3.1. Vật liệu, thời gian và ựịa ựiểm nghiên cứu
3.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Vi tảo S. quadricauda ựược phân lập ở xã Cổ Bi, huyện Gia Lâm, thành phố Hà Nội.
Một số chủng vi khuẩn, nấm bệnh:
- Vi khuẩn X. oryzae pv oryzae gây bệnh bạc lá ở lúa và Nấm H. maydis gây bệnh ựốm lá ở ngô.
- Vi khuẩn R. solanacearum gây bệnh héo xanh ở cà chua ựược cung cấp bởi Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Các vật liệu tác dòng bao gồm chủng vi khuẩn E. coli DH5α, vector tách dòng pJET2.1.
3.1.2. địa ựiểm và thời gian nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu ựược tiến hành tại Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học và Trung tâm Bảo tồn và phát triển nguồn gen cây trồng, Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội.
Thời gian thực hiện nghiên cứu từ tháng 01 tháng 5 năm 2013 ựến 01 tháng 3 năm 2014.
3.2. Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Phân lập và ựịnh danh vi tảo S. quadricauda
Nội dung 2: Khảo sát khả năng kháng vi khuẩn X. oryzae pv oryzae, R. solanacearum vànấm H. maydis của các loại dịch chiết vi tảo S. quadricauda.
Nội dung 3: Phân tách và xác ựịnh các nhóm hoạt chất kháng khuẩn bằng sắc ký lớp mỏng.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 17
3.3.1. Phân lập và ựịnh danh vi tảo Scenedesmus quadricauda a. Phân lập vi tảo a. Phân lập vi tảo
Sự có mặt của tảo Scenedesmus sp. trong mẫu nước ựược xác ựịnh bằng việc quan sát trên kắnh hiển vi quang học ở ựộ phóng ựại 200 lần kết hợp với khóa mô tả hình thái của Dương đức Tiến, Võ Hành năm 1997 về các loài tảo nước ngọt Việt Nam.
Tảo Scenedesmus sp. ựược phân lập tại xã Cổ Bi, Gia Lâm, Hà Nội bằng phương pháp pha loãng liên tục trong môi trường chọn lọc BBM [Nguyễn đức Bách et al., 2003; Pandian Prabakaran et al., 2014]. Mẫu nước chứa tảo
Scenedesmus ựược làm giàu trong môi trường BBM ở nhiệt ựộ phòng (25- 28oC), sục khắ và chiếu sáng 3000 lux liên tục [Kentzer Teresa et al., 1984; Pandian Prabakaran et al., 2014]. Mẫu sau khi làm giàu ựược pha loãng ở các nồng ựộ 10-1, 10-2, 10-3 rồi cấy trải trên môi trường BBM ựặc, giữ ở nhiệt ựộ phòng và chiếu sáng 12 giờ/ngày. Sau 2 tuần, các khuẩn lạc ựơn xuất hiện ựược cấy chuyển sang nuôi trong các bình nhỏ chứa môi trường BBM lỏng. Quy trình ựược lặp lại 2 lần cho ựến khi các tế bào hoàn toàn thuần nhất khi quan sát dưới kắnh hiển vi.
Thành phần môi trường BBM [Nichols and Bold, 1965]
TT Thành phần Hàm lượng (mg/l) 1 H3BO3 11,42 2 CaCl2. 2H2O 18,87 3 Co(NO3)2.6H2O 0,49 4 CuSO4.5H2O 1,57 5 EDTA.Na2 63,69 6 FeSO4.7H2O 4,98 7 MgSO4.7H2O 36,63 8 ZnSO4.7 H2O 8,82 9 MnCl2.4H2O 1,44 10 KOH 31 11 K2HPO4 75 12 KH2PO4 175 13 NaCl 25 14 Na2MoO4 1.19 15 NaNO3 250
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp 18