CHIẾT XUẤT hợp CHẤT SAPONIN

40-Tuy nhiên, cần lưu ý một số trường hợp của các saponin acid trong phân tử có chứa nhóm carboxyl, dưới tác dụng của cồn sẽ chuyển thành dẫn xuất alkyl ester... Loại các tạp chấtTrong d

CHIẾT XUẤT HỢP CHẤT SAPONIN

KHÁI NIỆM

Saponin là một nhóm hợp chất tự nhiên thường gặp trong

thực vật Chữ “sapo” có nghĩa là xà phòng Người ta biết

khoảng 500 loài thuộc 80 họ thực vật có saponin Một loài động vật cũng có saponin như : hải sâm, cá sao

Saponin có những tính chất đặc trưng sau:

- Tạo bọt nhiều và bền khi lắc với nước vì có hoạt tính bề mặt cao.

- Làm vỡ hồng cầu ngay trong nồng độ rất loãng.

- Saponin có thể làm chết cá (hoặc một số động vật máu lạnh khác) ở nồng độ rất thấp

- Saponin còn có tính tạo phức với cholesterol hoặc một số chất 3-b-hydroxy steroid khác

- Saponin có vị đắng, khó chịu, thường ở dạng vô định hình, rất khó tinh chế

- Saponin tan trong nước, cồn loãng, khó tan trong cồn cao độ, rất ít tan trong aceton, không tan trong ether

và hexan

- Các saponin đều là chất quang hoạt, phần lớn các sapogenin steroid là tả truyền, saponin trierpenoid là hữu truyền

- Điểm chảy của các saponin thường cao hơn 200oC

- Saponin có thể được tủa bởi chì actat, barium hydroxyd, amonium sulfat

- Saponin có loại acid, trung tính và kiềm

PHÂN LOẠI

Trước đây, KOBERT chia saponin làm 2 loại:

- Saponin trung tính thì tủa bởi Barium hydroxid và chì acetat,

- Saponin acid thì tan được trong kiềm, bị tủa bởi chì acetat trung tính và amonium sulfat.

Xu hướng hiện nay, người ta chia làm 2 loại dựa theo cấu trúc hóa học:

- Saponin triterpenoid.

- Saponin steroid

Saponin triterpenoid

Phần genin loại này có 30 carbon, gồm saponin triterpenoid

pentacyclic và saponin triterpenoid tetracyclic.

* Saponin triterpenoid pentacyclic : loại này được chia làm các

nhóm olean, ursan, lupan, hopan.

- Nhóm olean: Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự

nhiên đều thuộc nhóm này Phần aglycon thường có 5 vòng

và thường là dẫn xuất của 3-b-hydroxy olean 12-ene, tức là

β -amyrin

12

13 14 15

16

17 18

- Nhóm ursan: Cấu trúc tương tự như nhóm olean Chỉ khác là

nhóm methyl ở vị trí C-30 không gắn vào vị trí C-20 mà vào vị trí C-19

Các sapogenin của nhóm ursan thường là những dẫn chất của hydroxy ursan-12-ene tức a-amyrin Những saponin của nhóm này thường ít gặp hơn nhóm olean

3-b-Ursan α-amyrin

HO

- Nhóm lupan: Cấu trúc nhóm lupan có các vòng A, B, C, D giống

như các nhóm trên, chỉ khác vòng E có 5 cạnh, C-20 ngoài vòng

- Nhóm hopan: Cấu trúc nhóm hopan có các vòng A, B, C, D giống

như các nhóm trên, chỉ khác vòng E có 5 cạnh, C-22 ngoài vòng và nhóm methyl gắn ở C-18 thay vì C-17

11

12 13 14 15

16

17 18

19

20

21 22

11

12 13 14

15 16

17 18

19

21 22

23 24

25 26

27

20 28

•Saponin triterpenoid tetracyclic

-Nhóm dammaran: Đại diện là các saponin của nhân sâm Phần

aglycon gồm 4 vòng và một mạch nhánh Phần đường nối vào –

OH ở C-3 hoặc nối vào nhóm –OH ở mạch nhánh

-Nhóm lanostan: Đại diện là các saponin của loài hải sâm Các

saponin của động vật này có tác dụng phá huyết rất mạnh, mạnh hơn các saponin có nguồn gốc thực vật.

- Nhóm cucurbitan: Phần lớn các saponin nhóm cucurbitan gặp

trong họ Cucurbitaceae (họ Bầu bí) Ở đây nhóm CH3 ở vị trí

C-10 sẽ gắn vào vị trí C-9.

11 12 13

14

15

16 17

18 19

11

12 13 14

15

16 17 18

28 29

30

Saponin steroid

Phần genin của saponin steroid có 27C, là dẫn chất của khung

cholestan Gồm có 3 nhóm: spirostan, furostan và nhóm saponin steroid alcaloid

11

12 13 14

15 16 17 18

O

Diosgenin Hecogenin

Hai sapogenin quan trọng là

- Diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea)

- Hecogenin (có chủ yếu trong các loài Agave)

vat-va.html

http://www.duoclieu.org/2012/01/cay-dua-my-agave-ac-iem-thuc-Tên phổ thông: Dứa Mỹ, Dứa Nam Mỹ, Agao Mỹ.

Tên khoa học: Agave americana, Agave altissima, Agave

spectabilin

Họ thực vật: Agavaceae (Thùa)

Chi Củ nâu (danh pháp khoa học: Dioscorea) là chi thực vật gồm

trên 600 loài thực vật có hoa thuộc họ Củ nâu, bản địa của các vùng nhiệt đới và vùng có khí hậu ấm

- Nhóm furostan:Nhóm này có cấu trúc tương tự nhóm

spirostan, chỉ khác là vòng F bị biến đổi, thường là sự mở vòng

- Nhóm saponin steroid alcaloid: là những hợp chất vừa có

tính alcaloid vừa có tính saponin gồm có nhóm spirosolan và nhóm solanidan.

-Nhóm spirosolan: Chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy ở

vòng F được thay bằng NH Một điểm cần chú ý nữa là ở đây có isomer ở C-22, thí dụ như cấu trúc của solasodin có trong cây cà

Úc (Solanum laciniatum) và tomatodin là các saponin có trong

H

- Nhóm solanidan: Đại diện cho nhóm này là solanidin được ly

trích từ khoai tây dưới dạng glycosid là solanin Solanidin có nhân steroid giống như tất cả các chất trong các nhóm trên nhưng phần mạch nhánh có biến đổi Hai vòng E và F có chung một carbon và N

Solanidin

N

HO

MỘT VÀI DƯỢC LiỆU CHỨA SAPONIN

Cam thảo đất

Tên khác: Thổ Cam thảo, Dã cam thảo.

Tên khoa học: Scoparia dulcis L.

Họ khoa học: Scrophulariaceae.

Cam thảo dây (tên khoa học: Abrus precatorius L.) tác dụng dùng chữa ho, giải cảm, trị hoàng đản do viêm gan siêu vi trùng, tiêu viêm, lợi tiểu….

Rau đắng đất (có tên khoa học: Herba Glini oppositifolii) có tác dụng kích thích tiêu hóa, khai vị, kháng sinh, lợi tiểu, nhuận gan và

hạ nhiệt

Cây Ngũ gia bì chân chim hay còn gọi là Chân chim, Sâm nam, cây

Chân vịt, tên khoa học Schefflera octophylla Lour, họ

ARALIACEAE Trong Đông y dùng Vỏ cây phơi hoặc sấy khô là vị thuốc trong Đông y dùng chữa tê thấp, đau nhức xương, có tác dụng trừ muỗi

Saponin có trong cây Ngũ gia bì chân chim

cây Tam thất, còn được gọi là Nhân sâm Tam thất hay Kim bất hoán, có một vị trí quan trọng trong nền

y học cổ truyền nước ta với bổ, tăng lực, tăng sức

đề kháng, cầm máu, chống băng huyết ở phụ nữ mới sinh Cây Tam thất được ghi vào Dược điển

Việt Nam năm 1977 với tên khoa học Panax

pseudoginseng Wall., họ Araliaceae.

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SAPONIN

Saponin có tính phân cực mạnh, dễ hút ẩm, thường tồn tại

Tuy nhiên một số trường hợp trong sản xuất, người

ta lại ủ nguyên liệu để enzym có sẵn trong cây hoạt động để tăng hoạt chất mong nuốn

Ví dụ để chiết xuất diosgenin, Blunden và Hardman dùng phương pháp ủ để tăng saponin steroid

có trong củ tươi Dioscorea belizensis lên từ 5-10%

Hardman và Brain cũng đã dùng phương pháp ủ củ

Dioscorea deltoidea và hạt của Trigonella foenunggraecum để làm tăng hiệu suất của saponin lên.

PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SAPONIN

Trong một loài thực vật, saponin thường tồn tại một hỗn hợp gồm nhiều chất khác nhau

Rất nhiều trường hợp các saponin này chỉ khác nhau do cấu trúc mạch đường, do đó việc tách chiết các saponin riêng biệt rất khó

Phương pháp chủ yếu để tách riêng các saponin là sắc ký cột với pha tĩnh là silicagel, celluloze, polyamid Người ta cũng thường dùng phương pháp sắc ký gel (gel chromatography).

Chiết xuất saponin triterpen

1 Loại mỡ

Nguyên liệu trước khi chiết cần được loại mỡ bằng một

số dung môi hữu cơ: ether dầu hỏa, benzen, ether etylic…

Quá trình loại mỡ có thể được tiến hành theo phương pháp sau đây:

Loại mỡ trước khi chiết:

Bột nguyên liệu được loại mỡ bằng cách đun hoàn lưu hay chiết soxhlet với dung môi loại mỡ

Loại mỡ sau khi chiết:

Để tránh sử dụng một lượng lớn dung môi hữu cơ, người ta có thể loại mỡ sau khi chiết bằng cách lắc với dung môi loại mỡ

Lọai mỡ bằng phương pháp đông lạnh:

Trong một số trường hợp chiết xuất lớn và dịch chiết nhiều mỡ, có thể dùng phương pháp đông lạnh rồi hớt lớp mỡ đóng váng trên bề mặt

Chiết xuất saponin triterpen

Ngoài ra trong môi trường nước sẽ có một số saponin phân hủy do men

(ví dụ như saponin của Hedera helix, Gypsophyla

paniculata )

Dung môi thường dùng để chiết saponin là cồn 90% Hầu hết các saponin đều tan tốt trong cồn và trong môi trường này khống chế được sự hoạt động của các men

40-Tuy nhiên, cần lưu ý một số trường hợp của các saponin acid trong phân tử có chứa nhóm carboxyl, dưới tác dụng của cồn sẽ chuyển thành dẫn xuất alkyl ester.

2 Chiết xuất

3 Loại các tạp chất

Trong dịch chiết thu được, ngoài saponin còn lẫn nhiều tạp chất

đi kèm, do đó phải từng bước loại dần các tạp chất để thu được một

hỗn hợp thành phần saponin tương dối cao gọi là “hỗn hợp saponin

Loại các hợp chất ít phân cực:

Để loại các tạp chất kém phân cực như các chất màu, các hợp chất phenolic ta lắc dịch chiết với dung môi hữu cơ sau: choroform, ether, ethyl acetat

Loại các chất phân cực mạnh:

Dịch chiết sau khi loại tạp ít phân cực sẽ được thu hồi dung môi, sau đó lắc với n-buthanol Lớp n-buthanol sẽ chứa một lượng lớn saponin, còn lớp nước chủ yếu chứa các tạp chất phân cực mạnh như đường tự do, muối vô cơ…

4 Tủa hợp chất saponin thô

Tùy theo dung môi chiết và tùy thuộc vào bản chất của saponin để chọn chất kết tủa thích hợp:

Nước Chì acetat trung tính Saponin acid

Nước Chì acetat baz Saponin trung tính

EtOH, MeOH Aceton

EtOH, MeOH Ether

EtOH 50-90% Metyletyl ceton

EtOH 90-96% Cholesterol Saponin steroid

Sơ đồ tổng quát chiết xuất saponin triterpen

Lắc với CHCl 3

Thu hồi đến cắn +H 2 O, lắc với n-buthanol

Thu hồi chân không Hòa tan cắn với MeOH Tủa bằng ester

Dịch chiết

Dịch chiết đã loại chlorophyl

Dịch CHCl 3 (chứa các

hợpchất phân cực yếu)

Dịch chiết đã loại hợp chất hữu cơ phân cực yếu

Sơ đồ chiết xuất saponin triterpen từ cây

Ngũ gai bì chân chim (Schefflera

Cắn Dịch nước

Dịch chiết đã loại tạp

Dịch buthanol

n-Cắn

Dịch MeOH

Hỗn hợp saponin thô Dịch nước

H 2 O Lắc với n-BuOH

Sơ đồ chiết saponin triterpen từ

Ngưu tất (Achyranthes bidentata

Dịch chiết MeOH Cao toàn phần

Dịch pha n-BuOH Dịch nước

Đường và các hợp chất tự do khác Cắn

Tủa Dịch

Hỗn hợp

Saponin thô Sterol

Bã

Ngưu tất, Achyranthes bidentata L., thuộc họ Dền

(Amaranthaceae), là một trong những dược liệu kinh điển của y học cổ truyền Trung Hoa có tác dụng bổ, mạnh gân cốt, trị đau nhức, phong thấp.Cây này đã được di thực vào nước ta và trồng trọt thành công

Ngoài Ngưu Tất chính danh (Ngưu Tất Bắc), y học dân gian nước ta còn sử dụng khá phổ biến cây Ngưu Tất Nam, tên thông dụng là Cỏ xước,

Ahyranthes aspera L., với cùng công dụng như

Ngưu Tất.

Chiết xuất saponin steroid

Quá trình chiết các saponin steroid cũng tương tự như các saponin triterpen gồm có các bước cơ bản: loại chất béo, chiết bằng dung môi phân cực, loại tạp…

Tuy nhiên, các hợp chất saponin steroid thường được ứng dụng nhiều trong công nghiệp bán tổng hợp chất corticoid dưới dạng sapogenin (Ví dụ như: diosgenin, hecogenin, tigogenin ) vì thế trong quá trình chiết xuất người ta kết hợp thêm giai đoạn thủy phân để thu nhận các sapogenin cần thiết

Chiết dưới dạng sapogenin

Bột nguyên liệu sau khi loại

mỡ được chiết bằng dung môi phân

cực (EtOH, MeOH) Cắn thu được

sau khi thu hồi dịch chiết được tinh

chế tiếp để thu nhận saponin tinh

khiết hoặc thủy phân bằng acid để

thu nhận sapogenin.

Bột dược liệu

DL đã loại beo

Dịch chiết Cắn

Loại beo

Phơi khô Chiết bằng cồn

Thu hồi dung môi

Thủy phân acid Tinh chế

Lọc

Chiết xuất saponin steroid

Quá trình chiết các saponin steroid cũng tương tự như các saponin triterpen gồm có các bước cơ bản: loại chất béo, chiết bằng dung môi phân cực, loại tạp…

Chiết dưới dạng sapogenin

Làm khô Chiết bằng dung môi hữu cơ

Thu hồi dung môi

Thủy phân bằng acid (HCl, H 2 SO 4 ) Lọc, ép bã

Sapogenin

Làm giàu saponin trong nguyên liệu thực vật

Nhằm mục đích nâng cao hiệu suất trong việc chiết xuất diosgenin, một số tác giả đã nghiên cứu phương pháp làm giàu diosgenin từ nguyên liệu thực vật trước khi đem chiết xuất

Nhóm nghiên cứu của Harmam đã nhận xét rằng, hàm lượng saponin tăng lên đáng kể khi cho lên men nguyên liệu trước khi chiết Nhóm này cũng tiến hành những thí nghiệm, nằm nâng cao hiệu suất chiết sapogenin bằng cách cho vào môi trường ủ men những chất kích thích tố thực vật hoặc những chất thúc đẩy quá trình sinh tổng hợp steroid

Sơ đồ chiết diosgenin từ Dioscorea floribunda

Thu hồi dung môi

Ủ với dung dịch (100ml H 2 O + 1ml squalen)

ở 36 o C/24h +HCN 2N (hồi lưu 24h)

Kết tinh bằng n-hexan Bột dược liệu

S.N: Dioscorea floribunda Family: Dioscoriaceae

Sơ đồ chiết Diosgenin từ các nguồn nguyên liệu khác nhau

(Viện nguyên liệu Hà Nội)

Chiết bằng nước nóng

Thủy phân acid

Ủ men 38-40 o

Ủ men 38-40 o

Nước 6-10 lần

Chiết bằng DMHC

SKLM (TT Ehlich)

Sản phẩm giàu furostan Nguyên liệu

Nguyên liệu chứa khung spirostan

Nguyên liệu chứa khung furostan

Sản phẩm giàu spirostan

Bột dược liệu đã thủy phân

Diosgenin

Chiết xuất saponin steroid alcaloid (còn gọi là gluco-alcaloid)

Chiết bằng cồn, MeOH

Thu hồi dung môi

Hòa tan trong CH 3 COOH 5%

Kiềm hóa bằng NH 4 OH (pH=12) Lọc

Dịch chiết

Cắn

Dịch acid

Tủa glucoalcaloid Bột nguyên liệu

Ngấm kiệt

CH 3 COOH 5%, MeOH 80%

Sơ đồ chiết solasodin

từ quả S.Xanthocarpum Schard ed Wendl

Sơ đồ chiết solasodin từ Solanum laciniatum

Kiềm hóa bằng NH 4 OH 25% Lọc tủa

HCl 5% / isopropanol Hồi lưu 2h

Lọc, ép bã

Kiềm hóa bằng NaOH 20%

Chiết bằng Xylen

Kết tinh trong isopropanol

Tinh chế bằng than hoạt Lắc với CH 3 COOH/isopropanol/H 2 O

Bột nguyên liệu

Dịch acid (đường) Bã (solasodin chlohydrat)

Dịch xylen (solasodin baz)

Dịch xylen tạp Dịch acid (solasodin acetat)

Tủa solasodin kỹ thuật

Solasodin sạch

Solanum laciniatum

Solanum laciniatum The kangaroo apple (Solanum laciniatum) with violet blue …

Phương pháp tinh chế hợp chất saponin

Tủa saponin thu được bằng các phương pháp chiết xuất trên vẫn chưa tinh khiết, cần phải tiếp tục tinh chế Tùy theo tạp chất đi kèm trong các tủa thô để lựa chọn phương pháp tinh chế thích hợp

Một số phương pháp dùng để tinh chế saponin:

- Tinh chế bằng than hoạt:

Dung dịch cồn saponin được đun với than hoạt, sau đó lọc lấy dịch lọc

- Tinh chế bằng cột trao đổi ion:

Cho hỗn hợp saponin thô qua cột trao đổi ion sẽ loại được các tạp chất vô cơ

- Tinh chế bằng phương pháp tạo bọt:

Dùng một luồng khí trơ sục vào dung dịch nước của saponin thô Sau đó tách riêng lớp bọt bền trên bề mặt ra khỏi dung dịch, ở lớp bọt bền sẽ chứa một lượng lớn saponin

- Phương pháp dựa vào độ hòa tan:

Dựa vào độ hòa tan khác nhau giữa các saponin và tạp chất đi kèm để tách chúng ra khỏi nhau

- Phương pháp kết tủa:

Để tinh chế hỗn hợp saponin thô, người ta dùng phương pháp hòa tan saponin thô trong methanol, sau đó tủa với ether ethylic khan theo tỷ lệ 1 thể tích methanol và 10 thể tích ether Có thể lặp lại quá trình này vài lần để thu được saponin tinh khiết hơn

Phương pháp tinh chế hợp chất saponin

Phương pháp tạo phức với cholesterol:

Tủa saponin thô Dịch EtOH

Dịch pyridin

Cắn Dịch MeOH Tủa saponin

EtOH Dung dịch cholesterol/cồn

Pyridin Thu hồi dung môi MeOH

Ether

Để yên 1h ở nhiệt độ phòng Thu hồi dung môi

Để yên 39h /t o phòng +10ml nước đá lạnh Lọc

Rửa tủa bằng nước cho hết acid Kết tinh trong CHCl3-MeOH(1:1) Acethyl hóa

Phương pháp tạo dẫn xuất