PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH MỘT SỐ ENZYME VÀ HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN, KHÁNG NẤM Ở Streptomyces sp.

HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH MỘT SỐ ENZYME VÀ HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN,... TÓM TẮT Streptomyces có tiềm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH MỘT SỐ ENZYME VÀ HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, ĐỊNH DANH, KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH MỘT SỐ ENZYME VÀ HỢP CHẤT KHÁNG KHUẨN,

KHÁNG NẤM Ở Streptomyces sp

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện ThS ĐINH MINH HIỆP HUỲNH THƯ

Thành Phố Hồ Chí Minh Tháng 08/2009

LỜI CẢM ƠN

Xin chân thành cảm ơn:

- Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện giúp em trong suốt thời gian học tập tại trường

- Các thầy cô trong Khoa Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên em trong suốt bốn năm qua

- Thầy Đinh Minh Hiệp đã tận tình dạy dỗ, chia sẻ khó khăn, động viên an ủi, truyền đạt nhiều kiến thức quí báu trong thời gian qua

- Cô Lê Thị Thúy Ái, trưởng bộ môn Vi Sinh - Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã giúp

em rất nhiều trong quá trình định danh Streptomyces

- Cô Trương Phước Thiên Hoàng, anh Nguyễn Văn Lẫm đã giúp đỡ, nhiệt tình chỉ dạy giúp em vượt qua bao khó khăn khi thực hiện đề tài

- Các thầy cô cùng các bạn thuộc bộ môn Vi Sinh và bộ môn Sinh Hóa - Đại học Khoa Học Tự Nhiên đã tạo mọi điều kiện giúp tôi hoàn thành đề tài này

- Bạn Bùi Nguyệt Minh Tuyền đồng hành cùng tôi trong quá trình thực hiện đề tài

- Gia đình thân yêu luôn bên cạnh sẻ chia vui buồn, niềm hạnh phúc lớn nhất đời con

- Tập thể lớp DH05SH- Khoa Công nghệ sinh học- Đại học Nông Lâm đã sát cánh cùng tôi qua 4 năm học

TP HCM, ngày 25 tháng 07 năm 2009

HUỲNH THƯ

TÓM TẮT

Streptomyces có tiềm năng rất lớn trong việc sinh tổng hợp nhiều hợp chất sinh

học, phân giải nhiều hợp chất phức tạp, kích thích sự phát triển của cây trồng, đóng vai trò quan trọng trong các chu trình vật chất ngoài tự nhiên Đặcbiệt, Streptomyces có khả

năng sinh nhiều loại enzyme có hoạt tính cao, đây còn là nguồn kháng sinh chủ yếu Chính vì những đặc tính có lợi trên, nhóm nghiên cứu đã tiến hành phân lập và khảo sát khả năng sinh tổng hợp một số enzyme thủy phân và khả năng ức chế một số vi sinh vật nhằm tìm kiếm những dòng có ích phục vụ cho việc nghiên cứu sản xuất các chế phẩm

Đề tài đã tiến hành phân lập tại rừng Nam Cát Tiên và xác bã thực vật ở Bến Tre Tiến hành khảo sát sơ bộ các enzyme amylase, cellulase, protease, pectinase, chitinase,

mananase và khả năng đối kháng các vi sinh vật gây bệnh gồm E coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus MRSA (kháng methycillin), Staphylococcus aureus MSSA

(không kháng methycillin), Aspergillus flavus, Fusarium sp Sau đó, định danh 10 dòng

được chọn

Kết quả phân lập được 23 dòng từ Nam Cát Tiên, 12 dòng từ xác bã thực vật Sau khi khảo sát sơ bộ, chọn lọc 10 dòng có hoạt tính enzyme cao gồm V2, V3, V5, V6, H20, LA35, LA60, LA61, LA83, T11 Đo hoạt độ enzyme và định danh các dòng được chọn Dựa trên trình tự vùng 16S rRNA, chỉ giải trình tự được các dòng V2, V3, V6, H20, LA60, LA61 So sánh trình tự các dòng này với các dòng được công bố trên GenBank nhận thấy các trình tự này có sự tương đồng cao với nhiều dòng đã được công bố nên chưa xác định được chính xác tên loài các dòng chọn lọc trên

SUMMARY

Streptomyces have potential in biosynthesis of many bio-substances, degradation

of many complex compounds, stimulation of plant growth, and some physical circulations

in nature In addition to their ability to produce a variety of high activity enzymes; more importantly, they are the antimicrobial resources over the world Hence, we isolated, investigated their ability to produce some hydrolases, and their ability to inhibit several pathogenic growths with an aim of screening some potent antibiotic and enzymes-producing strains

Here, we report our isolation of these strains from Nam Cat Tien forest soil samples and agricultural residue samples Then, we were screened to their abitlity to produce enzymes, including their amylases, cellulases, proteases, pectinases, chitinases, mananases Moreover, we also tested on their antagonistic activity against several

pathogens such as E coli, Salmonella sp., Staphylococcus aureus MRSA (methycillin resistance), Staphylococcus aureus MSSA (methycillin unresistance), Aspergillus flavus,

Fusarium sp 10 seleted genus identifiedby 16S rRNA sequences

Result: A total of 35 strains were isolated from all of our samples, including 23 isolates from Nam Cat Tien forest soils, 12 isolates from agricultural residue samples 10 strains were highlighted for their potent enzyme products, including V2, V3, V5, V6, H20, LA35, LA60, LA61, LA83, T11 Based on 16S rRNA sequences, these genes from V2, V3, V6, H20, LA60, LA61 strains were amplified These sequences show high similarities to those of other species (GeneBank), so we not yet determine their phylogeny

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm ơn iii

Tóm tắt iv

Summary v

Mục lục vi

Danh sách các chữ viết tắt x

Danh sách các hình xii

Danh sách các bảng xiii

Chương 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Yêu cầu của đề tài 2

1.3 Nội dung thực hiện 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Giới thiệu về xạ khuẩn 3

2.1.1 Cấu tạo tế bào xạ khuẩn 3

2.1.2 Sự sinh sản của xạ khuẩn 4

2.1.3 Phân loại xạ khuẩn 4

2.2 Giới thiệu về Streptomyces 5

2.2.1 Phân loại Streptomyces 5

2.2.2 Phân bố của Streptomyces trong tự nhiên 5

2.2.3 Đặc điểm hình thái 6

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa 6

2.2.5 Cấu tạo tế bào 6

2.2.6 Đặc điểm sinh sản của Streptomyces 7

2.2.7 Tiềm năng sinh học 7

2.2.8 Một số kết quả công trình nghiên cứu về Streptomyces ở Việt Nam 8

2.2.9 Một số chế phẩm Streptomyces đã được thương mại hóa 8

2.3 Sơ lược về một số enzyme thủy phân ở Streptomyces 9

2.3.1 Enzyme amylase 9

2.3.2 Enzyme protease 9

2.3.3 Enzyme cellulase 10

2.3.4 Enzyme manannase 10

2.3.5 Enzyme pectinase 10

2.3.6 Enzyme chitinase 10

2.4 Sơ lược về kháng sinh ở Streptomyces 11

2.4.1 Khái niệm 11

2.4.2 Cơ chế tác động 11

2.4.3 Phổ tác động của một số loại kháng sinh 12

2.4.4 Ứng dụng 12

2 5 Kỹ thuật phân loại xạ khuẩn 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm 15

3.2 Vật liệu nghiên cứu 15

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm 15

3.2.2 Hóa chất 15

3.2.3 Dụng cụ - Thiết bị 15

3.2.4 Môi trường sử dụng 16

3.3 Phương pháp nghiên cứu 16

3.3.1 Phương pháp phân lập các dòng xạ khuẩn từ tự nhiên 16

3.3.2 Phương pháp tăng sinh và giữ giống 17

3.3.3 Phương pháp định tính hệ enzyme thủy phân của xạ khuẩn 17

3.3.3.1 Phương pháp 17

3.3.3.2 Môi trường cảm ứng 17

3.3.3.3 Thuốc thử 18

3.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme 18

3.3.4.1 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc 18

3.3.4.2 Phương pháp thu dịch chiết enzyme .19

3.3.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử 19

3.3.4.4 Phương pháp xác định hoạt độ cellulase 20

3.3.4.5 Phương pháp xác định hoạt tính mannanase 21

3.3.4.6 Phương pháp xác định hoạt độ pectinase 22

3.3.4.7 Phương pháp xác định hoạt tính protease .23

3.3.4.8 Phương pháp xác đinh hoạt tính amylase 25

3.3.4.9 Phương pháp xác định hoạt tính chitinase 27

3.3.5 Phương pháp thử tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định 28

3.3.6 Phương pháp phòng ẩm 28

3.3.6.1 Mục đích 28

3.3.6.2 Phương pháp 29

3.3.7 Phương pháp định danh trên vùng 16S rRNA 29

3.3.7.1 Qui trình ly trích DNA tổng số 29

3.3.7.2 Qui trình phản ứng PCR khuếch đại vùng 16S rRNA 30

3.3.7.3 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit Bio Basic Inc., version 1.2 31

3.3.7.4 Giải trình tự sản phẩm khuếch đại PCR trên vùng 16S rRNA 31

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Kết quả phân lập 32

4.2 Mô tả đặc điểm hình thái các dòng phân lập 32

4.3 Khảo sát hoạt tính hệ enzyme thủy phân 38

4.4 Khảo sát hoạt độ hệ enzyme thủy phân 41

4.4.1 Hoạt độ cellulase 41

4.4.2 Hoạt độ pectinase 42

4.4.3 Hoạt độ chitinase 43

4.4.4 Hoạt độ mannanase 43

4.4.5 Hoạt độ protease 44

4.4.6 Hoạt độ amylase 45

4.5 Khảo sát khả năng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật kiểm định 46

4.6 Kết quả giải trình tự gen trên vùng 16S rRNA với cặp primer S5/S6 49

4.6.1 Kết quả ly trích DNA tổng số của Streptomyces 49

4.6.2 Kết quả khuếch đại vùng 16S rRNA 49

4.6.3 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR trên vùng 16S rRNA 50

4.6.4 Kết quả giải trình tự vùng 16S rRNA 50

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 52

5.1 Kết luận 52

5.2 Đề nghị 52

TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CMC Carboxymethylcellulose

ETDA Ethylenediamine tetraacetic acid

Kb kilobase

Taq Thermus aquaticus

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 4.1 Một số khuẩn lạc của Streptomyces trên môi trường ISP2 37

Hình 4.2 Một số hình dạng khuẩn ty và cuống sinh bào tử 38

Hình 4.3 Kết quả điện di DNA tổng số 49

Hính 4.4 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại vùng 16S rRNA 50

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các loài Streptomyces được sử dụng làm kháng sinh 12

Bảng 3.1 Bảng xác định nồng độ glucose trong xây dựng đồ thị đường chuẩn 20

Bảng 3.2 Bảng thể tích dung dịch trong thí nghiệm đo hoạt độ enzyme cellulase 21

Bảng 3.3 Bảng xác định nồng độ galacturonic trong xây dựng đồ thị đường chuẩn 23

Bảng 3.4 Bảng xác định nồng độ Tyrosine trong xây dựng đồ thị đường chuẩn 24

Bảng 3.5 Bảng thể tích dung dịch trong thí nghiệm đo hoạt độ enzyme protease 25

Bảng 3.6 Bảng xác định nồng độ glucosamine trong xây dựng đồ thị đường chuẩn 27

Bảng 3.7 Trình tự mồi sử dụng trong phản ứng PCR 30

Bảng 3.8 Bảng xác định thể tích các thành phần phản ứng PCR 30

Bảng 4.1 Nguồn gốc và đặc điểm khuẩn lạc Streptomyces trên môi trường Gause 32

Bảng 4.2 Đường kính vòng phân giải của 53 dòng Streptomyces 38

Bảng 4.3 Hoạt độ cellulase của 10 dòng Streptomyces 42

Bảng 4.4 Hoạt độ pectinase của 10 dòng Streptomyces 42

Bảng 4.5 Hoạt độ chitinase của 10 dòng Streptomyces 43

Bảng 4.6 Hoạt độ mannanase của 10 dòng Streptomyces 44

Bảng 4.7 Hoạt độ protease của 10 dòng Streptomyces 44

Bảng 4.8 Hoạt độ amylase của 10 dòng Streptomyces 45

Bảng 4.9 Khảo sát khả năng ức chế sự phát triển vi sinh vật kiểm định 46

Bảng 4.10 Kết quả định danh phân tử của 6 dòng Streptomyces 50

Bảng 4.11 So sánh tỷ lệ tương đồng giữa các mẫu theo phần trăm ma trận 51

Chương 1

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Streptomyces được xem có khả năng hàng đầu trong việc sinh tổng hợp các hợp

chất thứ cấp, đóng vai trò quan trọng trong các chu trình sống tự nhiên, góp phần vào

sự sinh trưởng và phát triển của thực vật, có khả năng biến dưỡng mạnh mẽ nhiều hợp chất từ đơn giản đến phức tạp, là nguồn cung cấp nhiều enzyme như amylase, protease, cellulase, xylanase, lignin peroxidas Những nghiên cứu gần đây đã cho thấy

Streptomyces còn có khả năng phân giải PVC, PHC, DDT và khả năng hấp thu các

kim loại nặng mở ra các ứng dụng trong lĩnh vực cải tạo sinh học và phân giải sinh

học Hiện tại, Streptomyces là sinh vật sản sinh ra nguồn kháng sinh chủ yếu phục vụ

con người trong những năm qua và đặt ra những triển vọng trong việc tìm kiếm nguồn

kháng sinh mới Từ những tính chất ưu việt trên mà Streptomyces được ứng dụng

nhiều trong y học, nông nghiệp, công nghiệp, môi trường, thực phẩm

Nước ta nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa là điều kiện vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của nhiều loài vi sinh vật, đây là đặc điểm quan trọng cho việc phân lập những dòng vi sinh vật hữu ích Các nhà khoa học Việt Nam đang thực hiện nhiều nghiên cứu trên đối tượng này, trong đó có Đại học Bách Khoa TP.HCM, Đại học Thái Nguyên, Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM Trên cơ sở đó, đề tài:

“Phân lập, định danh, khảo sát khả năng sinh tổng hợp một số hợp chất có hoạt tính

sinh học ở Streptomyces sp.” được thực hiện nhằm mục đích phân lập một số dòng

Streptomyces trên xác bã thực vật ở một số vùng chuyên canh nông nghiệp tại Bến Tre

và một số dòng tại Nam Cát Tiên, từ đó khảo sát sơ bộ khả năng sinh tổng hợp enzyme thủy phân, chất kháng khuẩn, chất kháng nấm Đánh giá và so sánh hoạt tính sinh học các dòng phân lập ở hai địa điểm, chọn lọc và định danh những dòng có hoạt tính sinh học cao, đặt nền tảng ban đầu cho các nghiên cứu tiếp theo với mục đích đưa những sản phẩm hữu ích đến với con người

1.2 Yêu cầu của đề tài

- Phân lập các dòng Streptomyces sp từ Nam Cát Tiên và trên xác bã thực vật

- Chọn lọc các dòng Streptomyces có hoạt tính enzyme, hoạt tính kháng sinh mạnh

- Định danh Streptomyces đến loài các dòng có hoạt tính sinh học cao

1.3 Nội dung thực hiện

- Phân lập Streptomyces từ các mẫu thu thập tại Nam Cát Tiên và xác bã thực vật

- Khảo sát đường kính vòng phân giải các enzyme amylase, cellulase, protease, pectinase, chitinase, mannanase Từ đó chọn lọc dòng có hoạt tính cao

- Đo hoạt độ enzyme 10 dòng được chọn

- Khảo sát tính đối kháng với các vi sinh vật gây bệnh: Escherichia coli, Salmonella,

Staphylococcus aureus MRSA (kháng methycillin), Staphylococcus aureus MSSA

(không kháng methycillin), Aspergillus flavus, Fusarium sp

- Định danh đến loài 10 dòng được chọn

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một nhóm lớn các vi sinh vật đóng vai trò lớn trong quá trình hình thành và tạo ra độ phì cho đất Trước đây, vị trí phân loại của xạ khuẩn luôn là câu hỏi gây nhiều tranh luận giữa các nhà vi sinh vật học, do nó có những đặc điểm vừa giống

vi khuẩn vừa giống nấm (Dương Quốc Lâm, 2008) Tuy nhiên, đến nay, xạ khuẩn đã được chứng minh là vi khuẩn (Kalakutsky và Agre,1977)

2.1.1 Cấu tạo tế bào xạ khuẩn

- Màng nhầy là lớp màng nhầy mỏng có cấu tạo từ polysaccharide

- Thành tế bào tương đối dày và chắc hơn thành tế bào vi khuẩn, gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 120Ao chứa nhiều thành phần lipid ( đây là đặc điểm đặc trưng của xạ khuẩn), lớp giữa chủ yếu là protein dày khoảng 50Ao và lớp trong cùng có glycopeptid và teichoic acid (đặc điểm của vi khuẩn gram dương) dày khoảng 50Ao Trên thành tế bào có nhiều lỗ nhỏ và có cấu tạo dạng sợi, có kích thước lớn hơn của vi khuẩn nên một số chất có phân tử lớn như peptid, dextran, enzyme đi qua được thành vào bên trong tế bào

- Màng nguyên sinh chất gồm hai lớp, dày khoảng 50nm, có cấu tạo giống màng nguyên sinh chất của vi khuẩn gram dương, tham gia hình thành vách ngăn ngang Chức năng chủ yếu là điều hòa sự hấp thu các chất dinh dưỡng và tham gia vào sự hình thành bào tử

- Nguyên sinh chất gồm chất nhân, nucleic, các hạt volutin, không bào và các hạt ẩn nhập khác

- Không bào chỉ xuất hiện trong quá trình phát triển của xạ khuẩn ở những điều kiện nhất định Khuẩn ty mới nảy mầm không thấy không bào, khuẩn ty càng già không bào càng phát triển và kết lại với nhau tạo nên những không bào có kích thước lớn dần

có dạng cầu, ovan hay trứng Trong môi trường nghèo dinh dưỡng, các hạt không bào cũng dần dần biến mất

- Khi bào tử mới nảy mầm, trong tế bào chỉ thấy có một hạt nucleotide gọi là hạt cromatin Khi tế bào càng già càng chứa nhiều hạt cromatin và tạo thành metacromatin

(chất nhân) Ngoài chất nhân và các hạt dị nhiễm, trong nguyên sinh tế bào xạ khuẩn còn chứa các hạt ribosome, lipid, polysaccharide Đặc biệt, trong tế bào chất, hàm lượng nucleoprotein khá cao chứa nhiều DNA, hàm lượng này thay đổi trong quá trình phát triển và nuôi cấy xạ khuẩn (Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009)

2.1.2 Sự sinh sản của xạ khuẩn

Xạ khuẩn sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi, nảy chồi phân nhánh, phân bào

- Phân bào theo kiểu amitose (phân bào không tơ)

- Sự hình thành bào tử

2.1.3 Phân loại xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc về lớp Actinobacteria, bộ Actinomycetales, bao gồm 10 bộ phụ, 35 họ, 110 chi và 1000 loài Hiện nay, 478 loài đã được công bố thuộc chi

Streptomyces và hơn 500 loài thuộc tất cả các chi còn lại và được xếp vào nhóm xạ

khuẩn hiếm

Theo bảng phân loại của Bergey (1974):

- Họ Mycobacteriaceae: khuẩn ty thật chưa phát triển, tế bào có dạng que, phân nhánh ít, không sinh bào tử, kháng acid và kháng cồn Thành tế bào bao bọc bởi lớp

lipid dày Đại diện là giống Mycobacterium

- Họ Actinomycetaceae: khuẩn ty thật chưa phát triển, có thể sinh những sợi phân

nhánh, không kháng acid và cồn Đại diện là giống Actinomyces

- Họ Fradiaceae: đã hình thành khuẩn ty thật, cộng sinh trong nốt sần một số cây không phải họ đậu

- Họ Actinopanaceae: có khuẩn ty thật, bào tử sinh ra trong nang bào tử Đại diện là

Actinopeanes

- Họ Dermatophilaceae: có khuẩn ty thật phân cắt tạo khối tế bào gần giống hình cầu,

di động, bào tử không sinh trong nang Đại diện là giống Dermatophilus

- Họ Nocardiaceae: khuẩn ty thường phân cắt tạo thành những tế bào gần giống hình

cầu hay hình que, không di động, đôi khi kháng acid Đại diện là giống Nocardia

- Họ Streptomytaceae: Khuẩn ty khí sinh phát triển mạnh, mang chuỗi dài các bào tử

Khuẩn lạc mang nhiều màu sắc khác nhau Đại diện là giống Streptomyces

- Họ Micromonosporaceae: khuẩn ty khí sinh phát triển Bào tử sinh ra do sự phân cắt

đầu cuống sinh bào tử Đại diện là giống Micromonospora

2.2 Giới thiệu về Streptomyces

2.2.1 Phân loại Streptomyces

Phân loại Streptomyces theo Bergey (1974)

Streptomyces được Waksman và Henrici đặt tên năm 1943, chiếm số lượng

nhiều nhất trong lớp Actinobacteria Chúng có vị trí tiến hóa cao trong số các giống

thuộc vi khuẩn Gram dương (Yamaquchi, 1967), có trị số % mol Guanine và Cytocine

rất cao (62 - 78% GC) (De Ley, 1970; Tsyganov, 1972)

2.2.2 Phân bố của Streptomyces trong tự nhiên

Streptomyces phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất, nước, phế phẩm nông

nghiệp, phân chuồng, gỗ mục, rác… Đất là môi trường sống chính của Streptomyces,

đặc biệt là lớp đất bề mặt (40 cm bên trên) Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc (CFU- colony forming unit) thường khoảng 105 - 107 trong 1g đất Đất sa mạc cũng chứa chúng nhưng với số lượng thấp (khoảng 104 – 105 trong 1g đất)

Những loài Streptomyces ưa ẩm thì sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25- 300C, còn ở những loài ưa nóng thường là 55 – 600C và có thể lớn hơn Chúng thường được tìm thấy trong đất ở vùng ôn đới (Thakur, 2007)

2.2.3 Đặc điểm hình thái

Trên môi trường dinh dưỡng đặc, khuẩn ty phát triển mạnh, bện vào nhau tạo thành khuẩn lạc Các khuẩn lạc ban đầu thường trơn nhẵn nhưng sau đó khuẩn ty khí sinh sẽ phát triển rất mạnh mẽ Sinh nhiều loại sắc tố khác nhau cũng như sắc tố có khả năng khuếch tán ra môi trường Khuẩn lạc bám vào cơ chất nhờ các khuẩn ty cơ chất Trên bề mặt khuẩn lạc là hệ khuẩn ty khí sinh (Dương Quốc Lâm, 2008)

Hệ sợi sinh dưỡng phân nhánh nhiều lần, ít khi đứt đoạn, đường kính 0,5-2,0

μm Khuẩn ty gồm hai loại sợi khác nhau là sợi khí sinh (mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc, là nơi phát sinh ra bào tử) và sợi cơ chất (sinh ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh), đây là một đặc điểm phân loại quan trọng Nhiều khuẩn ty khí sinh phân hóa thành khuẩn ty sinh sản, trên khuẩn ty sinh sản mang nhiều bào tử vô tính Các loài khác nhau có hình dạng, màu sắc của khuẩn ty sinh sản khác nhau Khuẩn ty khí sinh khi phân hóa thành khuẩn ty sinh sản được gọi là cuống sinh bào tử Trên cuống sinh bào tử mang nhiều bào tử với nhiều hình dạng khác nhau như: hình răng lược, dạng xoắn nút chai, dạng thẳng hay dạng cong… Khuẩn ty khí sinh ở giai đoạn trưởng thành tạo chuỗi từ ba đến nhiều bào tử Khuẩn ty phát triển tốt, không có vách ngăn ngang, không phân cắt khi già thành các tế bào hình que hay hình cầu (Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009)

2.2.4 Đặc điểm sinh hóa

Rất nhiều dòng sản sinh ra một hoặc nhiều loại chất kháng sinh Hiếu khí, Gram dương, không nhuộm kháng acid-cồn, hóa dị dưỡng hữu cơ, catalase dương tính Thường có khả năng khử nitrate thành nitrit, phân hủy adenine, esculin, casein, gelatin, hypoxanthin, tinh bột và L-tyrosin Có khả năng sử dụng nhiều hợp chất hữu cơ làm nguồn carbon duy nhất Nhiệt độ sinh trưởng tối ưu là 25- 350C, pH tối ưu là 6,5-8,0 Chúng sử dụng các nguồn carbon như đường, rượu, acid hữu cơ, polysaccharide, lipid, aminoacid… Các nguồn nitrogen sử dụng gồm muối nitrat, nitrit, ure, peptone, protein… Khả năng sử dụng các hợp chất này khác nhau ở các loài, các dòng khác nhau (Holt và ctv, 1991)

2.2.5 Cấu tạo tế bào

Thành tế bào chứa L-DAP, không chứa mycolic acid Thành phần menaquinone chính là MK-9(H6), MK-9(H8) Thành phần phospholipid chính là

diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylinositol và phosphatidylinositol mannoside (Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009)

2.2.6 Đặc điểm sinh sản của Streptomyces

Streptomyces sinh sản bằng bào tử Cuống sinh bào tử có hình dạng và kích

thước đa dạng: dài 20 – 30 nm hoặc đến 100 -200 nm; cấu trúc lượn sóng, lò xo, hay xoắn ốc; sắp xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đôi, mọc vòng, hoặc từng chùm Dạng xoắn

có chiều dài và số vòng xoắn khác nhau Bào tử được hình thành trên suốt chiều dài cuống sinh bào tử thường có hình bầu dục, hình que, hình cầu với mép tròn trĩnh hoặc sứt sẹo theo kiểu kết đoạn (fragmentation) hoặc cắt khúc (segmentation) Bào tử không

có khả năng di động (Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009)

2.2.7 Tiềm năng sinh học

Streptomyces được xem là nguồn sản xuất kháng sinh chủ yếu hiện nay, chúng

có khả năng chuyển hóa và phân giải các hợp chất hữu cơ phức tạp như cellulose, chất mùn, chitin, lignin… Hiện đang có rất nhiều nghiên cứu tập trung vào khai thác các tiềm năng và ứng dụng chúng vào thực tế cuộc sống

Streptomyces có tiềm năng rất lớn trong việc sản xuất enzyme, đây cũng là một

trong những hướng nghiên cứu quan trọng được nhiều nhà khoa học quan tâm: S

albus tổng hợp keratinase (Mona A Esawy, 2007), S risomus sản xuất protease và

amylase (Shang- Shyng Yang và Jan- Yi Wan, 1999), S albus và S chomofuscus sản xuất xylanase dùng tẩy trắng bột giấy (H M Rifaat và ctv, 2005), S bangladeshiensis

sp sản xuất endoxylanase (M Abdul Alim Al-Bari và ctv, 2007)…

Hơn nữa, Streptomyces còn khả năng sản xuất phenoloxidase, tổng hợp vitamin

nhóm B, một số acid hữu cơ, phân hủy các hợp chất cao phân tử, phospholipase D (Jaya Ram Simkhada và ctv, 2007), poly-β-hydroxybutyrate (Yavuz Beyatli, 2002), L-glutamate oxidase (Supawadee Wachiratianchai và Amaret Bhumiratana, 2004), hấp thu và sử dụng n- ankan (Matko và ctv, 2001), phân hủy PHC (Michae F.Cohen và ctv, 2004), hấp thụ một số kim loại nặng… vì thế được xem là một trong những tác nhân

có tiềm năng lớn trong xử lý ô nhiễm môi trường Theo Lockwood (1967) ở các đất bị cằn cỗi mất hoạt tính phân huỷ, đất này có thể được phục hồi bằng cách ủ thêm xạ khuẩn Năm 2005, Y Igarashi và ctv đã nghiên cứu hiệu quả tác động của xạ khuẩn lên quá trình phát triển của thực vật Nhóm tác giả nhận thấy dòng xạ khuẩn

S.hygroscopicus S-17 kích thích sự phát triển của cà chua 2 lần về chiều cao và 8 lần

về khối lượng (hạt giống cà chua được ngâm với bào tử xạ khuẩn trước khi được gieo trồng) Ngoài ra, một chất trao đổi thứ cấp của dòng xạ khuẩn này, pteridic acid A (Mw = 364), có khả năng kích thích sự hình thành rễ của cây họ đậu Một số nghiên

cứu đã chứng minh Streptomyces hygroscopicus tổng hợp glutamine (Y Kumada và ctv, 1990), Streptomyces viridosporus T7A, Streptomyces badius 252 và Streptomyces

setonii 75Vi2 phân giải polyethylene (Pometto và ctv, 1992), phân giải chất nhuộm

azo (Crawford và ctv,1992), sản xuất nhiều tác nhân quan trọng trong việc ức chế nhiều bệnh ở vùng rễ (Crawford, 1993; Rothrock và Gottlieb, 1984; Tahvonen, 1982)

2.2.8 Một số kết quả công trình nghiên cứu về Streptomyces ở Việt Nam

Actinomyces griseus có khả năng sản sinh ra enzyme cellulase hoạt động ở điều

kiện tối ưu ở pH 7, nhiệt độ 500C, tủa ở nồng độ cồn 90%, lượng cồn so với lượng

enzyme thô là 2,5 : 1 (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 1999) S recifencis có tác dụng ức chế vi khuẩn Ralstonia sonalacearum, đồng thời có khả năng kích thích sinh trưởng

cây lạc non và tăng năng suất cây trồng Khả năng sinh kháng sinh tốt trên môi trường A4, pH 7 – 8, nhiệt độ 28 – 300C, thời gian lên men 72 – 120 giờ (Trần Thị Thanh Huyền, 2004) Nguồn dinh dưỡng thích hợp cho khả năng tổng hợp kháng sinh

vancomycin ở S orientalis là saccharose 3%, bột đậu tương 0,2%, pH 7,0 – 7,5, nhiệt

độ 300C, thời gian 120 giờ (Nguyễn Văn Hiếu và ctv, 2004) Kết quả phân lập và

thuần khiết được 380 dòng Streptomyces trong đất Thái Nguyên, trong đó có 145

chủng có tính kháng sinh mạnh (Vi Thị Đoan Chính và ctv, 2004) Kết quả nghiên

cứu cho thấy S actuosus có hoạt tính enzyme cellulase, xylanase, lignin peroxidase cao (Bạch Thị Mai Hoa và ctv, 2004) S eurythermus và S flavochromogenes ưa

nhiệt có khả năng phân giải cellulose ứng dụng được trong quá trình phân hủy vỏ cà phê (Dương Thị Nga, 2004)

2.2.9 Một số chế phẩm Streptomyces đã được thương mại hóa

Các chất kháng sinh có nguồn gốc từ Streptomyces đã được đưa ra thị trường,

góp phần to lớn vào sự phát triển của ngành y học thế giới, ảnh hưởng một cách sâu

rộng đến cuộc sống con người từ nhiều năm qua Mặt khác, Streptomyces vẫn còn

nhiều đặc tính ích lợi được ứng dụng rộng rãi Năm 2000, Nguyễn Đức Lượng và ctv

đã tạo ra chế phẩm sinh học Biovina gồm hỗn hợp các giống vi sinh vật với sự tham

gia của hai dòng xạ khuẩn Streptomyces griseus và Streptomyces roseus, có khả năng

phân giải tốt lignocellulose được sản suất đại trà với nhiều nhãn hiệu khác nhau như

Komix, Biomix, Humix, Bioffa Năm 2001, Lý Kim Bảng (Viện Công nghệ Sinh học)

đã sản xuất thành công các chế phẩm vi sinh Micromix chuyên dùng để xử lý rác hữu

cơ Năm 2005, Võ Thị Hạnh thuộc Viện Sinh học nhiệt đới cùng các ctv đã sản xuất ra

chế phẩm BIO-F, gồm có xạ khuẩn Streptomyces sp., nấm mốc Trichoderma sp., và vi khuẩn Bacillus sp có tác dụng phân hủy các hợp chất hữu cơ trong phân lợn, gà, bò làm giảm mùi hôi, đồng thời tạo ra phân bón vi sinh có chất lượng cao Streptomyces

rimosus sinh Oxytetracyclin (hay Tetramycin) cho chế phẩm có tên là Tetravit hay

OTC được dùng phổ biến trong chăn nuôi, làm chất kích thích sinh trưởng, tăng hệ số tiêu hoá cho thức ăn

2.3 Sơ lược về một số enzyme thủy phân ở Streptomyces

2.3.1 Enzyme amylase

Amylase là nhóm enzyme thủy phân tinh bột và glycogen thông qua việc xúc tác sự thủy giải liên kết glucoside trong tinh bột (Lê Thị Châu Hon, 2006)

Enzyme α- amylase thu nhận từ Streptomyces megasporus SD12 hoạt động ở

pI 5,4, pH 5,5 – 8,5 nhưng thích hợp nhất là pH 6,0, nhiệt độ trên 850C trong 30 phút

(Dey S và ctv, 1999) S crystallinus, S noboritoensis, S anulatus và S clavifer đều

có khả năng sản xuất α- amylase nhưng S clavifer có hoạt tính cao nhất Thu nhận

enzyme bằng (NH4)2SO4 90%, enzyme hoạt động tốt ở pH 7,0 và nhiệt độ 450C và có thể hoạt động ổn định ở pH 6,0 – 8,0 và nhiệt độ trên 550C (Md Mahfuzul, 2006) Năm 1990, Sami M Bahri và John M Ward đã chuyển gene biểu hiện khả năng sinh

tổng hợp amylase từ S thermoviolaceus vào E coli và S lividans, enzyme này hoạt

động được ở nhiệt độ 700C khi có sự hiện diện của CaCl2 Một số chủng Streptomyces

phân lập ở xưởng xay nghiền có khả năng sinh amylase có hoạt tính 11,7U/mg, khối lượng phân tử 47 kD, hoạt động tối đa ở pH 6 và nhiệt độ 50 – 600C Enzyme này được hoạt hóa bởi ion Ca2+, Co2+, Mg2+ và bị ức chế bởi ion Cu2+, Ni2+, Zn2+, Fe2+

(Takahiro Kaneko và ctv, 2005) S albidoflavus có khả năng sản xuất α- amylase tốt ở

pH 6,5, 300C, 84 giờ, môi trường sử dụng tinh bột (1,5%) và yeast extract (0,2%) (K.J.P Narayana và Vijayalakshmi, 2008)

2.3.2 Enzyme protease

Protease là enzyme thuộc nhóm hydrolase, thủy phân liên kết peptide –CO–NH- của phân tử protein và peptide, thành các amino acid tự do và một ít peptide khối lượng phân tử nhỏ (Lê Thị Châu Hon, 2006)

S rimosus TM-55 có hoạt tính protease cao ở 166 giờ nuôi cấy lỏng, 232 giờ

nuôi rắn và hoạt tính amylase cao sau 48 giờ nuôi cấy lỏng, 180 giờ nuôi rắn với pH 6 – 7, nhiệt độ 35 – 450C, hoạt tính enzyme khi nuôi cấy rắn ổn định với sự thay đổi của nhiệt độ và pH hơn khi nuôi cấy lỏng (Shang- Shyng Yang và Jan- Yi Wang, 1999) Năm 1987, G Henderson đã chứng minh sự giống nhau của gene mã hóa enzyme

protease A và protease B ở S griseus Protease được sản xuất bởi S thermonitrificans

hoạt động tốt ở 500C, pH 8, 72 giờ nuôi cấy, tốc độ lắc 150 rpm (A H Mohamedin,

1999) Protease sản xuất bởi S clavuligerus bằng phương pháp lên men theo từng mẻ

với bột đậu nành làm nguồn nitrogen và K3PO4 làm nguồn phosphat, sản lượng protease cao sau 24 giờ nuôi cấy ở pH 7,0 (A L F Porto và ctv, 1995)

2.3.3 Enzyme cellulase

Cellulase là enzyme thủy phân cellulose thành cellobiose qua việc xúc tác thủy giải liên kết 1, 4-β–glucoside trong cellulose (Lê Thị Châu Hon, 2006)

Streptomyces sp được phân lập từ phân bón compost có hệ enzyme cellulase

và hemicellulase mạnh (Bernard Godden, 1989) Khả năng tổng hợp cellulase ở S

reticuli sẽ bị ức chế ở pH thấp (S Walter và cộng sự, 1995) S albaduncus có khả

năng chịu nhiệt (có thể sinh trưởng ở nhiệt độ trên 470C) sản xuất cellulase tốt nhất ở

pH 7,0, nhiệt độ 370C với 3% cơ chất (Harchand RK và Shingh S, 1997)

2.3.4 Enzyme mannanase

Mannanase (hay còn gọi là endo-ß-1, 4-mannanase; mannanohydrolase) xúc tác thủy phân liên kết ß-1,4-mannoside của ß-1,4-mannan, glucomannan và galactomannan, chuyển các polymer dị thể khá phổ biến trong tự nhiên này thành các mannooligosaccharide (MOS) và một lượng nhỏ đường mannose (Lê Thị Châu Hon, 2006)

1,4-ß-D-mannan-2.3.5 Enzyme pectinase

Enzyme pectinase là nhóm enzyme thủy phân pectin, sản phẩm tạo thành là galacturonic acid, glucose, galactose, arabinose, methanol… (Lê Thị Châu Hon, 2006)

Pectinase được sản xuất từ Streptomyces lydicus bằng lên men chìm được dùng

để xử lý bóc vỏ chuối (Nicemol Jacob, 2006)

2.3.6 Enzyme chitinase

Chitinase hay poly–β–1, 4–(2–acetamido–2–deoxy)–D-glucoside glucanohydrolase thuộc nhóm enzyme thủy phân (Hydrolase), là các enzyme thủy

phân chitin hay chitooligomers bằng việc phân cắt liên kết glucosaminide (Lê Thị Châu Hon, 2006)

N-acetyl-β-1,4-Năm 2009, I Delic và ctv đã nghiên cứu về sự điều hòa hai promotor kiểm soát khả năng biến dưỡng enzyme chitinase của các trình tự lặp lại Năm 1991, Kiyotaka

Miyashita và ctv đã chuyển gene tổng hợp enzyme chitinase từ S lividans 66 vào plasmid pIJ702, gene này được biểu hiện ở S coelicolor M130 và E.coli Sự cảm ứng

sản xuất chitinase ở S lividans được đột biến gene reg1 sẽ làm quá trình biến dưỡng carbon ít bị ức chế do sự có mặt của glucose trong khi sự cảm ứng bởi chitin không còn nữa (J Nguyen và ctv, 1997) Năm 1989, Kaeko Kamei và ctv đã xác định được

trình tự amino acid enzyme chitinase của S erythraeus S viridificans có khả năng sản

xuất chitinase và ứng dụng để phá vách tế bào nhiều loài nấm bệnh, enzyme này bị ức chế bởi Hg2+, Mn2+ và được hoạt hóa bởi β-mercaptoethanol (Rani Gupta, 1995)

Chitinase được sản xuất bởi S aureofaciens có thể chịu được khoảng rộng nhiệt độ 30

– 500C, pH 5,5 – 8,0, bị ức chế bởi các ion hóa trị hai Hg2+, Cd2+, Ni2+ và được hoạt hóa bởi Mg2+ (T Taechowisan và ctv, 2003)

2.4 Sơ lược về kháng sinh ở Streptomyces

2.4.1 Khái niệm

Kháng sinh là những phức hợp hóa học có tác dụng làm chết hoặc kìm hãm sự phát sinh của vi sinh vật với một lượng rất nhỏ (Egorov, 1985)

2.4.2 Cơ chế tác động

- Ức chế sự tổng hợp vách tế bào: vancomycin, cephalosporin, D – cycloserin…

- Gây ra sự xáo trộn màng tế bào: actinomycin, nystatin, albomycin, endomycin…

- Ức chế có chọn lọc sự tổng hợp các nucleic acid:

+ Ức chế tổng hợp RNA: actinomycin, griseofulvin, kanamycin, neomycin, novobiocin, olivomycin…

+ Ức chế tổng hợp DNA: actidion, bruneomycin, mitomycins, novobiocin, …

- Ức chế tổng hợp purin và pyrimidine: asaserin, decoinin, sarcomycin…

- Ức chế tổng hợp protein: viomycin, kanamycin, meticylin, neomycin, tetracycline, chloramphenicol, erythromycin…

- Ức chế sự hô hấp: antimycins, oligomycins, patulin, pyocyanine, acid usnic…

- Ức chế quá trình oxi hóa phosphoryl: valinomycin, colicins, oligomycin, tyrocidine… (Egorov, 1985)

- Ngăn cản sự chuyển hóa amino acid, vitamin, nucleic acid: furanomycin (ngăn cản

sự chuyển hóa leucine), và một số kháng sinh có nguồn gốc từ S griseovariabilis (ngăn cản sự chuyển hóa arginine, ornithine), S globisporus (đối kháng với methionine, thiamine), S macrosporus (ngăn cản chuyển hóa arginine, lysin,

histidine)…

2.4.3 Phổ tác động của một số loại kháng sinh

- Kháng sinh kháng vi khuẩn gram dương: vancomycin, lincomycin, novobiocin, albomycin, pyostatine, tylosin, leucomycin…

chloramphenicol, streptomycin, neomycin, kanamycin, gentamycin…

- Kháng sinh chống bệnh lao: streptomycin, kanamycin, viomycin, cycloserin…

- Kháng sinh kháng nấm: nystatin, griseofulvin, amphotericin B, levorin…

quan tâm hàng đầu của các nhà khoa học Nhiều loài Streptomyces được chứng minh

tiềm năng kháng sinh to lớn của mình, hứa hẹn nhiều ứng dụng to lớn trong nền y học

thế giới S peucetius có khả năng tổng hợp daunorubicin chống ung bướu (Vetrivel K

S và Dharmalingam K, 2001), S clavuligerus tổng hợp Cephamycin C (Dylan C Alexander và Susan E Jensen, 1990), S bangladeshensis sp nov sản xuất bis-(2-

ethylhexyl) phthalate (M Abdul Alim Al-Bari, M Shah Alam Bhuiyan và ctv,1977)

Bảng 2.1 Các loài Streptomyces sản xuất kháng sinh (Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009)

Aminoglycosides Streptomycin Streptomyces griseus

Bảng 2.1 (tt) Các loài Streptomyces sản xuất kháng sinh (Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009)

Aminoglycosides Apramycin Streptomyces tenebrarius

Ansamycins Geldanamycin Streptomyces hygroscopicus

Geldanus

Macrolides Oleandomycin Streptomyces antibioticus

Tylosin Streptomyces fradiae

Nucleosides Sinefungin Streptomyces griseolus

Peptides Vancomycin Streptomyces orientalis

Orienticin A and B Streptomyces orientalis

Polyenes Amphotericin B Streptomyces nodosus

Polyether Monensin Streptomyces cinnamonensis

Narasin Streptomyces aureofaciens

Tetracyclin (Chlor-) Tetracyclin Streptomyces aureofaciens

Miscellaneous Chloramphenicol Streptomyces venezuelae

2.5 Kỹ thuật phân loại xạ khuẩn

Phân loại xạ khuẩn là một công việc phức tạp Trước đây, sự phân loại được dựa trên các tiêu chuẩn về hình thái (Cohn, 1872; Migula, 1894) Qua nhiều thập kỷ,

có nhiều hệ thống phương pháp phân loại được đưa ra nhưng thường không mô tả và giải thích rõ ràng những thay đổi sau đó Năm 1970, Krassilnikov đã đưa ra khóa phân loại xạ khuẩn dựa trên các đặc tính về hình thái, sinh lý, sinh hóa:

- Đặc tính hình thái: hình dạng, kích thước bào tử, cuống sinh bào tử, cách hình thành bào tử và cấu tạo màng của bào tử

- Đặc tính nuôi cấy: hình dạng và cấu tạo của khuẩn lạc, màu sắc của khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, các sắc tố tiết ra môi trường

- Hoạt tính enzyme của xạ khuẩn: khả năng tạo thành các enzyme phân hủy protein, cellulose, khử nitrate và các enzyme khác như catalase, urease, tyrosinase…, khả năng tạo thành melanin

- Khả năng đồng hóa các chất dinh dưỡng: sử dụng các nguồn carbon khác nhau: maltose, glucose, xylose, raffinose, arabinose, succrose, mannitol…, sử dụng các nguồn nitrogen ở các dạng khác nhau: muối amonium, nitrate…

- Khả năng tạo thành các sản phẩm trao đổi chất mà chủ yếu là kháng sinh

Năm 1997, Erko Stackebrandt và ctv đã đưa ra một hệ thống phân loại mới giữa các thứ bậc của giống và lớp cho xạ khuẩn bằng cách phân tích tiểu phần nhỏ 16S rRNA và các gen mã hóa rDNA Theo cách phân loại truyền thống, các phân tích 16S rRNA/rDNA về phát sinh loài ở mức độ giống trong ngành phụ xạ khuẩn thì phù hợp nhưng ở các đơn vị phân loại cao hơn thì không phù hợp Erko Stackebrandt và ctv (1997) đã đưa ra một hệ thống phân loại mà các đơn vị phân loại tương tự trong phát sinh loài ở mức độ giống được nhóm vào trong các họ, các bộ phụ, các bộ, các lớp phụ, và một lớp, bất chấp các đặc điểm về kiểu hình đã được mô tả trong hệ thống phân loại trước đó Không giống như sự căn cứ vào một loạt các tính chất về sinh lý,

hình thái, sự phân loại dựa vào các đặc điểm kiểu hình, sự mô tả này chỉ dựa vào trình

tự base của nhóm phát sinh loài trên 16S rDNA/rRNA và sự hiện diện của các nucleotide tín hiệu đặc biệt cho sự phân loại này (Nguyễn Thị Diệu Hạnh, 2009)

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

- Thời gian: 03/2009 đến 07/2009

- Địa điểm: Bộ môn Sinh Hóa - Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM

3.2 Vật liệu nghiên cứu

3.2.1 Đối tượng thí nghiệm

- Mẫu thu thập tại Nam Cát Tiên và xác bã thực vật nông nghiệp tại Bến Tre

- Các vi sinh vật kiểm định được cung cấp bởi Bộ môn Sinh Hóa – Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM

- Các dòng V1, V2, V3, V4, V5, V6, V7 được cung cấp bởi Bộ môn Sinh Hóa – Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP HCM

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp phân lập các dòng xạ khuẩn từ tự nhiên

- Phơi khô mẫu

- Hòa tan mẫu trong nước cất, lắc đều

- Hút 20μl dịch bên trên cho vào đĩa petri chứa môi trường Gause bổ sung kháng sinh Tetracyline (nồng độ 10μg/ml, 20 μg/ml, 30 μg/ml, 40 μg/ml)

- Dùng que cấy trang đều

- Để ở nhiệt độ phòng cho đến khi khuẩn lạc xạ khuẩn xuất hiện

- Dùng que tâm tiệt trùng chuyển khuẩn lạc lên môi trường Gause mới

- Ủ ở 280C cho đến khi khuẩn lạc xạ khuẩn xuất hiện

3.3.2 Phương pháp tăng sinh và giữ giống

Phương pháp tăng sinh

Cấy khuẩn lạc xạ khuẩn trong môi trường Gause (ISP2) lỏng, lắc tăng sinh ở nhiệt độ phòng khoảng 3-4 ngày

Phương pháp giữ giống

- Chuẩn bị ống thạch nghiêng môi trường Gause

- Dùng que cấy vòng lấy một ít sinh khối cấy vào

- Để ở nhiệt độ phòng khoảng 4 ngày

- Giữ ở nhiệt độ 6-100C

- Cấy chuyền hàng tháng

3.3.3 Phương pháp định tính hệ enzyme thủy phân của xạ khuẩn

3.3.3.1 Phương pháp

- Đổ môi trường cảm ứng sự tổng hợp enzyme vào đĩa petri

- Dùng que cấy móc cấy giống vào giữa đĩa

- Ủ ở nhiệt độ phòng trong 6 ngày

- Nhuộm thuốc thử và đo đường kính vòng phân giải

3.3.3.2 Môi trường cảm ứng

Sử dụng môi trường Gause, thay thế tinh bột bằng nguồn cơ chất phù hợp cho từng loại enzyme

* Môi trường cảm ứng enzyme amylase

Hòa tan 10g tinh bột trong nước nóng Cho khoáng và agar vào Định mức vừa

đủ 1 lít Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút

* Môi trường cảm ứng enzyme cellulase

Hòa tan 10g CMC trong nước nóng Cho khoáng và agar vào Định mức vừa đủ

1 lít Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút

* Môi trường cảm ứng enzyme pectinse

Hòa tan 10g tinh bột trong nước nóng Cho khoáng và agar vào Định mức vừa

đủ 1 lít Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút

* Môi trường cảm ứng enzyme mannanase

Hòa tan 10g Guar-gum trong nước nóng Rây bỏ những phần không tan Cho khoáng và agar vào Định mức vừa đủ 1 lít Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút

* Môi trường cảm ứng enzyme protease

Đun nhẹ dung dịch casein 1% Cho khoáng và agar vào Định mức vừa đủ 1 lít Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút

* Môi trường cảm ứng enzyme chitinase

Cho 10g chitin huyền phù trong nước nóng Cho khoáng và agar vào Định mức vừa đủ 1 lít Hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút Điều chế chitin huyền phù: 10 g chitin +

100 ml HCl đậm đặc ở 400C, thêm từ từ 1 lít nước đá (50C) để tủa, lọc huyền phù và rửa nước để pH 4,5, bảo quản điều kiện lạnh 4 – 100C

3.3.3.3 Thuốc thử

- Thuốc thử Lugol dùng để khảo sát các enzyme amylase, cellulase, pectinase, mannanase, chitinase Cân 1g Iot, 3g KI Cho vào một ít nước khấy cho tan Thêm nước vào vừa đủ 300ml dung dịch

- Thuốc thử TCA 10% dùng để khảo sát enzyme protease Cho 10g TCA vào 100ml nước cất vào hòa tan

3.3.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme

3.3.4.1 Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc

Nguyên tắc

Đếm số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch đĩa ISP2 từ một lượng mẫu xác định trên cơ sở xem mỗi khuẩn lạc hình thành từ một tế bào duy nhất Số khuẩn lạc từ một thể tích nhất định chỉ số lượng tế bào sống có trong thể tích đó

Cách tiến hành

Dịch tăng sinh được pha loãng ở các độ pha loãng khác nhau bằng dung dịch nước muối sinh lí Dùng pippet vô trùng hút 0,1 ml dịch ở mỗi độ pha loãng cho vào các đĩa thạch chứa môi trường đã hấp khử trùng Dùng que gạt thủy tinh trải đều trên mặt thạch Mỗi độ pha loãng thực hiện 3 đĩa petri, thực hiện ở 3 độ pha loãng liên tiếp

Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày Đếm tất cả các khuẩn lạc mọc trên đĩa petri Ghi nhận các độ pha loãng có số khuẩn lạc từ 25 -300 khuẩn lạc trên 1 đĩa

Công thức:

n1v1f1 + n2v2f2

Trong đó:

N: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa có 25 – 300 khuẩn lạc

ni: Số đĩa có khuẩn lạc trong khoảng mật độ đếm được

vi: Thể tích dịch pha loãng cho vào mỗi đĩa petri

fi: Bậc pha loãng

3.3.4.2 Phương pháp thu dịch chiết enzyme

- Hấp khử trùng môi trường cảm ứng enzyme lỏng (30ml/erlen)

- Dùng pipetman hút 1ml dịch tăng sinh cho vào môi trường cảm ứng

- Nuôi lắc khoảng 96 giờ và lọc qua giấy lọc thu dịch trong

3.3.4.3 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử (phương pháp định lượng đường khử theo Miller)

Nguyên tắc

Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng tạo màu giữa đường khử với thuốc thử DNS Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử Dựa theo đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu

Hóa chất

- Thuốc thử DNS: cân 1g DNS pha trong 20ml dung dịch NaOH 2N, thêm vào 50ml nước cất và 30g muối sodium potassium tartrate Đun nhẹ cho tan rồi định mức đến 100ml

- Dung dịch glucose mẫu (500 µg/ml): cân 0,5g D-glucose pha trong nước cất thành 1 lít

Cách tiến hành

Dựng đường chuẩn glucose

Từ dung dịch glucose 500(µg/ml) chuẩn, pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ từ 50 – 500 (µg/ml) Cho 0,5ml dung dịch glucose chuẩn vào các ống nghiệm sạch và khô, thêm vào 0,5ml thuốc thử DNS Đun cách thủy trong 3 phút, làm lạnh đến nhiệt độ phòng Thêm vào mỗi ống 5ml nước cất và đo mật độ quang ở bước sóng 545nm với ống đối chứng là nước cất Vẽ đường chuẩn glucose với trục tung là mật độ quang và trục hoành là nồng độ glucose

Bảng 3.1 Bảng xác định nồng độ glucose trong xây dựng đồ thị đường chuẩn

3.3.4.4 Phương pháp xác định hoạt độ cellulase

Nguyên tắc

Để xác định hoạt tính enzyme cellulase, ta cần sử dụng CMC như cơ chất, ủ dịch chiết enzyme với CMC trong 60 phút, pH 5,0 Hệ enzyme cellulase sẽ tác dụng lên CMC, phóng thích các phân tử glucose, dựa vào hàm lượng glucose xác định hoạt

- Dung dịch enzyme thô sau khi thu từ ly tâm (100ml), lấy khoảng 20ml đem đi đun sôi ở 1000C, sau đó làm lạnh nhanh

Cách tiến hành

Bảng 3.2 Bảng thể tích dung dịch trong thí nghiệm đo hoạt độ enzyme cellulase

Mẫu thật Mẫu đối chứng

- Giữ ổn định ở 500C trong 1 giờ

- Đun sôi cách thủy trong 10 phút

- Hút 0,5 ml dung dịch từ các ống nghiệm, thêm vào 0,5 ml thuốc thử DNS Đun sôi cách thủy trong 3 phút Thêm vào 5 ml nước cất Đo OD bước sóng 545 nm

Cách tính

Đơn vị hoạt độ của enzyme cellulase được xác định như sau: một đơn vị hoạt

độ tương ứng với 1µg glucose trong thời gian thủy phân cơ chất CMC 1 giờ ở 500C

m: khối lượng canh trường (g)

t: thời gian thủy phân (giờ)

3.3.4.5 Phương pháp xác định hoạt độ mannanase

Nguyên tắc

Để xác định hoạt tính hệ mannanase, chúng tôi sử dụng guar gum làm cơ chất Hệ mannanase sẽ tác dụng lên guar gum, phóng thích các phân tử manose và các oligosaccharide mạch ngắn Dựa vào lượng manose, xác định hoạt tính hệ mannanase

- Dung dịch trinatricitrate 0,1M: cân 29.41 g C6H5O7Na.2H2O hòa tan và thêm nước đến 1000ml (b)

- Dung dịch đệm citrate 0,1M, pH 4,0: lấy 33ml dung dịch (a) và thêm vào 14ml dung dịch (b)

- Dung dịch guar gum (0,1%): cân chính xác 0,1g guar gum, hòa tan trong dung dịch đệm citrate 0,1M, pH 4,0 Khuấy trong vài phút ở nhiệt độ thường để hòa tan cơ chất, thêm dung dịch đệm cho đủ 100ml

Cách tiến hành

Hỗn hợp phản ứng gồm: 1ml dịch chiết enzyme, 1ml dung dịch cơ chất, 3ml dung dịch đệm Hỗn hợp được ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau thời gian ủ, lấy 0,5ml dịch hỗn hợp đem xác định hàm lượng manose tạo thành

Cách tính

Đơn vị hoạt tính của hệ mannanase được xác định như sau: Một đơn vị hoạt tính mannanase tương ứng với 1μmol đường manose được tạo thành từ phản ứng thủy phân galactomanan trong thời gian 1 phút ở điều kiện 30OC, pH 4.0

Hđm =(x*L*5*1000)/(5*1*180) = x*L*50/9 (UI/ml)

Trong đó:

x: hàm lượng (mg) mannose suy ra từ đường chuẩn

L: độ pha loãng mẫu enzyme

5: thể tích (ml) hỗn hợp thủy phân

t: thời gian (phút)

3.3.4.6 Phương pháp xác định hoạt độ pectinase

Nguyên tắc

Cho enzyme tác dụng với cơ chất là pectin, sản phẩm tạo thành là galacturonic

acid được hiện màu với thuốc thử DNS và đem đo mật độ quang ở bước sóng 575 nm

Hóa chất

- Dung dịch đệm acetate 0,1 M, pH 4,2

- Dung dịch X: acetic acid 0,2 M: 11,55 ml CH3COOH Thêm nước đủ 1 lít

- Dung dịch Y: natri acetate 0,2 M: 16,4 g CH3COONa Thêm nước đủ 1 lít

- Đệm Na- acetate (pH 4,2): 36,8 ml dd X + 13,2 ml dd Y + nước đủ 1 lít

- Dung dịch D-galacturonic acid chuẩn 100 μmol/ml

- Dung dịch pectin 1%: đun nóng 100 ml dung dịch đệm

- Trong khi đun thêm từ từ 1 g pectin, khuấy đều đến khi tan, dung dịch trong và có dạng keo → làm lạnh và thêm nước cất đủ 100 ml Bảo quản lạnh

Cách tiến hành

Cho vào ống nghiệm 0,5 ml dung dịch pectin 1% + 0,5 ml dung dịch enzyme

Lắc đều, ủ ở 370C trong 60 phút Thêm 1 ml thuốc thử DNS, trộn đều và đun sôi chính xác trong 15 phút , làm lạnh trong bồn nước lạnh Thêm 3 ml nước cất, lắc đều, đo

x: lượng D-galacturonic acid được suy ra từ đường chuẩn (μmol/ml)

Hóa chất

- Dung dịch Na2HPO4 1/15M : hoà 5,969g Na2HPO4.12H2O trong 250ml nước

- Dung dịch KH2PO4 1/15M : hoà tan 0,9072g KH2PO4 trong 100ml nước

- Dung dịch đệm Sorensen 1/15 M, pH 7,6 : trộn chung 177 ml dung dịch Na2HPO4

1/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15M

- Dung dịch Casein 1% : đun sôi cách thủy 1g Casein trong dung dịch đệm Sorensen cho đến khi hoà tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100 ml

- Dung dịch TCA 10% : hoà tan 10 g TCA trong nước cho đủ 100 ml

- Dung dịch NaOH 0,5 N : hoà tan 10 g NaOH trong nước cho đủ 500 ml

- Thuốc thử Folin (pha loãng với nước cất theo tỉ lệ 1: 2)

- Dung dịch HCl 0,2 N : trộn 4,25 ml HClđđ với nước cho đủ 250ml

- Dung dịch Tyrosine 20 mM/l: khuấy nghiền 1,8119 g Tyrosine trong dung dịch HCl 0,2 N vừa đủ 500 ml

- Dung dịch Tyrosine chuẩn 1 mM/l trong dung dịch HCl 0,2 N: pha loãng 5 ml dung dịch Tyrosine 20 mM/l trong dung dịch HCl 0,2 N thành 100 ml

Cách tiến hành

Bảng 3.4 Bảng xác định nồng độ Tyrosine trong xây dựng đồ thị đường chuẩn

Ống nghiệm Dung dịch hoá chất

Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660 nm

- Ống số 6 là ống kiểm chứng (KC), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TN) Vẽ đường chuẩn Tyrosine tương quan giữa lượng Tyrosine (μM) và ∆OD (∆OD = ODTN -

Bảng 3.5 Bảng thể tích dung dịch trong thí nghiệm đo hoạt độ enzyme protease

Ống nghiệm Dung dịch hoá chất

660 nm tương ứng với 1 μM Tyrosine trong đường chuẩn

t: thời gian thủy phân (phút)

m: khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g)

L: độ pha loãng mẫu enzyme

μM Tyrosine: lượng μM Tyrosine suy ra từ đường chuẩn

3.3.4.7 Phương pháp xác đinh hoạt độ amylase

Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iod Đơn vị hoạt động của enzyme

là lượng enzyme có khả năng phân giải 1 mg tinh bột sau 30 phút ở 300C

Hoá chất

- Dung dịch NaCl 0,1%: hoà tan 0,1 g NaCl trong nước thành 100 ml

- Dung dịch Sunfosalicylic acid 20%: hoà tan 20 g Sunfosalicylic acid trong nước thành 100 ml

- Dung dịch Iod (I2): hoà tan 1 g Iod vào 5 ml dung dịch có chứa 2 g KI, thêm nước cất đến 100 ml Khi dùng pha loãng dung dịch này 450 lần

- Dung dịch NaH2PO4 0,05 M : hoà tan 1,9502 g NaH2PO4 2H2O trong nước thành

250 ml

- Dung dịch NaH2PO4 0,05M : hoà tan 0,8962 g Na2HPO4 12H2O trong nước thành

50 ml

- Dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0: trộn chung 87,7 ml dung dịch Na2PO4

0,05 M, 12,3 ml dung dịch Na2HPO4 0,05 M và 100 ml nước cất

- Dung dịch tinh bột 1% : hoà tan 1 g tinh bột trong dung dịch đệm phosphate 0,05M,

pH 6,0 thành 100 ml

- Dung dịch tinh bột tiêu chuẩn 1% : hoà tan 1 g tinh bột trong nước cất thành 100

ml Từ dung dịch này, chuẩn bị các dung dịch có chứa 2, 4, 6, 8 và 10 mg tinh bột trong 1 ml Lập đồ thị tiêu chuẩn: lấy 0,1 ml dung dịch đã chuẩn bị như trên, thêm 0,1

ml dung dịch NaCl 0,1%, 0,2 ml dung dịch đệm phosphate, 0,1 ml nước cất và 0,5 ml dung dịch Sulfosalicylic acid 20%, lắc đều rồi thêm 9 ml dung dịch Iod đã pha loãng

450 lần So màu ở bước sóng 560 nm Vẽ đồ thị tiêu chuẩn, trên trục hoành ghi số đọc được của mẫu có tinh bột so với mẫu không có tinh bột

Cách tiến hành

- Cho vào ống nghiệm 1 ml dung dịch tinh bột 1%, 1 ml dung dịch NaCl 0,1% và 2

ml dung dịch đệm phosphate 0,05M, pH 6,0

- Lắc đều, để ở 300C trong 15 – 20 phút để dung dịch đạt đến 300C

- Thêm vào hỗn hợp 1 ml dung dịch enzyme đã đạt đến 300C

- Lắc đều và tiếp tục giữ ở 300C trong 30 phút Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ ấm cho ngay vào 5 ml dung dịch solfosalicylic acid 20% để làm ngừng phản ứng

- Song song với mẫu thí nghiệm, làm mẫu kiểm tra cũng tương tự như trên nhưng cho dung dịch solfosalicylic acid trước sau đó cho enzyme vào sau

- Lấy 1 ml của mẫu thí nghiệm cũng như của mẫu kiểm tra cho vào ống nghiệm, thêm vào 9 ml dung dịch Iod đã pha loãng 450 lần Lắc đều rồi so màu ở bước sóng

560 nm Lấy hiệu số đọc được trên máy giữa mẫu kiểm tra và thí nghiệm, đối chiếu với đường cong tiêu chuẩn, tính số mg tinh bột đã bị phân giải

Hđa = số mg tinh bột bị phân giải * Độ pha loãng (UI/ml)

3.3.4.8 Phương pháp xác định hoạt độ chitinase

Nguyên tắc

Hoạt tính chitinase được xác định dựa trên phương pháp định lượng glucosamine (phương pháp Elson-Morgan) của quá trình phân giải chitin dựa trên sự hình thành dẫn xuất pyrol khi glucosamine được đun nóng trong thuốc thử acetyl aceton Những pyrol này cho phản ứng màu với thuốc thử Erlich

- Lắc đều, đun cách thủy ở 100oC, 1 giờ

- Làm lạnh ống nghiệm dưới dòng nước

- Thêm 1 ml thuốc thử Erlich, lắc đều, đun cách thủy ở 70oC, 20 phút

- Để ống nguội tự nhiên, đo mật độ quang ở 512nm

- Dựng đường chuẩn biểu diễn tương quan giữa nồng độ glucosamine và ∆OD

Xác định hoạt tính chung chitinase:

- Thử thật: hỗn hợp phản ứng gồm 2 ml chitin huyền phù 1% và 2 ml dịch enzyme, đặt ở 30oC trong 20 phút, phản ứng được ngừng bằng cách đun sôi cách thủy 3 phút

- Thử không: trong điều kiện đun sôi cách thủy cho lần lượt 2 ml dịch chitin huyền phù và 2 ml dịch enzyme Sau 3 phút lấy ra

- Lọc mẫu, thu dịch sau phản ứng

Thiết lập phản ứng định lượng glucosamine như trên, thay 1 ml dịch glucosamine chuẩn bởi dịch lọc, suy ra hàm lượng glucosamine của dịch lọc

V n a

(UI/ml) Trong đó:

a: nồng độ glucosamine (μg/ml) trong dịch thí nghiệm đã pha loãng

n: hệ số pha loãng (1 lần)

V: thể tích dịch phản ứng (4 ml)

v: thể tích dịch enzyme thí nghiệm (2 ml)

t: thời gian phản ứng (20 phút)

3.3.5 Phương pháp thử tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định

- Tăng sinh Streptomyces trong môi trường HT khoảng 5 ngày

- Tăng sinh vi khuẩn, nấm khoảng 3 ngày

- Trải vi khuẩn lên môi trường peptone – cao thịt và nấm lên môi trường PGA

- Đặt giấy lọc tròn đường kính 5mm thấm dịch tăng sinh Streptomyces lên đĩa

- Để ở nhiệt độ phòng 1 – 2 ngày

- Quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩn

3.3.6 Phương pháp phòng ẩm

3.3.6.1 Mục đích

Streptomyces sinh trưởng và phát triển đầy đủ, có thể quan sát rõ hình thái

khuẩn ty, cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử