e. định danh vi tảo
3.3.4.Thử hoạt tắnh kháng khuẩn và kháng nấm của dịch chiết
Hoạt tắnh kháng khuẩn ựược ựánh giá bằng phương pháp khuếch tán dịch chiết trên ựĩa giấy [Anju Dhiman et al., 2011]. Vi khuẩn X. oryzae pv oryzae, R. solanacearum và nấm H. maydis ựược cấy trải ựều trên bề mặt ựĩa thạch lần lượt bằng môi trường Wakimoto [Wakimoto, 1960], KingỖs B [King et al., 1954] và môi trường PDA [Dhingra et al., 1985] trước khi thử hoạt tắnh kháng khuẩn của dịch chiết. Quá trình chuẩn bị mẫu khuẩn thử nghiệm ựược tiến hành như sau: đầu tiên vi khuẩn ựược nuôi cấy lỏng lắc ở 30oC cho ựến mật ựộ tế bào ựạt khoảng 1.108 tế bào/ml ựối với R. solanacearum [Granada and Sequeira, 1983] và 1,59.106 tế bào/ml ựối với X. oryzae pv. oryzae tương ứng với giá trị OD600= 1 [Suresh et al., 2013]. Sau ựó dịch khuẩn ựược pha loãng 100 lần rồi cấy trải ựều trên môi trường thạch nuôi ở 30oC trong 24 giờ. Chọn 1 khuẩn lạc ựơn và nuôi cấy lỏng lắc ở 30oC cho ựến khi ựo trị số OD600= 1 tương ứng với mật ựộ tế bào là 1.108 tế bào/ml ựối với R. solanacearum và 1,59.106 tế bào/ml ựối với X. oryzae pv. oryzae. Cấy trang 20 ml dịch khuẩn trên ựĩa thạch, nuôi ở 30oC trong 24 giờ.
Nấm H. maydis ựược nuôi trên ựĩa thạch 7 ngày ở nhiệt ựộ 30oC ựể nấm hình thành nhiều bào tử, sinh khối nấm ựược thu lại, bổ sung nước cất vô trùng và lọc bào tử bằng lưới lọc có kắch thước mắt lưới 150 ộm [Iffat Naz et al., 2013]. Mật ựộ bào tử nấm ựược ựếm bằng buồng ựếm Neubauer. 20 ộl dịch bào tử nấm ựược cấy trải ựều trên môi trường thạch và nuôi ở nhiệt ựộ 30oC trong 3 ngày.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 26
Thành phần môi trường Wakimoto
Thành phần Hàm lượng (g/l) Khoai tây 300 Sucrose 15 Pepton 5 Na2HPO4. 12H2O 2 Ca(NO3)2 0.5 Agar 15 pH 7.0
Thành phần môi trường KingỖs B
Thành phần Hàm lượng (g/l) Pepton 10 K2HPO4 1.5 Glycerol 15 MgSO4 1 M 5 Agar 15 pH 7.0
Thành phần môi trường PDA
Thành phần Hàm lượng (g/l)
Khoai tây 200
Dextrose 20
Agar 15
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 27
Sau khi nuôi cấy xong, các mảnh giấy thấm vô trùng có ựường kắnh 5 mm ựược thấm bằng 100 ộl các dịch chiết tương ứng với các nồng ựộ 0.1, 0.2 và 0.3 mg/ml và ựặt lên trên bề mặt ựĩa chứa mẫu vi khuẩn và nấm thử nghiệm. Mẫu ựối chứng sử dụng 100 ộl dung môi tương ứng. Sau 24 giờ giữ trong tối ở nhiệt ựộ phòng, ựường kắnh vòng kháng khuẩn (D) ựược xác ựịnh bằng cách ựo trực tiếp. đường kắnh vòng kháng khuẩn là ựường kắnh vùng vi khuẩn không phát triển ựược xung quanh ựĩa giấy trừ ựi ựường kắnh của ựĩa giấy.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 28
PHẦN IV