm phân lập và khảo sát khả năng kháng vi khuẩn X

oryzae pv oryzae, R solanacearum và nấm H maydis của các loại dịch chiết vi tảo

S quadricauda

1.2.2 Yêu cầu

- Phân lập và ựịnh danh ựược vi tảo S quadricauda

- đánh giá ựược khả năng kháng vi khuẩn X oryzae pv oryzae, R

solanacearum, và nấm H maydis của các loại dịch chiết vi tảo S quadricauda

- Phân tách ựược nhóm chất kháng khuẩn có trong dịch chiết bằng sắc ký

lớp mỏng

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về vi tảo

Vi tảo (Microalgae) bao gồm tất cả các loại tảo (Algae) cĩ kích thước hiển

vi, phân bố rộng rãi trong các thủy vực từ nước ngọt đến nước mặn Vi tảo rất đa dạng, trong khoảng 50.000 lồi tảo đã được trên thế giới thì vi tảo chiếm 2/3 tức là khoảng 33.300 lồi [Nguyễn Lân Dũng, 2000], được xếp chủ yếu vào 5 ngành sau:

(1) Ngành Tảo lục (Chlorophyta): gồm các chi Closterium, Coelastrum,

Dyctyosphaerium, Scenedesmus, Pediastrum, Staurastrum, Dunaliella, Chlamydomonas, Haematococcus, Tetraselmis, Chlorella,

(2) Ngành Tảo lơng roi lệch (Heterokontophyta): gồm các chi Melosira,

Asterionella, Cymatopleurra, Somphonema, Fragilaria, Stephanodiscus, Navicula, Malomonas, Dinobryon, Peridinium, Isochrysis, Chaetoceros, Phaeodactylum, Skeletonema, Nitzschia

(3) Ngành Tảo mắt (Euglenophyta): gồm các chi Phacus, Trachelomonas,

Ceratium

(4) Ngành Tảo đỏ (Rhodophyta): gồm các chi Porphyridium, Rhodella (5) Vi khuẩn lam (Cyanophyta): gồm các chi Spirulina, Anabaena…

2.1.1 Hình thái cơ thể, cấu trúc và sinh sản

Hình thái cơ thể của vi tảo rất đa dạng, thơng thường cĩ 6 loại hình thái cơ bản [Nguyễn Lân Dũng, 2000]:

- Kiểu Monad: Tảo đơn bào, sống đơn độc hay thành tập đồn, chuyển động nhờ lơng roi

- Kiểu Pamella: Tảo đơn bào, khơng cĩ lơng roi, cùng sống chung trong bọc chất keo thành tập đồn dạng khối cĩ hình dạng nhất định hoặc khơng Các tế bào trong tập đồn khơng cĩ liên hệ phụ thuộc nhau

- Kiểu Hạt: Tảo đơn bào , khơng cĩ lơng roi, sống đơn độc

- Kiểu Tập đồn: Các tế bào sống thành tập đồn và giữa các tế bào cĩ liên

hệ với nhau nhờ tiếp xúc trực tiếp hay thơng qua các sợi sinh chất

- Kiểu Sợi: Cấu tạo thành tản (thallus) đa bào do tế bào chỉ phân đơi theo cùng một mặt phẳng ngang, sợi cĩ phân nhánh hoặc khơng

- Kiểu Bản: Tản đa bào hình lá do tế bào sinh trưởng ở đỉnh hay ở gốc phân đơi theo các mặtphẳng cả ngang lẫn dọc Bản cấu tạo bởi một hay nhiều lớp tế bào

Vi tảo bao gồm hai nhĩm: nhĩm cĩ cấu tạo tế bào Prokaryote hay cịn gọi là

vi khuẩn lam (Cyanobacteria) và nhĩm cĩ cấu tạo tế bào Eukaryote, sống chủ yếu bằng hình thức quang tự dưỡng, một số dị dưỡng Tế bào tảo chứa sắc lạp (chromoplast) cĩ cấu tạo như ở thực vật, bên trong là các túi thylakoid chứa sắc tố

và các enzyme để thực hiện quang hợp Sắc tố quang hợp của vi tảo là diệp lục chlorophyll và carotene, tuy nhiên nhiều lồi vi tảo cịn cĩ xanthophyll và phycobillin

Hình thức sinh sản của vi tảo chủ yếu là vơ tính bằng cách phân đơi, sinh dưỡng hoặc bào tử Ngồi sinh sản vơ tính thì nhiều lồi vi tảo cịn cĩ khăng sinh sản hữu tính bằng cách tiếp hợp

2.1.2 Vai trị của vi tảo

Tảo nĩi chung và vi tảo nĩi riêng cĩ vai trị rất quan trọng trong tự nhiên và trong đời sống nhân loại Hàng năm tảo cĩ thể tổng hợp ra trong đại dương 70-280

tỷ tấn chất hữu cơ, trong các thủy vực nước ngọt tảo cung cấp ơxy và hầu hết thức

ăn cho cá và các động vật thủy sinh khác Tảo gĩp phần bảo vệ mơi trường nuơi thủy sản bằng cách tiêu thụ bớt lượng muối khống dư thừa ðối với đời sống con người tảo cĩ rất nhiều vai trị đang được khai thác ứng dụng cũng như những tiềm năng đang được nghiên cứu

a, Nguồn dinh dưỡng từ vi tảo

Cĩ rất nhiều lồi vi tảo đang được khai thác làm nguồn thực phẩm cho con

người và vật nuơi ðiển hình là các lồi tảo thuộc chi Spirulina, Chlorella với hàm lượng protein cao dao động từ 51-71% trọng lượng khơ (Spirulina) [Babadzhanov

et al., 2004], 45% (Chlorella) [Belasco and Warren, 1997] Các nghiên cứu cho

thấy không phát hiện bất kỳ một ñộc tố nào trên các ñối tượng tảo thuộc chi

Spirulina, Chlorella, Scenedesmus

Ngoài protein, vitamin trong tảo cũng rất phong phú và có hàm lượng cao hơn so với nhiều loài sinh vật khác Khả năng tổng hợp một số loại vitamin ở tảo mạnh hơn rất nhiều so với ở gan người, rau chân vịt, nấm men… như khả năng tổng

hợp vitamin ở S platensis (Vitamin A – 840 mg/ngày, B1 – 44 mg/ngày, C – 80 mg/ngày), Scenedesmus quadricauda (Vitamin A – 554 mg/ngày, B1 – 11,5

mg/ngày, C – 396 mg/ngày) [Becker, 2004]

Phân tích 40 loài tảo thuộc 7 lớp (Bacillariophyceae, Chlorophyceae, Prymnesiophyceae, Cryptophyceae, Eustigmatophyceae, Rhodophyceae, Prasino-phyceae) ñã xác ñịnh rằng trong các loài vi tảo trên hàm lượng protein dao ñộng từ

6 – 52%; carbohydrate từ 5 – 23% và lipid từ 7 – 23% Các lớp tảo khác nhau không có sự khác biệt nhiều về hàm lượng protein và lipid, nhưng các loài trong lớp tảo Chlorophyceae và Prymnesiophyceae giàu hàm lượng carbohydrate hơn các loài

thuộc các lớp tảo khác [Brown et al., 1997]

Giá trị dinh dưỡng của vi tảo có thể bị thay ñổi rất lớn ở các pha phát triển và

dưới các ñiều kiện nuôi khác nhau [Enright et al., 1986; Brown et al., 1997] Kết

quả một nghiên cứu khác chỉ ra rằng tảo phát triển ñến cuối pha logarit thường chứa

30 – 40% protein, 10 – 20% lipid và 5 – 15% carbohydrate [Renaud et al., 1999]

Khi tảo ñược nuôi qua pha cân bằng thì hàm lượng này bị thay ñổi rất lớn, ví dụ như: khi nitrat giảm thì hàm lượng carbohydrate có thể tăng gấp 2 lần hàm lượng protein Mối liên quan giữa giá trị dinh dưỡng của tảo với hàm lượng lipid tổng cộng, carbohydrat, và protein không ñược thể hiện rõ [Webb and Chu, 1981;

Brown, 2002], ví dụ 2 loài tảo Phaeodactylum tricornutum và Nannochloris atomus

giàu hàm lượng protein và carbohydrate nhưng các thành phần vitamin, lipid, khoáng chất của chúng lại thấp

ðến nay, tất cả các nghiên cứu ñều xác ñịnh rằng mỗi loài tảo khác nhau thì chúng có giá trị dinh dưỡng khác nhau Một loài tảo có hàm lượng nhiều loại chất dinh dưỡng cao nhưng có thể thiếu ít nhất là một thành phần dinh dưỡng cần thiết,

nên việc khai thác dinh dưỡng từ vi tảo ñang có sự tập trung khai thác vào ñối tượng

cụ thể với các thành phần dinh dưỡng nổi trội của chúng như: protein (Spirulina), lipid (Scenedesmus)…

b, Nhiên liệu sinh học từ vi tảo

Trong bối cảnh sự cạn kiệt dần của năng lượng hóa thạch, nhiều giải pháp ñã ñược ñưa ra ñó là sản xuất nhiên liệu từ ngũ cốc: ngô, sắn, khoai, ñậu nành… tuy nhiên gây ảnh tăng giá lương thực và làm ảnh hưởng ñến an ninh lương thực Nhiều nghiên cứu ñã chứng minh lipid có trong tảo có thể sử dụng làm nhiên liệu sinh học, tuy nhiên việc chiết xuất lipid ra khỏi tế bào vi tảo gặp nhiều khó khăn Một số nước ñã ứng dụng thành công sản xuất dầu sinh học từ vi tảo ñó là Nhật Bản

và Mỹ

Dầu sinh học sản xuất từ vi tảo có nhiều ý nghĩa to lớn và có tính phát triển bền vững cao, một mặt sản xuất nhiên liệu làm năng lượng, một mặt tiêu hao lượng khí thải CO2 trong quá trình nuôi trồng Một số chủng tảo có khả năng tổng hợp và

tích lũy lipid cao như C vulgaris (40% trọng lượng khô), Scenedesmus (40 – 55% ),

Dunaliella salina (10 -20%) [Yusuf, 2007] Ở một số ñiều kiện nuôi cấy, thành

phần lipid tích lũy trong tảo có thể lên tới 80% trọng lượng khô [Metting, 1996;

Spolaore et al., 2006], tạo ñiều kiện thuận lợi cho việc sản xuất dầu sinh học

C, khai thác hoạt chất sinh học từ vi tảo

Nhiều báo cáo nghiên cứu thành phần các hợp chất có trong vi tảo rất phong phú, trong ñó nổi trội là các nghiên cứu về các hoạt chất có khả năng chống oxy hóa như Astaxanthin Tác dụng chống lão hóa của Astaxanthin ñược cho là mạnh hơn

550 lần so với vitamin E và 6000 lần so với vitamin C Việc khai thác astaxanthin hiện nay các nhà khoa học ñang tập trung nghiên cứu vào ñối tượng vi tảo

Haematococcus pluvialis, loại vi tảo này chứa hàm lượng hoạt chất astaxanthin rất

cao 5,7 mg/g tảo khô [Dragos et al., 2010]

Sử dụng ethanol ñể chiết các hợp chất tự nhiên của tảo C vulgaris và S

platensis, dich chiết sau ñó ñược thử nghiệm và cho dương tính khả năng kháng

in vitro tế bào ung thư gan, ngăn chặn ñược sự sinh sản của các tế bào ung thư

trên ñĩa nuôi cấy [Mohd Syahril et al., 2011] Nhiều báo cáo khác cũng cho thấy

phát hiện trong các loài vi tảo chứa các hoạt chất có khả năng kháng các tế bào

ung thư, như loài tảo Phaedactylim tricornutum, Nannchloropsis oculata [Samarakoon et al., 2013], Cladophora glomerata, Microspora floccose

[Ratiphan and Warawut, 2013]…

Gần ñây, ngày càng có nhiều nghiên cứu chứng minh trong vi tảo còn chứa nhiều hoạt chất sinh học có tác dụng như chất kháng sinh có khả năng kháng vi khuẩn và vi nấm, ñã mở ra một hướng nghiên cứu mới trong việc phòng trừ các bệnh do vi khuẩn và vi nấm gây ra

2.2 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo

Từ những năm 40 của thế kỷ trước việc sử dụng các chất kháng sinh chiết xuất từ nấm mốc, vi khuẩn ñã tỏ ra hiệu quả trong việc trừ các vi khuẩn và nấm gây bệnh Tuy nhiên những năm gần ñây, những chất kháng sinh cổ ñiển không còn hữu dụng bởi sự gia tăng khả năng kháng lại kháng sinh của tác nhân gây bệnh Phương hướng giải quyết ñó chính là tìm ra các loại kháng sinh mới, từ những nguồn cung cấp mới thay vì sử dụng các nguồn cũ, và vi tảo là ñối tượng ñang ñược nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và ứng dụng trong việc sản xuất các chất kháng sinh mới

2.2.1 Khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo

Phát hiện về khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo ñược Pratt công bố ñầu tiên

vào năm 1944 khi ông nghiên cứu về tảo Chlorella Pratt ñã tiến hành sử dụng các thành phần dịch chiết của tảo Chlorella và xử lý một số chủng vi khuẩn, kết quả cho

thấy một hỗn hợp các acid béo có trong tảo có khả năng ñối kháng cả vi khuẩn

Gram – và Gram + [Pratt et al., 1944]

ðến năm 1994 ñã phát hiện trên loài tảo Chlorococcum hs-101 chứa một loại acid béo là linolenic có khả năng kháng lại vi khuẩn S aureus S aureus là

loại vi khuẩn gây nhiễm trùng có khả năng kháng lại một số kháng sinh thông

thường [Ohta et al., 1994] Cũng với nghiên cứu trên vi khuẩn S aureus, một công

bố khác ñã phát hiện thêm các acid béo có trong tảo Phaeodactylum tricornutum có

khả năng kháng với loài vi khuẩn này ở nồng ñộ rất nhỏ Các acid béo ñó là

palmitoleic, hexadecatrienoic và eicosapentaenoic [Desbois et al., 2008; Desbois et

al., 2009] Dịch chiết bằng dung môi methanol từ Haematococcus pluvialis trong

giai ñoạn ñỏ (giai ñoạn kích thích sinh tổng hợp astaxanthin) có hoạt tính chống lại

vi khuẩn E coli và vi khuẩn S aureus, ñiều này lại một lần nữa chứng minh có sự

hiện diện của acid béo chuỗi ngắn, cụ thể butanolic và methyllactic acid trong khả

năng kháng lại vi khuẩn [Santoyo et al., 2009]

Tuy nhiên không chỉ các acid béo có trong tảo mới có hoạt tính kháng khuẩn, Rodríguez Meizoso ñã chứng minh bằng thực nghiệm rằng các hợp chất terpene

như α- ionone, β-ionone, neophytadiene có trong loài vi tảo thuộc chi Phormidium

có khả năng kháng lại vi khuẩn, nấm men và nấm mốc [Meizoso et al., 2008]

Những năm gần ñây có rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn của vi tảo mà tác giả chủ yếu sử dụng các dung môi ñể tiến hành chiết và thu dịch chiết có khả năng kháng với ñối tượng thử nghiệm Kết quả ñã có nhiều báo cáo về khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết các loài vi tảo ñã ñược công bố (Thể hiện ở bảng 2.1) Những dung môi thường ñược sử dụng thu dịch chiết ñó là methanol, acetone, diethyl ether, hexan, nước… Các kết quả cho thấy thành phần các chất trong vi tảo rất phong phú, việc lựa chọn ra dung môi thích hợp ñể thu ñược dịch chiết có khả năng kháng với ñối tượng thử nghiệm mang tính chất quyết ñịnh ñến kết quả của thí nghiệm

Bảng 2.1: Khả năng kháng vi khuẩn của dịch chiết một số loài vi tảo

E viridis Dịch chiết hữu

cơ

Pseudomonas, Aeromonas, Edvardsiella, Vibrio,

S aureus, S

epidermidis, Bacillus subtilis, E coli, Salmonella typhi

[Ghasemi et al.¸2007]

S platensis Methanol

S.aureus, E coli, Salmonella typhi, Pseudomonas

[Justella et al., 2011]

Scenedesmus sp

Nước, ethanol, diethyl ether, hexane

Pseudomonas sp., Xanthomonas oryzae

[Beena et al., 2011]

D olivaceous, C

humicola

Acetone, ethanol, methanol

Klebsiella pneumonia, Pseudomonas sp., Vibrio cholera, Streptococcus

S aureus, S

epidermidis, Bacillus subtilis

[Ghasemi et al., 2007]

Ngoài việc thử khả năng kháng khuẩn của dịch chiết vi tảo, một số tác giả còn so sánh với tác dụng của kháng sinh Younes Ghasemi ñã thử nghiệm và so

sánh khả năng kháng khuẩn của dịch chiết loài vi tảo Chroococcus disperses với hai

loại kháng sinh ampicillin và Gentamicin Kết quả cho thấy dịch chiết methanol và hexane của tảo có khả năng kháng mạnh hơn hai loại kháng sinh trên khi xử lý với

các chủng vi khuẩn S.aureus, S epidermidis, Bacillus subtilis, E coli, Samonella

staphy [Ghasemi et al., 2007]

2.2.2 Khả năng kháng vi nấm của vi tảo

Việc nghiên cứu về khả năng kháng nấm không có nhiều bước tiến so với nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn, nguyên nhân có thể là do những năm trước ñây các tác nhân gây bệnh bắt nguồn từ vi nấm không ñược công nhận là quan trọng Tuy nhiên càng về sau tác hại của nấm càng thể hiện rõ ràng trên người cũng như cây trồng và vật nuôi, ñặc biệt là sau khi con người sử dụng tràn lan các kháng sinh phổ rộng và sự suy giảm miễn dịch do nhiễm virus HIV Sự gia tăng các bệnh liên quan ñến vi nấm ngày một nhiều và khó ñiều trị hơn, ñòi hỏi một nỗ lực tìm kiếm những chất có khả năng ức chế nấm bệnh an toàn và hiệu quả hơn

Khả năng ñối kháng vi nấm của vi tảo mới ñược nghiên cứu rộng rãi trong những năm gần ñây, một số kết quả ñáng chú ý ñược trình ở bảng 2

Bảng 2.2: Khả năng kháng vi nấm của vi tảo

C reinhardtii Dịch chiết

methanol

Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus

[Ördög et al., 2004]

Amphidinium sp Karatungiol Aspergillus niger,

Trichomonas foetus [Washida et al., 2006]

C dispersus

Dịch chiết Methanol,

hexane

Cadida albicans, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Cadida kefir

[Ghasemi et al., 2007]

C pyrenoidosa, S

quadricauda

Dịch chiết Ethanol, Diethyl ether, methanol, acetone

Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Penicillium herquei, Fusarium moniliforme, Helminthosporium sp., Alternaria brassicae, Saccharomyces

cerevisiae, Cadida albicans

(Abedin et al., 2008)

H pluvialis Acid butanoic và

methyl lactate Cadida albicans [Santoyo et al., 2009]

Altermaria altermate, Aspergillus flavus, Curvularia lunata, Fussarium roseum, Trichodema

harzianum

[Kamble et al., 2012]

Khả năng kháng vi nấm của tảo bản chất là do hoạt chất Steroid, phenolic và polyketide, các hoạt chất này có tác dụng lên thành tế bào nấm gây ức chế các kênh

vận chuyển ở màng tế bào của cả nấm men và nấm mốc (Mayer et al., 2009) Trong

thử nghiệm khác ñã tiến hành so sánh khả năng kháng nấm của vi tảo với một loại kháng sinh kháng nấm là amphotericin B Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy các loại dịch chiết của vi tảo có khả năng kháng nấm mang tính tương ñối chọn lọc, nhiều loại dịch chiết vi tảo cho kết quả ñối kháng mạnh hơn so với amphotericin B, và có phổ tác ñộng hẹp hơn so với loại kháng sinh này

[Ghasemi et al., 2007]

Những nghiên cứu về khả năng kháng nấm của vi tảo ñang dần ñịnh ra hướng sản xuất các loại hoạt chất kháng nấm có phổ hẹp, hoạt lực mạnh, sẽ là một bước tiến quan trọng trong nỗ lực tìm kiếm các hoạt chất chống lại bệnh do nấm một cách bền vững và an toàn

2.3 Tổng quan về vi tảo Scenedesmus quadricauda

2.3.1 Vị trí phân loại

S quadricauda là một loài thuộc chi Scenedesmus, họ Scenedesmaceae, bộ

Chlorococcales, lớp Chlorophyceae, ngành tảo lục Chlorophyta, giới thực vật Cấu

tạo cơ thể vi tảo S quadricauda dạng cộng ñơn bào, không có roi, sinh sản vô tính

bằng tự bào tử và không có khả năng di ñộng

2.3.2 ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc và sinh sản của vi tảo Scenedesmus quadricauda

Cơ thể vi tảo S quadricauda có cấu trúc dạng cộng ñơn bào gồm 2 - 4 – 8, ít

khi là 16 tế bào là bản phẳng hoặc cong, hình thành từ 2 – 8, ít khi là 16 tế bào Tế bào hình trụ, ovan hoặc ovan kéo dài xếp thành cùng một hàng, kích thước mỗi tế bào dài từ 5-22µm, rộng từ 2,5 - 9 µm, ñầu tế bào nằm ngoài có 1 hoặc 2 gai thẳng

Tế bào tảo S quadricauda có cấu tạo giống như tế bào các loài tảo khác

thuộc bộ tảo lục Chlorococcales, bao gồm 3 phần chính: Thành tế bào, tế bào chất

và nhân tế bào Thành tế bào tảo S quadricauda ñược cấu tạo từ cellulose và không

phân lớp rõ ràng Tế bào chất là nơi thực hiện các trao ñổi chất giữa các phần sống

của tế bào, chứa hơn 50% là nước, hợp chất hữu cơ chắnh là protein, ngoài ra còn chứa lipid, carbonhydrate, vitamin và một số chất vô cơ Cũng giống như cấu tạo tế

bào nhân thực khác, tế bào chất tảo S quadricauda chứa các bào quan: khung tế

bào, ty thể, thể golgi, lạp thể, ribosome, mạng lưới nội chất Lục lạp là bào quan thực hiện chức năng quang hợp của tảo, bên trong lạp lục chứa diệp lục Chlorophyl a,b,c,d và e giống như ở thực vật bậc cao, chỉ khác về hình dạng bào quan và sự sắp

xếp của các lớp màng thylakoid trong lục lạp [Dương đức Tiến, Võ Hành, 1997] Tảo S quadricauda sinh sản chủ yếu theo hình thức sinh sản vô tắnh bằng

các tự bào tử (autospore) Các tự bào tử ở trong tế bào mẹ tập hợp thành một coenobium hoặc rời rạc thành các tế bào ựơn Sau khi màng tế bào mẹ vỡ ra toàn bộ các tự bào tử chui ra ngoài thành các cơ thể mới giống tế bào mẹ Các gai cũng ựược hình thành ngay trong cơ thể mẹ trước khi các tự bào tử ựược giải phóng Hình thức sinh sản hữu tắnh rất hiếm khi xuất hiện [Francis, 1996]

2.3.3 Sự phân bố của vi tảo Scenedesmus quadricauda

Vi tảo S quadricauda phân bố dưới dạng trôi nổi và ựáy của các thủy vực

nước ngọt và nước lợ khắp nơi trên thế giới Những nghiên cứu về sự phân bố của

tảo thuộc chi Scenedesmus nói chung và loài S quadricauda nói riêng ựược thực

hiện từ những năm 80 của thế kỷ XX Ở Tây Ban Nha có nhiều nghiên cứu ựã

công bố sự có mặt của loài tảo này trên các thủy vực nước ngọt [Aboal et al., 1984; Aboal Sanjurjo et al., 1988] Một số các nước khu vực Bắc Mỹ và Nam Mỹ có thành phần vi tảo thuộc chi Scenedesmus phong phú, trong ựó có sự có mặt của vi tảo S quadricauda [Smith et al., 2010; Helbling et al., 2001] Nhiều vùng ở khu

vực Châu Á như Trung Quốc, các nước đông Nam Á có ựiều kiện thuận lợi cho sự

sinh trưởng và phát triển của tảo S quadricauda, sự có mặt loài tảo này ở ựây rất phổ biến và mật ựộc cũng cao [Hu Wei et al., 2006; Phạm Minh Nguyệt et

al.,2011]

Ở Việt Nam, tảo S quadricauda phân bố chủ yếu ở các thủy vực nước ựứng,

và ắt gặp hơn ở các thủy vực nước chảy [Dương đức Tiến, Võ Hành, 1997] Các

phát hiện về sự có mặt của tảo S quadricauda ở Việt Nam cho thấy sự có mặt của

loài tảo này phổ biến ở các thủy vực nước ngọt và nước lợ trong nước: Hà Nội, Hà

Tĩnh, Quảng Bình, Tây Nguyên, Quảng Trị, Tuyên Quang [Dương đức Tiến, Võ Hành, 1997], đà Lạt [Dương đức Tiến, Trần Thị Tình, 2001]Ầ

2.4 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus

quadricaida

Tảo thuộc chi Scenedesmus hiện nay ựang ựược quan tâm nghiên cứu nhiều

về khả năng sản xuất dầu sinh học (Biofuel), theo Prabakaran (2012) tảo

Scenedesmus có thể sinh ra lượng lipid chiếm ựến 27,4% trọng lượng khô, sẽ là

hướng giải quyết ựầy hứa hẹn vấn ựề năng lượng trong tương lai gần Những nghiên

cứu gần ựây còn chứng minh rất nhiều loài tảo thuộc chi Scenedesmus có khả năng

kháng khuẩn, một số kết quả tiêu biểu ựược trình bày ở bảng 2.3

Bảng 2.3 Khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh của vi tảo Scenedesmus

khảo

S bijugatus

Staphylococcus aureus, Escherichia coli and Candida albicans

Methyl este [Ali et al.,

2012]

Scenedesmus sp Shigella sp., Pseudomonas

sp., Xanthomonas oryzae

Dịch chiết acetone, methanol, ethanol, diethyl ether, dichloro methane, hexane, nước nóng

Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger

Dịch chiết methanol

Dịch chiết methanol, dịch chiết nước

[Sahlan Ozturk

et al.,2006]

Tảo S quadricauda cũng là một trong các loài thuộc chi Scenedesmus ñã

ñược nghiên cứu về khả năng kháng vi khuẩn và nấm bệnh Một số loại dịch chiết

tảo S quadricauda ñược tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng một số loài vi khuẩn

và nấm bệnh trong ñiều kiện phòng thí nghiệm, kết quả cho thấy các loại dịch chiết

acetone, diethyl ether và methanol ñều cho hoạt tính kháng các loại vi khuẩn E coli,

B subtilis, S aureus, P aeruginosa và các loại nấm A niger, A flavus, Penicillium herquei, F monilifome, Helminthosporium sp., Alternaria brassicae, Saccharomyces cerevisiae, C albicans Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết tảo

ñược so sánh với một số loại kháng sinh phổ rộng và nhiều loại dịch chiết cho hoạt tính kháng mạnh hơn các loại kháng sinh erythromycin, tetracyline, amoxicillin,

itraconazole và polynoxylin khi xử lý với một số ñối tượng [Abedin et al., 2008] Một nghiên cứu khác vào năm 2011 ñã tiến hành chiết dịch tảo S

quadricauda bằng nước cất vô trùng, sau ñó dịch chiết ñược tiến hành xử lý với 4

chủng nấm Trichophyton rubrum, A flavus, Microsporium canis và Cryptococcus

neoformans Kết quả cho thấy ở các nồng ñộ dịch chiết 400, 600, 1000 và 1500

µg/ml ñều cho hoạt tính kháng với các chủng nấm trên Hoạt tính kháng mạnh nhất

của dịch chiết thể hiện ở nồng ñộ 1500 µg/ml khi xử lý với nấm Cryptococcus

neoformans với vòng kháng khuẩn là 33mm [Hussain, 2011] Dịch chiết của chủng

tảo S quadricauda phân lập tại sông Pennsilvania, Hoa Kỳ cũng ñược nghiên cứu hoạt kháng in vitro vi khuẩn Bacillus thuringiensis [Stephens et al., 2004]

Nhiều báo cáo cho thấy khả năng kháng khuẩn của Scenedesmus có ñược là

do các acid béo, tuy nhiên bằng việc sử dụng các dung môi khác nhau ñể thu dịch chiết nội và ngoại bào của tảo này thì vẫn cho kết quả kháng khuẩn Như vậy ngoài

các hoạt chất kháng khuẩn là acid béo, tảo Scenedesmus còn chứa nhiều loại hoạt

chất khác có khả năng kháng nhiều loại vi khuẩn và nấm khác nhau

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

3.1 Vật liệu, thời gian và ñịa ñiểm nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

Vi tảo S quadricauda ñược phân lập ở xã Cổ Bi, huyện Gia Lâm, thành phố

Hà Nội

Một số chủng vi khuẩn, nấm bệnh:

- Vi khuẩn X oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa và Nấm H maydis gây

bệnh ñốm lá ở ngô

- Vi khuẩn R solanacearum gây bệnh héo xanh ở cà chua ñược cung cấp

bởi Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Các vật liệu tác dòng bao gồm chủng vi khuẩn E coli DH5α, vector tách

dòng pJET2.1

3.1.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

Các nội dung nghiên cứu ñược tiến hành tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học và Trung tâm Bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội

Thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 01 tháng 5 năm 2013 ñến 01 tháng 3 năm 2014

3.2 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Phân lập và ñịnh danh vi tảo S quadricauda

Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn X oryzae pv oryzae, R

solanacearum và nấm H maydis của các loại dịch chiết vi tảo S quadricauda

Nội dung 3: Phân tách và xác ñịnh các nhóm hoạt chất kháng khuẩn bằng sắc

ký lớp mỏng

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phân lập và ñịnh danh vi tảo Scenedesmus quadricauda

a Phân lập vi tảo

Sự có mặt của tảo Scenedesmus sp trong mẫu nước ñược xác ñịnh bằng việc

quan sát trên kính hiển vi quang học ở ñộ phóng ñại 200 lần kết hợp với khóa mô tả hình thái của Dương ðức Tiến, Võ Hành năm 1997 về các loài tảo nước ngọt Việt Nam

Tảo Scenedesmus sp ñược phân lập tại xã Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội bằng

phương pháp pha loãng liên tục trong môi trường chọn lọc BBM [Nguyễn ðức

Bách et al., 2003; Pandian Prabakaran et al., 2014] Mẫu nước chứa tảo

Scenedesmus ñược làm giàu trong môi trường BBM ở nhiệt ñộ phòng (25- 28oC),

sục khí và chiếu sáng 3000 lux liên tục [Kentzer Teresa et al., 1984; Pandian Prabakaran et al., 2014] Mẫu sau khi làm giàu ñược pha loãng ở các nồng ñộ 10-1,

10-2, 10-3 rồi cấy trải trên môi trường BBM ñặc, giữ ở nhiệt ñộ phòng và chiếu sáng

12 giờ/ngày Sau 2 tuần, các khuẩn lạc ñơn xuất hiện ñược cấy chuyển sang nuôi trong các bình nhỏ chứa môi trường BBM lỏng Quy trình ñược lặp lại 2 lần cho ñến khi các tế bào hoàn toàn thuần nhất khi quan sát dưới kính hiển vi

Thành phần môi trường BBM [Nichols and Bold, 1965]

b Xác ñịnh ñiều kiện nuôi cấy và thu sinh khối tảo

Vi tảo ñược nuôi trong bình tam giác chứa 200 ml môi trường BBM ở các ñiều kiện nhiệt ñộ 25oC, sục khí và chiếu sáng liên tục bằng ñèn huỳnh quang (3000

lux) [Kentzer Teresa et al., 1984; Pandian Prabakaran et al., 2014] Mật ñộ tế bào

tảo ñược xác ñịnh 2 ngày/lần bằng phương pháp ñếm tế bào thực hiện trên buồng ñếm Neubauer dưới kính hiển vi quang học và phương pháp ño ñộ hấp thụ quang học OD ở bước sóng 680 nm bằng máy Ultrospec 2000UV/Visible Spectrophotometer

Tốc ñộ sinh trưởng và thời gian thế hệ của vi tảo ñược xác ñịnh dựa vào mối

liên hệ giữa thời gian nuôi cấy và mật ñộ tế bào [Kentzer Teresa et al., 1984; Nguyễn Lân Dũng, 2000]

ðể thu sinh khối, tảo ñược nuôi trong các bình 10 lít ở 25oC sục khí và chiếu sáng liên tục bằng ñèn huỳnh quang 3000 lux Sinh khối tảo ñược thu khi mật ñộ tế bào ñạt cực ñại Sinh khối thu bằng cách tủa kết bông trong FeCl3.6H2O ở nồng ñộ 0,37 g/l kết hợp với ly tâm 6.000 vòng/phút ở nhiệt ñộ phòng [Guzine I El Diwani

et al., 2011] Sinh khối sau ñó sấy khô ở 60oC ñến trọng lượng không ñổi

c Chiết DNA tổng số

DNA tổng số tảo ñược tiến hành chiết bằng phương pháp mô tả của [Trần

Hữu Quang et al., 1999; Nguyễn ðức Bách et al., 2003] Canh trường tảo ñược ly

tâm ñể thu sinh khối với lực ly tâm là 2.500g/10 phút ở nhiệt ñộ 4oC Sau ñó ðể khô sinh khối tảo trong ñiều kiện phòng, tiến hành cân 0.2 g cho vào ống eppendorf vô trùng, bổ sung thêm 50 µl dung dịch 10 % SDS + 10 µl proteinase K lắc ñều Tiến hành ủ 30 phút ở 65 °C, 5 phút ñảo 1 lần

Sau ñó tạo phức với CTAB ñể loại bỏ các tạp chất Bổ sung 500 µl CTAB, ủ

ở 65 °C trong 30 phút 5 phút ñảo 1 lần Bổ sung 600 µl (24 : 1) lắc ñều, ly tâm 10.000 vòng, 15 phút, 4 °C Hút 400 µl dịch trong, bổ sung chlorofom (V = 1:1)

400 µl, lắc ñều Sau ñó ly tâm 10.000 vòng trong 15 phút Thu dịch trong sang ống eppendorf mới Bổ sung ethanol 99,9% (V = 1:2), ñảo ñều, ủ ở -20°C trong 1giờ, ly tâm 10.000 vòng, 15 phút, 4°C ñể DNA lắng xuống, thu tủa, bỏ dịch trong